Name: implantation and control of wireless, battery-free systems for peripheral nerve interfacing
Uploaded: 2021-10-20T15:00:00
Duration: 7 min 13 s
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Este trabajo utilizó las instalaciones NUFAB del Centro NUANCE de la Universidad Northwestern, que ha recibido apoyo del SHyNE Resource (NSF ECCS-1542205), el IIN y el programa MRSEC de Northwestern (NSF DMR-1720139). Este trabajo hizo uso de la instalación MatCI apoyada por el programa MRSEC de la National Science Foundation (DMR-1720139) en el Centro de Investigación de Materiales de la Universidad Northwestern. C.K.F agradece el apoyo del Instituto Eunice Kennedy Shriver de Salud Infantil y Desarrollo Humano de los NIH (subvención n.º R03HD101090) y de la Fundación Neuromuscular Americana (subvención para el desarrollo). Y.H. agradece el apoyo de NSF (subvención no. CMMI1635443). Este trabajo fue apoyado por el Instituto Querrey Simpson de Bioelectrónica de la Universidad Northwestern.

Todos los procedimientos descritos en este protocolo se llevan a cabo de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Northwestern. Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal del Centro de Medicina Comparativa de la Universidad Northwestern y la IACUC. Es necesario consultar con la IACUC a la hora de adaptar los protocolos.
1. Fabricación de estimuladores electrónicos inalámbricos (Figura 2)
<ol><li>Utilice cobre/poliimida/cobre (cobre superior e inferior de 18 μm de espesor, poliimida de 75 μm de espesor) como sustrato para la bobina del recolector de energía de radiofrecuencia (es decir, la antena del receptor inalámbrico).</li>
	<li>Utilice la ablación directa con láser para modelar los orificios de los electrodos en las capas de cobre superior e inferior y dar forma al dispositivo. Conecte eléctricamente las capas superior e inferior con pasta de plata a través de los orificios.</li>
	<li>Fije los componentes electrónicos con embalajes comerciales, como diodos y condensadores, mediante soldadura.</li>
	<li>Utilice el poliuretano covalente dinámico biorreabsorbible (b-DCPU; 200 μm de espesor) encapsulado (Mo; 15 μm de espesor; estructura serpentina) como electrodos de extensión estirables19.</li>
	<li>Formar el electrodo del manguito para la interfaz entre el dispositivo y el nervio utilizando una película de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) (300 μm de espesor).</li>
	<li>Después de conectar la antena receptora inalámbrica y el electrodo de extensión extensible, encapsule la antena receptora inalámbrica y la conexión con epoxi o polidimetisiloxano (PDMS) impermeable comercializado. Consulte la Figura 2 (derecha) para ver el dispositivo completamente ensamblado.</li>
	<li>Confirme el funcionamiento inalámbrico del dispositivo, utilizando un generador de forma de onda para generar impulsos eléctricos monofásicos a través de la bobina primaria (es decir, la bobina de transmisión). NOTA: Al examinar el reclutamiento de axones periféricos y la inducción de la regeneración axonal por estímulos monofásicos y bifásicos, estudios previos informaron de un efecto insignificante debido a las diferencias en la característica de la forma de onda20, y este grupo ha sido capaz de lograr una mejora de la estimulación eléctrica terapéutica con los mismos parámetros de corriente monofásica en ratones21 y ratas18. Además, estudios anteriores examinaron la biocompatibilidad in vivo e in vitro y no encontraron ninguna evidencia de daño tisular por los efectos del calentamiento o los materiales en sí. Debido a estos hallazgos y a la duración limitada de la estimulación eléctrica terapéutica en el presente estudio, en este protocolo se utilizaron estímulos monofásicos en lugar de bifásicos.</li>
	<li>Mida el voltaje de salida de corriente continua resultante con un osciloscopio conectado al electrodo del manguito.</li>
</ol>2. Preparación del dispositivo para la implantación
<ol><li>Coloque los dispositivos de implante en una placa de Petri estéril y séllela con parafilm.</li>
	<li>Irradie los dispositivos con luz ultravioleta durante 30 minutos por lado.</li>
</ol>3. Procedimiento quirúrgico de implantación del nervio ciático derecho de rata de una interfaz nerviosa periférica inalámbrica y sin batería para estimulación eléctrica (Figura 3)
NOTA: Mantenga las condiciones estériles. Realizar cirugías dentro del área quirúrgica designada de una sala de procedimientos con animales. El cirujano se pondrá una mascarilla, un abrigo, una gorra y guantes estériles durante la cirugía. Si se realiza más de una cirugía, cambie los guantes estériles entre animales y use instrumentos quirúrgicos limpios y estériles para cada cirugía. Esterilice las herramientas entre cirugías mediante esterilización por calor (esterilizador en autoclave o con perlas de vidrio). Utilice ratas Sprague-Dawley adultas que pesen entre 200 y 250 g.
<ol><li>Inducir la anestesia con gas isoflurano (3% de inducción, 1-3% de mantenimiento) en oxígeno (2 L/min), con administración subcutánea de meloxicam (1-2 mg/kg). Cubra los ojos de las ratas con un ungüento oftálmico designado para evitar que se sequen.</li>
	<li>Coloque a las ratas en posición prona sobre mesas quirúrgicas desinfectadas para procedimientos posteriores. Durante el resto de la duración de la cirugía, evalúe la frecuencia respiratoria (debe ser de ~2/s), el color del tejido y la profundidad de la anestesia no menos de cada 15 minutos, y mantenga los niveles de isoflurano en consecuencia. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia comprobando el reflejo pedal (falta de respuesta a un pellizco firme en el dedo del pie). Controle las membranas mucosas, que deben permanecer rosadas y húmedas.</li>
	<li>Afeita el área quirúrgica, incluyendo la pierna derecha y la mitad inferior de la espalda. Frote el área quirúrgica afeitada con una almohadilla betadine, seguida de un hisopo de etanol médico al 70%, y repita este proceso de exfoliación tres veces para desinfectar la piel.</li>
	<li>Realice una incisión de 1,5 a 2 cm en la piel paralela al hueso del fémur derecho con unas tijeras de tejido, seguida de una separación roma del tejido conectivo subcutáneo en la espalda (directamente medial a la incisión) para despejar una bolsa subcutánea para la bobina receptora (Figura 4A). Realizar una incisión posterior (1,2-1,5 cm) en el músculo glúteo derecho paralelo a la incisión cutánea.</li>
