Name: implantation and control of wireless, battery-free systems for peripheral nerve interfacing
Uploaded: 2021-10-20T15:00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation and Control of Wireless, Battery-free Systems for Peripheral Nerve Interfacing at JoVE.com

Detta arbete använde NUFAB-anläggningen vid Northwestern Universitys NUANCE Center, som har fått stöd från SHyNE-resursen (NSF ECCS-1542205), IIN och Northwesterns MRSEC-program (NSF DMR-1720139). Detta arbete använde sig av MatCI-faciliteten som stöds av MRSEC-programmet från National Science Foundation (DMR-1720139) vid Materials Research Center vid Northwestern University. C.K.F bekräftar stöd från Eunice Kennedy Shriver Institute of Child Health and Human Development vid NIH (anslag nr R03HD101090) och American Neuromuscular Foundation (utvecklingsbidrag). Y.H. bekräftar stöd från NSF (anslag nr. CMMI1635443). Detta arbete stöddes av Querrey Simpson Institute for Bioelectronics vid Northwestern University.

Alla procedurer som beskrivs i detta protokoll utförs i enlighet med NIH:s guide för vård och användning av försöksdjur och har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Northwestern University. Detta protokoll följer riktlinjerna för djurvård från Northwestern University's Center for Comparative Medicine och IACUC. Det är nödvändigt att samråda med IACUC när protokollen anpassas.
1. Tillverkning av trådlösa elektroniska stimulatorer (figur 2)
<ol><li>Använd koppar/polyimid/koppar (18 μm tjock topp- och bottenkoppar, 75 μm tjock polyimid) som substrat för radiofrekvensskördarspolen (dvs. trådlös mottagarantenn).</li>
	<li>Använd direkt laserablation för att mönstra hål för elektroderna på de övre och nedre kopparskikten och forma enheten. Anslut de övre och nedre lagren elektriskt med silverpasta genom hålen.</li>
	<li>Fäst de elektroniska komponenterna med handelsförpackningar, såsom diod och kondensator, via lödning.</li>
	<li>Använd den bioresorberbara dynamiska kovalenta polyuretanen (b-DCPU; 200 μm tjock) inkapslade molybden (Mo; 15 μm tjock; serpentinstruktur) som töjbara förlängningselektroder19.</li>
	<li>Forma manschettelektroden för gränssnittet mellan enheten och nerven med hjälp av poly(mjölk-co-glykolsyra) (PLGA) film (300 μm tjock).</li>
	<li>Efter att ha anslutit den trådlösa mottagarantennen och den töjbara förlängningselektroden, kapsla in den trådlösa mottagarantennen och anslutningen med kommersialiserad vattentät epoxi eller polydimethysiloxan (PDMS). Se figur 2 (höger) för den färdigmonterade enheten.</li>
	<li>Bekräfta enhetens trådlösa drift med hjälp av en vågformsgenerator för att generera monofasiska elektriska impulser via primärspolen (dvs. transmissionsspolen). OBS: Vid undersökning av rekrytering av perifera axoner och induktion av axonal regenerering genom monofasiska och bifasiska stimuli har tidigare studier rapporterat en försumbar effekt på grund av skillnaderna i vågformskarakteristik20, och denna grupp har kunnat uppnå terapeutisk förbättring av elektrisk stimulering med samma monofasiska strömparametrar hos möss21 och råttor18. Dessutom har man i tidigare studier undersökt biokompatibilitet in vivo och in vitro och inte funnit några tecken på vävnadsskador från upphettningseffekter eller själva materialen. På grund av dessa fynd och den begränsade varaktigheten av terapeutisk elektrisk stimulering i den aktuella studien användes monofasiska, snarare än bifasiska, stimuli i detta protokoll.</li>
	<li>Mät den resulterande likströmsutspänningen med ett oscilloskop anslutet till manschettelektroden.</li>
</ol>2. Förberedelse av enheten för implantation
<ol><li>Placera implantatanordningarna i en steril petriskål och försegla den med parafilm.</li>
	<li>Bestråla enheterna med UV-ljus i 30 minuter per sida.</li>
</ol>3. Kirurgiskt ingrepp av råtta höger ischiasnervimplantation av trådlöst, batterifritt perifert nervgränssnitt för elektrisk stimulering (figur 3)
OBS: Upprätthåll sterila förhållanden. Utför operationer inom det avsedda kirurgiska området i ett djuringreppsrum. Kirurgen kommer att ta på sig en ansiktsmask, rock, keps och sterila handskar under operationen. Om mer än en operation utförs, byt sterila handskar mellan djuren och använd rena, sterila kirurgiska instrument för varje operation. Sterilisera verktyg mellan operationerna genom värmesterilisering (autoklav eller glaspärlsterilisator). Använd vuxna Sprague-Dawley-råttor som väger 200-250 g.