	<li>Aísle suavemente el nervio ciático con sondas de disección metálicas con extremos romos (Figura 4B). NOTA: El nervio ciático se encuentra en lo profundo del bíceps femoral y corre paralelo al fémur. Se sugiere un alcance de disección.</li>
	<li>Implantar el dispositivo inalámbrico y sin pilas sobre el nervio ciático (Figura 4C) envolviendo el manguito alrededor del nervio ciático derecho aislado, sin poner el nervio bajo tensión ni distorsionar su trayectoria 18,19,20. Marque en la piel donde se coloca la bobina receptora para una mayor estimulación eléctrica.</li>
	<li>Suturar la incisión del músculo glúteo con suturas reabsorbibles (Figura 4D). NOTA: La mitad superior de la bobina receptora se encuentra por encima del músculo glúteo y la interfaz del manguito por debajo.</li>
	<li>Cierre la incisión en la piel con pinzas para heridas (o sutura enterrada; Figura 4E). Haz coincidir los bordes de la piel.</li>
	<li>Administrar 1 h de estimulación eléctrica postquirúrgica continua de 20 Hz con un ancho de pulso de 200 μs bajo anestesia (Figura 4F). Regrese a los animales a sus jaulas domésticas después de que se hayan recuperado completamente de la anestesia. NOTA: El protocolo detallado se describe a continuación. La bobina receptora se muestra por encima de la piel en la Figura 4F.</li>
	<li>Tratamiento postquirúrgico<ol><li>Coloque a la rata en una jaula de recuperación sin ropa de cama, forrada con toallas de papel, con la mitad de la jaula colocada sobre una fuente de calor adecuada con temperatura regulada (almohadilla térmica aprobada).</li>
		<li>Vigila a la rata cuidadosamente hasta que sea ambulatoria. Una vez ambulatoria y evaluada como estable, devuelva la rata a la jaula de la casa y observe la reintegración social.</li>
		<li>Después de la recuperación aguda, monitoree a las ratas para detectar la infección en el sitio de la incisión y los síntomas de dolor neurogénico, incluidos, entre otros, protegerse, retorcerse, rascarse y automutilarse. Monitoree las ratas diariamente durante el período de recuperación posquirúrgica de 5 días, y al menos una vez cada tres días después de eso si las ratas no se sacrifican en el día 5.</li>
		<li>Administrar meloxicam (1-2 mg/kg) por vía subcutánea una vez al día durante dos o tres días después de la cirugía, dependiendo del nivel de dolor/malestar mostrado por el animal. Si se sospecha un dolor persistente, se debe continuar con el meloxicam más allá de este período postoperatorio y, si resulta refractario, sacrificar a la rata de forma temprana en consulta con el equipo veterinario.</li>
		<li>Retire las suturas de piel o los clips de la herida 10-12 días después de la cirugía.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Procedimiento quirúrgico de implantación del nervio frénico izquierdo de rata de estimuladores inalámbricos (Figura 5A)
NOTA: Mantener condiciones estériles, como en la sección 3. Utilice ratas Sprague-Dawley adultas que pesen entre 200 y 250 g. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos antes de usarlos.
<ol><li>Inducir la anestesia con gas isoflurano (3% de inducción, 1-3% de mantenimiento) en oxígeno (2 L/min), con administración subcutánea de meloxicam (1-2 mg/kg). Cubra los ojos de la rata con un ungüento oftálmico designado para evitar la desecación.</li>
	<li>Coloque a las ratas en posición supina sobre mesas quirúrgicas desinfectadas para procedimientos posteriores. Durante el resto de la duración quirúrgica, evalúe la frecuencia respiratoria, el color del tejido y la profundidad de la anestesia no menos de cada 15 minutos, y mantenga los niveles de isoflurano en consecuencia. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia comprobando el reflejo pedal (falta de respuesta a un pellizco firme en el dedo del pie). Controle las membranas mucosas, que deben permanecer rosadas y húmedas.</li>
	<li>Afeitar el área quirúrgica en la cara ventral del cuello. Frote el área quirúrgica afeitada con una almohadilla betadine, seguida de un hisopo de etanol médico al 70%, y repita este proceso de exfoliación tres veces para desinfectar la piel.</li>
	<li>Administrar bupivacaína (2 mg/kg, diluida en solución salina que no exceda el volumen total de 0,5 ml) por vía subcutánea en la línea media del cuello, dirigiéndose a la capa más superficial. Realizar una incisión de 3 cm en la línea media a través de la piel y la fascia cervical superficial para exponer los músculos esternohioideo y esternocleidomastoideo (Figura 5B). NOTA: Se sugiere un endoscopio de disección.</li>
	<li>Elevar el esternocleidomastoideo mediante una disección roma suave con una sonda y retraerlo lateralmente con un asa vascular (Figura 5C). Libere y retraiga suavemente el omohioideo. A continuación, libere suavemente y retraiga medialmente el nervio vago y el haz carotídeo debajo del músculo omohioideo. NOTA: La principal discriminación aquí es entre el nervio vago y el nervio frénico. Corte el omohyoid si es necesario exponer las estructuras inferiores.</li>
	<li>Aísle el nervio frénico (Figura 5D). NOTA: El nervio frénico corre a lo largo de la superficie del músculo escaleno anterior, corriendo como un nervio longitudinal notablemente pequeño que cruza perpendicularmente al plexo braquial. A diferencia del nervio ciático, la anatomía alrededor del nervio frénico en el cuello es más compleja. Realice la confirmación electrofisiológica (paso 4.7) antes de la implantación para obtener los mejores resultados.</li>
	<li>Colocar el electrodo de registro por vía subcutánea, solo caudalmente a la caja torácica, ipsilateral al nervio frénico aislado (Figura 5E). Coloque los estimuladores en el nervio frénico y confirme a través de la señalización síncrona (Figura 6). NOTA: Es típico evocar una respuesta máxima con una intensidad de estímulo de ~3-6 mA y una duración de estímulo de 0,02 ms.</li>
	<li>Verificar la transección completa del nervio frénico mostrando la abolición completa de la respuesta evocada cuando se aplica un estímulo eléctrico en el extremo del nervio proximal en relación con el sitio de la transección (Figura 6).</li>
	<li>Implante un dispositivo inalámbrico sin batería en el nervio frénico (Figura 5F) colocando la bobina receptora del dispositivo implantable en el esternohioideo, profundo en relación con los músculos esternocleidomastoideos bilaterales, con el manguito alrededor del nervio frénico y los electrodos de contacto colocados perpendicularmente al nervio.</li>
	<li>Cierre la fascia cervical superficial con suturas reabsorbibles simples (Figura 5G). Cerrar la piel con suturas reabsorbibles invertidas interrumpidas en la dermis profunda. Regrese a los animales a sus jaulas domésticas solo después de que se hayan recuperado completamente de la anestesia.</li>
	<li>Para el tratamiento posquirúrgico, siga el paso 3.10.</li>
</ol>5. Entrega inalámbrica de estimulación eléctrica terapéutica
<ol><li>Aplicar estimulación eléctrica durante 1 h a las ratas bajo anestesia general. Para la estimulación inalámbrica, coloque un generador de forma de onda/función (voltaje: 1-15 Vpp) y un amplificador opcional sobre el animal para proporcionar energía eléctrica a una bobina inductiva externa (es decir, bobina de transmisión) (bobina en espiral bidimensional con 5 vueltas; diámetro: 2 cm) para garantizar un buen acoplamiento inductivo con la bobina receptora implantada. Suministre pulsos monofásicos de 200 μs a 20 Hz durante 1 h de duración.</li>
	<li>Para verificar y cuantificar la administración de estimulación eléctrica, registre los CMAP del músculo tibial anterior, ajustando el voltaje de estimulación para administrar la activación supramáxima del nervio ciático. Utilice electrodos de aguja concéntricos para todas las grabaciones. NOTA: Si el voltaje máximo generado por la función es insuficiente para evocar una respuesta máxima, utilice un amplificador.</li>
</ol>6. Eutanasia
<ol><li>Método primario<ol><li>Coloque la jaula debajo de una cámara de suministro deCO2 , ajustada a una tasa de 8-12 LPM (o un caudal apropiado según el tamaño de la cámara). Vigile a las ratas para ver si están inconscientes y luego durante al menos 1 minuto de cese de la respiración.</li>
	</ol></li>
	<li>Método secundario<ol><li>Realizar luxación cervical o toracotomía bilateral.</li>
	</ol></li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Este artículo describe los pasos en la implantación quirúrgica y el funcionamiento de una interfaz nerviosa periférica inalámbrica, sin batería y totalmente implantable en el modelo de nervio ciático y frénico de rata. Demostramos cómo se puede utilizar esta nueva clase de implantes biomédicos para administrar un paradigma de estimulación eléctrica terapéutica que ha demostrado mejorar la regeneración de axones en estudios preclínicos y clínicos (para una revisión, ver22). Este protocolo no es complicado y se puede extrapolar a modelos animales más pequeños, como ratones21, así como a otros dispositivos inalámbricos, sin batería y totalmente implantables con funcionalidad que incluye interfaces de nervios periféricos optoelectrónicos y microfluídicos 18,23,24,25,26,27,28,29,30 . También se ha demostrado el abordaje con el nervio ciático de roedores, que es el modelo experimental más común31.
La versatilidad de este abordaje se ha demostrado cuando se adapta a la interfaz con el nervio frénico, que rara vez se emplea como modelo de lesión del nervio periférico32, tal vez porque es un problema clínico muy poco reconocido 33,34,35. El diagnóstico y la rehabilitación de las lesiones del nervio frénico se han convertido en un tema importante durante la pandemia de COVID-19 36,37,38. Actualmente se desconoce si la regeneración de los axones frénicos y la recuperación de la parálisis del diafragma pueden aumentarse con este breve paradigma de estimulación eléctrica de baja frecuencia. Sin embargo, la estimulación eléctrica del nervio frénico para la estimulación del músculo diafragma es una opción establecida para la insuficiencia respiratoria en pacientes con tetraplejia por lesión medular cervical alta 39,40,41,42,43. Se están explorando otras indicaciones, como el desconexión del ventilador después de una enfermedad crítica44.
Se deben enfatizar varios pasos críticos para garantizar el buen funcionamiento del sistema implantado. En primer lugar, es importante evitar aplicar demasiada fuerza sobre los componentes electrónicos delgados de los dispositivos al manipularlos para evitar que el plomo se desaísle, se retuerza o se rompa. A continuación, es importante marcar con precisión la ubicación de la bobina del recolector de energía de radiofrecuencia en la piel suprayacente. En tercer lugar, la alineación cuidadosa de la bobina de transmisión de la fuente de alimentación de radiofrecuencia externa sobre la bobina de recolección de energía del dispositivo implantado con una abrazadera de cuello de cisne permite un funcionamiento estable. Por último, para confirmar la estimulación eléctrica además de la observación visual de los espasmos musculares, se recomienda una monitorización neurofisiológica periódica. En el caso de la anatomía más compleja del nervio frénico en el cuello, la confirmación electrofisiológica ayuda a demostrar que se ha aislado el nervio correcto (Figura 6).
Además de los estimuladores eléctricos inalámbricos y sin batería que se muestran en este documento 18,19,21, muchos otros dispositivos comparten potencialmente los mismos procedimientos. Por ejemplo, debido a que los electrodos diseñados para implantarse en los nervios glosofaríngeo y vago para registrar crónicamente las señales de los sistemas nerviosos simpático y parasimpático 30,45,46 comparten un área quirúrgica similar con el nervio frénico, este protocolo puede adaptarse para su implantación. Los estimuladores biocompatibles inalámbricos a largo plazo para los nervios periféricos, como ReStore, son excelentes herramientas para permanecer en su lugar y estimular los nervios según sea necesario 25,47,48,49,50. También se han reportado implantes de grabación inalámbrica multicanal relevantes51. En general, creemos que estos protocolos de estimulación quirúrgica y eléctrica se pueden adaptar como estándar para todas las interfaces inalámbricas de nervios periféricos relacionadas con la estimulación eléctrica o la grabación.