<ol><li>Inducera anestesi med isoflurangasanestesi (3 % induktion, 1-3 % underhållsbehandling) i syrgas (2 l/min), med subkutan administrering av meloxikam (1-2 mg/kg). Täck råttornas ögon med en ögonsalva för att förhindra uttorkning.</li>
	<li>Placera råttorna på mage på desinficerade operationsbord för efterföljande ingrepp. För den återstående kirurgiska varaktigheten, bedöm andningsfrekvensen (bör vara ~2/s), vävnadsfärg och anestesidjup inte mindre än var 15:e minut och upprätthåll isoflurannivåerna i enlighet med detta. Bekräfta lämpligt anestesidjup genom att kontrollera pedalreflexen (brist på svar på ett hårt tånyp). Övervaka slemhinnorna, som ska förbli rosa och fuktiga.</li>
	<li>Raka operationsområdet, inklusive höger ben och nedre halvan av ryggen. Skrubba det rakade operationsområdet med en betadindyna, följt av en 70 % medicinsk etanolpinne, och upprepa denna skrubbprocess tre gånger för huddesinfektion.</li>
	<li>Gör ett snitt på 1,5 – 2 cm i huden parallellt med höger lårben med hjälp av en vävnadssax, följt av trubbig separation av subkutan bindväv på baksidan (direkt medialt till snittet) för att rensa en subkutan ficka för mottagarspolen (Figur 4A). Gör ett efterföljande snitt (1,2-1,5 cm) på höger sätesmuskel parallellt med hudsnittet.</li>
	<li>Isolera försiktigt ischiasnerven med metalldissektionssonder med trubbiga ändar (Figur 4B). OBS: Ischiasnerven ligger djupt till biceps femoris och löper parallellt med lårbenet. Ett dissekeringsomfång föreslås.</li>
	<li>Implantera den trådlösa, batterifria enheten på ischiasnerven (Figur 4C) genom att linda manschetten runt den isolerade högra ischiasnerven, utan att sätta nerven under spänning eller förvränga dess väg 18,19,20. Märk ut på huden var mottagarspolen är placerad för ytterligare elektrisk stimulering.</li>
	<li>Suturera sätesmuskelsnittet med hjälp av absorberbara suturer (Figur 4D). OBS: Den övre halvan av mottagarspolen sitter ovanför sätesmuskeln och manschetten under den.</li>
	<li>Stäng hudsnittet med sårklämmor (eller begravd sutur; Figur 4E). Matcha hudkanterna.</li>
	<li>Ge 1 timmes kontinuerlig postoperativ 20 Hz elektrisk stimulering med 200 μs pulsbredd under anestesi (Figur 4F). Återföra djuren till sina hemburar när de har återhämtat sig helt från anestesi. OBS: Det detaljerade protokollet beskrivs nedan. Mottagarspolen visas ovanför huden i figur 4F.</li>
	<li>Postoperativ behandling<ol><li>Placera råttan i en uppvakningsbur utan strö, fodrad med hushållspapper, med halva buren placerad på en lämplig temperaturreglerad värmekälla (godkänd värmedyna).</li>
		<li>Övervaka råttan noggrant tills den är ambulerande. När råttan är ambulerande och bedöms vara stabil ska den sättas tillbaka i buren och ses efter social återintegrering.</li>
		<li>Efter akut återhämtning, övervaka råttorna med avseende på infektion vid snittstället och för symtom på neurogen smärta, inklusive men inte begränsat till vaktning, vridning, kliande och självstympning. Övervaka råttorna dagligen under den 5 dagar långa återhämtningsperioden efter operationen, och minst en gång var tredje dag efter det om råttorna inte avlivas på dag 5.</li>
		<li>Administrera meloxikam (1-2 mg/kg) subkutant en gång dagligen i två till tre dagar efter operationen, beroende på djurets uppvisade smärta/obehag. Vid misstanke om ihållande smärta ska meloxikam fortsätta postoperativt efter denna period, och om det visar sig vara refraktärt ska råttan avlivas tidigt i samråd med veterinärteamet.</li>
		<li>Ta bort hudsuturerna eller sårklämmorna 10-12 dagar efter operationen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Kirurgiskt ingrepp av vänster frenisk nervimplantation av trådlösa stimulatorer på råtta (Figur 5A)
OBS: Upprätthåll sterila förhållanden, som i avsnitt 3. Använd vuxna Sprague-Dawley-råttor som väger 200-250 g. Sterilisera alla kirurgiska verktyg före användning.