Las lesiones traumáticas de los nervios periféricos (PNI, por sus siglas en inglés) ocurren en los EE. UU. con una incidencia anual de aproximadamente 200,000 por año1. La mayoría de los pacientes que sufren PNI quedan con deficiencias funcionales permanentes. En el peor de los casos, esto puede provocar parálisis muscular y desencadenar un dolor neuropático refractario al tratamiento tan intenso que los pacientes están dispuestos a someterse a una amputación de extremidadescomo tratamiento. El mayor obstáculo para mejorar los resultados de la PNI es que la regeneración de los axones es demasiado lenta en relación con las distancias a las que deben volver a crecer. Por ejemplo, un axón humano adulto crece a 1 mm/día, pero puede tener que regenerarse a distancias >1000 mm en el caso de una lesión en una extremidad proximal.
En la práctica clínica actual, ~50% de los PNI requieren reparación quirúrgica3. Para una regeneración nerviosa exitosa, los axones deben (i) crecer a través del sitio de la lesión (es decir, cruzar la brecha) y luego (ii) regenerarse por la vía nerviosa para alcanzar un objetivo del órgano terminal (es decir, el recrecimiento distal) (Figura 1). No hay medicamentos aprobados por la FDA que hayan demostrado acelerar la regeneración nerviosa. El statu quo del manejo clínico de la PNI solo ha cambiado gradualmente en las últimas décadas y se limita a refinamientos técnicos de los métodos quirúrgicos, como las transferencias de nervios motores distales para reducir la distancia que deben recorrer los axones regeneradores4, o conductos nerviosos sintéticos "listos para usar" para los casos en que el nervio proximal se retrae y no se puede volver a suturar directamente5. Sin embargo, se han realizado cuatro ensayos clínicos aleatorizados sobre la estimulación eléctrica terapéutica aplicada a los nervios en el postoperatorio, que fueron estudios unicéntricos dirigidos por el Dr. K. Ming Chan de la Universidad de Alberta que muestran una mejora significativa de la reinervación del músculo 6,7,8 o de la piel9. El trabajo fundamental para este protocolo de estimulación eléctrica se realizó en roedores10,11, donde se ha demostrado que la estimulación eléctrica funciona específicamente potenciando el cruce de brechas (Figura 1) pero no el rebrote distal 12,13,14,15.
La colocación quirúrgica de electrodos de alambre transcutáneo utilizados en los cuatro ensayos clínicos aleatorizados de estimulación eléctrica fue necesaria porque sus efectos dependen de la entrega de corriente suficiente para despolarizar el cuerpo de la célula neuronal a 20 Hz de forma continua durante 1 h11. En la práctica clínica, este protocolo de estimulación eléctrica no es tolerable para la mayoría de los pacientes a las intensidades requeridas a través de electrodos estimulantes de superficie en la piel debido al dolor. Existen riesgos no triviales asociados con la colocación de electrodos transcutáneos en el postoperatorio, como la infección profunda de la herida o el desplazamiento accidental de los cables de los nervios durante el transporte del paciente desde el quirófano. Además, el alto costo del tiempo en el quirófano en sí mismo es un desincentivo para intentarlo en ese entorno en lugar de durante la recuperación postoperatoria aguda. Está surgiendo una nueva clase de interfaces de nervios periféricos inalámbricas, sin batería y totalmente implantables para abordar esta deficiencia de las interfaces de nervios periféricos existentes.
Esta nueva clase de sistemas electrónicos implantables inalámbricos está preparada para aumentar la facilidad y flexibilidad de la dosificación de la estimulación eléctrica y romper las barreras que impiden su implementación clínica más amplia. Este artículo describe métodos para (i) implantar quirúrgicamente y (ii) alimentar y controlar de forma inalámbrica este sistema en modelos adultos de nervio ciático y frénico de rata. Muestra cómo la interfaz nerviosa periférica puede evocar CMAP, administrar un protocolo de estimulación eléctrica terapéutica e incluso actuar como un conducto para la reparación de los nervios periféricos. Los protocolos aquí se pueden adaptar para otras variantes de esta tecnología que pueden administrar pulsos de luz para la neuromodulación mediada por optogenética16, la liberación controlada de fármacos17 o episodios repetidos de estimulación eléctrica a lo largo del tiempo18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation</td>
			<td>201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>RIGOL</td>
			<td>DG1032Z</td>
			<td>30 MHz, 2 Channel, 200 MS/s, 14bit Resolution, 8 Mpts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>655317</td>
			<td>Marcaine, 0.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper/polyimide/copper</td>
			<td>Pyralux</td>
			<td>AP8535R</td>
			<td>18 &#181;m thick top and bottom copper, 75 &#181;m thick polyimide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMG recording device</td>
			<td>Natus</td>
			<td>Nicolet VikingQuest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOXY MARINE</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Butler Schein Animal Health</td>
			<td>1040603</td>
			<td>ISOTHESIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>covetrus</td>
			<td></td>
			<td>5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle electrodes</td>
			<td>Technomed USA Inc.</td>
			<td>TE/B50600- 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (Silicone Elastomer Kit)</td>
			<td>DOW</td>
			<td>SYLGARD&#8482; 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoLaser U4</td>
			<td>LPKF</td>
			<td>U4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant</td>
			<td>Puralube</td>
			<td>83592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform generator</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Agilent 33250A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation and control of wireless, battery-free systems for peripheral nerve interfacing

Las interfaces nerviosas periféricas se utilizan con frecuencia en neurociencia experimental y medicina regenerativa para una amplia variedad de aplicaciones. Dichas interfaces pueden ser sensores, actuadores o ambos. Los métodos tradicionales de interfaz de nervios periféricos deben conectarse a un sistema externo o depender de la energía de la batería que limita el marco de tiempo para la operación. Con los recientes desarrollos de interfaces de nervios periféricos inalámbricas, sin batería y totalmente implantables, una nueva clase de dispositivos puede ofrecer capacidades que igualan o superan las de sus precursores cableados o alimentados por baterías. Este artículo describe métodos para (i) implantar quirúrgicamente y (ii) alimentar y controlar de forma inalámbrica este sistema en ratas adultas. Los modelos de nervio ciático y frénico fueron seleccionados como ejemplos para resaltar la versatilidad de este enfoque. El artículo muestra cómo la interfaz nerviosa periférica puede evocar potenciales de acción muscular compuestos (CMAP), administrar un protocolo de estimulación eléctrica terapéutica e incorporar un conducto para la reparación de lesiones nerviosas periféricas. Estos dispositivos ofrecen opciones de tratamiento ampliadas para la estimulación terapéutica de dosis única o dosis repetida y pueden adaptarse a una variedad de ubicaciones nerviosas.