<ol><li>Inducera anestesi med isoflurangasanestesi (3 % induktion, 1-3 % underhållsbehandling) i syrgas (2 l/min), med subkutan administrering av meloxikam (1-2 mg/kg). Täck råttans ögon med avsedd ögonsalva för att förhindra uttorkning.</li>
	<li>Placera råttorna på rygg på desinficerade operationsbord för efterföljande ingrepp. Under den återstående kirurgiska varaktigheten, bedöm andningsfrekvens, vävnadsfärg och anestesidjup inte mindre än var 15:e minut och upprätthåll isoflurannivåerna i enlighet med detta. Bekräfta lämpligt anestesidjup genom att kontrollera pedalreflexen (brist på svar på ett hårt tånyp). Övervaka slemhinnorna, som ska förbli rosa och fuktiga.</li>
	<li>Raka operationsområdet på den ventrala aspekten av halsen. Skrubba det rakade operationsområdet med en betadindyna, följt av en 70 % medicinsk etanolpinne, och upprepa denna skrubbprocess tre gånger för huddesinfektion.</li>
	<li>Administrera bupivakain (2 mg/kg, utspätt i koksaltlösning med högst 0,5 ml) subkutant vid mittlinjen på halsen, med inriktning på det ytligaste skiktet. Gör ett snitt på 3 cm i mitten genom huden och den ytliga cervikala fascian för att exponera sternohyoid- och sternocleidomastoideusmusklerna (Figur 5B). OBS: Ett dissekeringsomfång föreslås.</li>
	<li>Höj sternocleidomastoideusen med en lätt trubbig dissektion med en sond och dra tillbaka den i sidled med hjälp av en kärlögla (Figur 5C). Lossa försiktigt och dra tillbaka omohyoiden. Frigör sedan försiktigt vagusnerven och halspulsådret under omohyoidmuskeln. OBS: Den största skillnaden här är mellan vagusnerven och frenisnerven. Skär av omohyoiden om det är nödvändigt för att exponera de underliggande strukturerna.</li>
	<li>Isolera frenusnerven (Figur 5D). OBS: Den freniska nerven löper längs ytan av den främre skalenmuskeln och löper som en anmärkningsvärt liten längsgående nerv som korsar vinkelrätt mot plexus brachialis. Till skillnad från ischiasnerven är anatomin runt frenisnerven vid halsen mer komplex. Utför elektrofysiologisk bekräftelse (steg 4.7) före implantation för bästa resultat.</li>
	<li>Placera registreringselektroden subkutant, precis kaudalt mot bröstkorgen, ipsilateralt mot den isolerade freniska nerven (Figur 5E). Placera stimulatorerna på frenisnerven och bekräfta via synkron signalering (Figur 6). OBS: Att framkalla en maximal respons med en stimulusintensitet på ~3-6 mA och stimulusvaraktighet på 0.02 ms är typiskt.</li>
	<li>Verifiera fullständig transsektion av frenusnerven genom att visa fullständigt avskaffande av den framkallade responsen när en elektrisk stimulus appliceras på den proximala nervänden i förhållande till transsektionsstället (Figur 6).</li>
	<li>Implantera en trådlös, batterifri enhet på frenusnerven (Figur 5F) genom att placera mottagarspolen på den implanterbara enheten på sternohyoiden, djupt i förhållande till de bilaterala sternocleidomastoideusmusklerna, med manschetten runt frenusnerven och kontaktelektroderna placerade vinkelrätt mot nerven.</li>
	<li>Stäng den ytliga cervikala fascian med enkla absorberbara suturer (Figur 5G). Stäng huden med avbrutna inverterade absorberbara suturer i den djupa dermis. Återför djuren till sina hemburar först när de har återhämtat sig helt från narkosen.</li>
	<li>För postoperativ behandling, följ steg 3.10.</li>
</ol>5. Trådlös tillförsel av terapeutisk elektrisk stimulering
<ol><li>Applicera elektrisk stimulering i 1 timme på råttorna under narkos. För den trådlösa stimuleringen, placera en vågforms-/funktionsgenerator (voltage: 1-15 Vpp) och valfri amplifier ovanför djuret för att ge elektrisk ström till en extern induktiv spole (dvs. transmissionsspole) (tvådimensionell spiralspole med 5 varv; diameter: 2 cm) för att säkerställa god induktiv koppling med den implanterade mottagarspolen. Leverera monofasiska 200 μs-pulser vid 20 Hz under 1 timmes varaktighet.</li>