En el modelo de lesión del nervio ciático, el implante se coloca alrededor del nervio ciático derecho antes de la reparación de extremo a extremo de la rama del nervio tibial (Figura 3, Figura 4A y Figura 7A). Se coloca un electrodo de aguja concéntrica de 30 G en el músculo tibial anterior derecho para definir los parámetros de estímulo necesarios para la estimulación eléctrica de máxima intensidad. Estos experimentos incluyen elevar la intensidad de la estimulación hasta que la magnitud de la respuesta se estabilice en el máximo. Como el tibial anterior está inervado por la rama fibular del nervio ciático, se salva en la lesión de la transección del nervio tibial. Por lo tanto, el registro del tibial anterior permite la monitorización continua del tratamiento de estimulación eléctrica.
Para un pulso de estímulo único administrado por un electrodo de alambre al nervio ciático derecho (5 mA, 0,02 ms), se obtiene una respuesta CMAP máxima con una amplitud máxima de pico negativa de 5,4 mV registrada en el tibial anterior ipsilateral (Figura 7B; traza negra). Para un pulso de estímulo comparable administrado por el implante inalámbrico y sin batería, se obtiene una respuesta CMAP comparable con una amplitud máxima negativa de 4,6 mV (Figura 7B; traza naranja). Esto es consistente con un informe reciente de que la estimulación nerviosa inalámbrica logra en promedio el 88% de la CMAP a partir de la estimulación nerviosa basada en alambre21, muy por encima del umbral requerido para los efectos terapéuticos en estudios clínicos 6,7,8,9. En el ejemplo mostrado, la mayor latencia del estimulador inalámbrico frente al estimulador con cable se debió a su mayor distancia del músculo registrado.
En el modelo del nervio frénico, el implante se coloca alrededor del nervio frénico derecho antes de la transección (Figura 5). Para definir los parámetros de estímulo necesarios para la estimulación eléctrica de máxima intensidad, se coloca un electrodo de aguja concéntrico de 30 G por vía subcutánea en el margen costal anterior derecho (ipsilateral) para registrar desde el hemidiafragma derecho. Los experimentos consisten en elevar el voltaje de estimulación hasta que la magnitud de la respuesta se estabilice en su máximo. Dado que el nervio frénico puede ser difícil de aislar de las estructuras neurovasculares circundantes, su identidad puede confirmarse evocando una respuesta de contracción (Figura 6; trazo naranja). La especificidad de la estimulación puede verificarse aún más mediante la transección del nervio frénico distal al manguito del electrodo nervioso con la consiguiente abolición de la respuesta de contracción (Figura 6; traza negra).
Se puede administrar una terapia de estimulación eléctrica repetitiva de baja frecuencia al nervio ciático durante 1 h utilizando un protocolo establecido que mejora la regeneración axonal (6,7,8,9,10,11; Figura 8). La interfaz del manguito del implante inalámbrico se colocó en el nervio ciático derecho, y el electrodo de aguja concéntrica de 30 G se colocó en el músculo tibial anterior derecho para monitorizar el tratamiento. La figura 8A muestra cuatro picos secuenciales en la electromiografía registrada al comienzo (0 min) de la estimulación eléctrica de 1 h 20 Hz. La Figura 8B muestra otros cuatro picos registrados a los 40 min de la estimulación eléctrica de 1 h con una ligera disminución en la amplitud máxima, lo que es consistente con el patrón de fatiga observado con la terapia de estimulación eléctrica basada en alambre15,21.
El grado de regeneración de los nervios periféricos se puede evaluar utilizando trazadores retrógrados aplicados distalmente al sitio de la lesión nerviosa. Debido a que los axones periféricos brotan múltiples brotes colaterales, el rastreo retrógrado y los recuentos del soma de la neurona motora en la médula espinal permiten una evaluación más precisa del número de neuronas en regeneración que el recuento de axones en regeneración dentro del propio nervio31. Para demostrarlo, el tronco del nervio ciático fue seccionado por una lesión por aplastamiento. Después de 3 semanas de recuperación, se administraron dos colorantes retrógrados fluorescentes diferentes en dos ramas del nervio ciático: nervio fibular (verde) y nervio tibial (rojo), respectivamente (Figura 9A). La Figura 9B-D muestra subgrupos iluminados de motoneuronas inferiores en el asta anterior de la médula espinal lumbar que forman el nervio tibial (Figura 9B) o el nervio peroné (Figura 9C). La imagen superpuesta muestra dos columnas distintas de neuronas marcadas en el asta anterior de la médula espinal, que se pueden cuantificar en términos de distribución espacial y recuento de neuronas motoras que han regenerado un axón distal al sitio de la lesión (Figura 9D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig01.jpg"> Figura 1: Modelo de regeneración nerviosa. (A) El cruce de brechas ocurre temprano después de la reparación del nervio, cuando los axones crecen desde el extremo nervioso proximal al distal después de la reparación. (B) La duración del recrecimiento distal está relacionada con la distancia al órgano terminal diana (por ejemplo, piel, músculo) y la tasa de recrecimiento de los axones. La mayoría de las terapias para mejorar la reparación nerviosa se dirigen a uno o ambos procesos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig02.jpg"> Figura 2: Ilustración de la fabricación de un estimulador electrónico inalámbrico. A la izquierda, capas detalladas de la estructura del dispositivo, incluida una bobina recolectora de energía de radiofrecuencia circular, un electrodo de extensión estirable y un manguito nervioso que envuelve un nervio de interés. A la derecha, una ilustración simplificada que muestra tres partes del dispositivo. Abreviaturas: PLGA = ácido poli(láctico-co-glicólico); b-DCPU = poliuretano covalente dinámico biorreabsorbible. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig03.jpg"> Figura 3: Implantación de una interfaz nerviosa inalámbrica y sin batería en el modelo de nervio ciático de rata. (A) La ilustración muestra un sistema totalmente implantable en el nervio ciático derecho de una rata. (B) El panel superior muestra una interfaz de electrodo colocada en el nervio ciático justo proximal a la reparación de extremo a extremo del nervio tibial derecho. El panel inferior muestra una interfaz de electrodo con un manguito nervioso extendido que cierra la reparación del espacio entre el extremo proximal y el muñón del nervio distal. Abreviatura: PLGA = ácido poli(láctico-co-glicólico). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig04.jpg"> Figura 4: Procedimiento de implantación del nervio ciático. (A) Incisión en la piel, el tejido conectivo subcutáneo y el músculo glúteo para exponer el tendón de la corva. (B) Nervio ciático aislado (flecha negra). (C) Dispositivo post-implantación con manguito nervioso, alambres (asterisco blanco) e implante visible (estrella). (D) Cierre del tejido conectivo por sutura. (E) Cierre de la incisión mediante clips para heridas. (F) Estimulación eléctrica inalámbrica generada por una bobina sobre la piel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig05.jpg"> Figura 5: Procedimiento de implantación del nervio frénico. (A) Vista ventral del cuello en decúbito supino. (B) Incisión en la piel y el tejido conectivo subcutáneo para exponer el músculo esternohioideo. (C) Disección a través del espacio potencial entre el músculo omohioideo y el músculo esternocleidomastoideo. (D) Nervio frénico (flecha), aislado del plexo braquial. (E) Confirmación electromiográfica diafragmática del nervio frénico. Flecha negra, electrodo registrador. Flecha roja, estimuladores. f) Implantación. (G) Cierre de la piel con puntos dérmicos profundos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig06.jpg"> Figura 6: Confirmación de la lesión completa de la transección del nervio frénico mediante potenciales de acción muscular compuestos evocados desde el diafragma. Antes de la transección del nervio frénico (ORANGE), la estimulación eléctrica del nervio frénico evocaba potenciales de acción muscular compuestos en el diafragma ipsilateral, que fueron abolidos por la transección del nervio frénico (BLACK). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig07.jpg"> Figura 7: Estudios representativos de conducción nerviosa que comparan la estimulación eléctrica inalámbrica con la basada en cables. (A) Ilustración de la colocación de dispositivos inalámbricos (NEGRO) y cableados (NARANJA) en el nervio ciático. El electrodo de registro se colocó en el tibial anterior. (B) Potenciales de acción muscular compuestos evocados por el implante con alambre (NARANJA) frente al implante inalámbrico (NEGRO). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig08.jpg"> Figura 8: Registro de EMG del músculo TA con estimulación eléctrica repetitiva de 20 Hz durante 1 h desde implantes. (A) Traza de EMG en el mínimo 1 de e-stim. (B) Traza de EMG en el mínimo 40 de e-stim. Abreviaturas: EMG = electromiografía; TA = tibial anterior; e-stim = estimulación eléctrica; min = minuto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig09.jpg"> Figura 9: Imágenes representativas de la regeneración del nervio ciático. (A) Ilustración de lesión del nervio ciático y marcaje retrógrado fluorescente. Los axones del nervio ciático fueron seccionados por lesión por aplastamiento. Después de 3 semanas de recuperación, sus ramas distales, el nervio fibular (en verde) y el nervio tibial (en rojo), fueron marcadas retrógradamente. (B-D) Imágenes de una médula espinal lumbar que muestra soma neuronal dentro del asta anterior ipsilesional. Barras de escala = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Implantation and Control of Wireless, Battery-free Systems for Peripheral Nerve Interfacing

Se trata de un protocolo para la implantación quirúrgica y el funcionamiento de una interfaz alimentada de forma inalámbrica para los nervios periféricos. Demostramos la utilidad de este enfoque con ejemplos de estimuladores nerviosos colocados en el nervio ciático o frénico de rata.

Implantación y control de sistemas inalámbricos sin batería para la interfaz de nervios periféricos

Peripheral nerve interfaces are frequently used in experimental neuroscience and regenerative medicine for a wide variety of applications. Such interfaces ...

La lesión de los nervios periféricos es bastante común. La estimulación eléctrica mostró efecto terapéutico sobre la regeneración nerviosa. Así que aquí mostramos un método generalizado sobre la implantación de la interfaz nerviosa y la utilización del dispositivo.Esta técnica evita que los cables atraviesen la piel, que pueden ser focos de infección. El estimulador implantado puede alimentarse de forma inalámbrica y ajustarse a las necesidades del tratamiento. Este dispositivo de estimulación eléctrica tiene un alto potencial terapéutico para mejorar la regeneración de los nervios periféricos después de una lesión o enfermedad, ayudando a restaurar la función perdida que, de otro modo, podría permanecer deteriorada.Aislar el nervio y lograr un buen contacto con el manguito requiere delicadeza. Nunca agarre el nervio directamente con instrumentos, sino manipule el nervio con herramientas romas y mantenga una colocación libre de tensión. Antes de comenzar el procedimiento quirúrgico, coloque a la rata en posición prona sobre una mesa de preparación y confirme la profundidad adecuada de la anestesia comprobando el reflejo pinnal.Durante toda la duración de la cirugía, siga evaluando la frecuencia respiratoria, el color del tejido y la profundidad de la anestesia cada 15 minutos, y mantenga los niveles de iso flúor en consecuencia. Controle las membranas mucosas, que deben permanecer rosadas y húmedas. Coloca la rata en la mesa de preparación.Afeita el área quirúrgica, incluyendo la pierna derecha y la mitad inferior de la espalda. Una vez hecho esto, mueva al animal a la mesa quirúrgica y frote el área quirúrgica afeitada con una almohadilla Betadine, seguida de un hisopo de etanol al 70% tres veces. Use tijeras de tejido para hacer una incisión en la piel paralela al hueso del fémur derecho, seguida de una separación roma del tejido conectivo subcutáneo en la espalda, directamente medial a la incisión para despejar una bolsa subcutánea para la bobina receptora.A continuación, realice una incisión posterior en el músculo glúteo derecho paralelo a la incisión cutánea. Con la ayuda de sondas de disección de metal con extremos romos, aísle el nervio ciático y luego implante el dispositivo inalámbrico sin batería en el nervio ciático aislado envolviendo el manguito sin poner el nervio bajo tensión ni distorsionar su trayectoria. Una vez hecho esto, marque en la piel donde se coloca la bobina receptora para una mayor estimulación eléctrica.Suturar la incisión del músculo glúteo con suturas reabsorbibles. Encierre la incisión en la piel con pinzas para heridas haciendo coincidir los bordes de la piel. Durante una hora después de la cirugía, administre estimulación eléctrica continua de 20 hercios con un ancho de pulso de 200 microsegundos al animal bajo anestesia.Una vez que se recupere por completo de la anestesia, regrese al animal a la jaula de origen. Después de preparar la envoltura para el procedimiento quirúrgico como se describió anteriormente, afeite el área quirúrgica en la cara ventral del cuello. Mueva al animal a la mesa quirúrgica y frote el área quirúrgica afeitada con una almohadilla Betadine, seguida de un hisopo de etanol al 70% tres veces.A continuación, realice una incisión de tres centímetros en la línea media a través de la piel en la fascia cervical superficial de la rata anestesiada para exponer los músculos esternohioides y esternocleidomastoideo. Use una sonda para la disección de sangre para elevar el músculo esternocleidomastoideo antes de retraer el esternocleidomastoideo lateralmente usando un asa vascular. Luego, libere y retraiga el músculo omohioideo, seguido de la liberación y retracción medial del nervio vago y el haz carotídeo debajo del músculo omohioideo.Aísla el nervio frénico. Implante el dispositivo inalámbrico sin pilas en el nervio frénico colocando la bobina receptora del dispositivo en el esternohioides, profundo en relación con los músculos esternocleidomastoideos bilaterales, con el manguito alrededor del nervio frénico y los electrodos de contacto colocados perpendicularmente al nervio. Cerrar la piel con suturas reabsorbibles invertidas en la dermis profunda.Durante una hora después de la cirugía, administre estimulación eléctrica continua de 20 hercios con un ancho de pulso de 200 microsegundos al animal bajo anestesia. Después de recuperarse por completo de la anestesia, regrese al animal a la jaula de la casa. Para la estimulación inalámbrica, utilice un generador de funciones de forma de onda para proporcionar energía eléctrica a una bobina de transmisión inductiva externa.Haga coincidir la frecuencia de resonancia y el posicionamiento de la bobina receptora implantada para garantizar un buen acoplamiento inductivo. Una vez realizado el ajuste, administre pulsos monofásicos de 200 microsegundos a 20 hercios durante una hora. Para verificar y cuantificar la administración de estimulación eléctrica, registre los potenciales de acción muscular compuestos, o CMAP, del músculo tibial anterior mientras ajusta el voltaje de estimulación para administrar la activación supramáxima del nervio ciático.La lesión completa de la transección del nervio frénico se confirmó en el estudio al evocar una respuesta de contracción. Antes de la transección, la estimulación eléctrica del nervio frénico evocaba potenciales de acción muscular compuestos en el diafragma ipsilateral, que fueron abolidos por la transección del nervio frénico. Se comparó una respuesta máxima de CMAP provocada después de administrar un solo pulso de estímulo a la ciática derecha mediante un electrodo de alambre con un electrodo inalámbrico.Se observó que la estimulación nerviosa inalámbrica podía lograr en promedio el 88% del CMAP a partir de la estimulación nerviosa basada en alambre. El análisis electromiográfico representativo muestra cuatro picos secuenciales al principio y los 40 minutos de la estimulación eléctrica de 20 hercios de una hora de duración. A los 40 minutos, se observó una ligera disminución en la amplitud máxima.El grado de regeneración de los nervios periféricos se evaluó mediante trazadores retrógrados aplicados distalmente al sitio de la lesión nerviosa. Se observaron los subgrupos regenerados del nervio tibial o del nervio peroné en el asta anterior de la médula espinal lumbar. Recuerde que la bobina transmisora debe estar bien alineada con la bobina receptora para alimentar el dispositivo cuando tal vez deba ajustar la distancia, la orientación o la posición para lograr la eficacia completa.El método también se puede realizar en otras interfaces nerviosas preferidas, como la liberación de fármacos y la optogenética. La técnica se puede realizar para estudiar varios mecanismos por los cuales la estimulación eléctrica conduce a diferentes efectos en diferentes nervios.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Cultura rebanada de organotípicos que expresan GFP embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de Nervio Periférico

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Investigación

Neurociencias

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Estimulación Optogenética del nervio auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Evaluación de la función neuromuscular Usando percutánea estimulación nerviosa eléctrica

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfaz culturas 3D Engineered neuronales a micro-electrodos matrices: un innovador<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Azul de toluidina tinción de secciones embebido en resina para la evaluación de la morfología del nervio periférico

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Dirigido a agregados de alfa sinucleína en fibras nerviosas periféricas cutáneas por el ensayo de inmunofluorescencia de flotación libre

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

WheelCon: Una plataforma de juego basada en el control de ruedas para estudiar el control del sensor humano

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Preparación de electrodos de estimulación nerviosa periférica para la implantación crónica en ratas

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...