	<li>För att verifiera och kvantifiera elektrisk stimulering, registrera CMAPs från tibial anterior muskel och justera stimuleringsspänningen för att leverera supramaximal aktivering av ischiasnerven. Använd koncentriska nålelektroder för alla inspelningar. OBS: Om funktionsgenererad maximal voltage är otillräcklig för att framkalla en maximal respons, använd en amplifier.</li>
</ol>6. Eutanasi
<ol><li>Primär metod<ol><li>Placera buren under en CO2 -tillförselkammare, inställd på en hastighet av 8-12 LPM (eller lämplig flödeshastighet baserat på kammarens storlek). Övervaka råttorna för medvetslöshet och sedan i minst 1 minut efter andningsuppehåll.</li>
	</ol></li>
	<li>Sekundär metod<ol><li>Utför cervikal dislokation eller bilateral torakotomi.</li>
	</ol></li>
</ol>

Författarna har inga intressekonflikter.

Denna artikel beskriver stegen i den kirurgiska implantationen och driften av ett trådlöst, batterifritt och helt implanterbart perifert nervgränssnitt i råttischias- och frenisnervsmodellen. Vi visar hur denna nya klass av biomedicinska implantat kan användas för att leverera ett terapeutiskt elektriskt stimuleringsparadigm som visat sig förbättra axonregenerering i prekliniska och kliniska studier (för granskning, se22). Detta protokoll är okomplicerat och kan extrapoleras till mindre djurmodeller, såsom möss21, såväl som andra trådlösa, batterifria och helt implanterbara enheter med funktionalitet som inkluderar optoelektroniska och mikrofluidiska perifera nervgränssnitt 18,23,24,25,26,27,28,29,30. Metoden med ischiasnerven hos gnagare demonstreras också, vilket är den vanligaste experimentella modellen31.
Mångsidigheten i detta tillvägagångssätt har visat sig när det är anpassat för att samverka med frenusnerven, som sällan används som modell för perifer nervskada32, kanske för att det är ett mycket underkänt kliniskt problem 33,34,35. Diagnos och rehabilitering av freniska nervskador har blivit en viktig fråga under covid-19-pandemin 36,37,38. Det är för närvarande okänt om regenerering av freniska axoner och återhämtning från diafragmaförlamning kan förstärkas av detta korta, lågfrekventa elektriska stimuleringsparadigm. Emellertid är frenisk nervelektrisk stimulering för stimulering av diafragmamuskeln ett etablerat alternativ för andningssvikt hos patienter med tetraplegi från hög cervikal ryggmärgsskada 39,40,41,42,43. Andra indikationer undersöks, bland annat avvänjning i respirator efter kritisk sjukdom44.
Flera kritiska steg bör betonas för att säkerställa att det implanterade systemet fungerar väl. För det första är det viktigt att undvika att applicera för mycket kraft på de tunna elektroniska komponenterna i enheterna när du hanterar dem för att förhindra blyavisolering, veck eller brott. Därefter är det viktigt att noggrant markera platsen för radiofrekvensskördarspolen på den överliggande huden. För det tredje, noggrann inriktning av transmissionsspolen på den externa radiofrekvensströmförsörjningen över kraftskördarspolen på den implanterade enheten med en svanhalsklämma möjliggör stabil drift. Slutligen, för att bekräfta elektrisk stimulering utöver visuell observation av muskelryckningar, rekommenderas periodisk neurofysiologisk övervakning. När det gäller den mer komplexa anatomin hos frenusnerven i nacken hjälper elektrofysiologisk bekräftelse till att visa att rätt nerv har isolerats (Figur 6).
Förutom de trådlösa, batterifria elektriska stimulatorerna som visas i detta dokument 18,19,21, delar många andra enheter potentiellt samma procedurer. Till exempel, eftersom elektroder som är utformade för att implantera på glossofaryngeal- och vagusnerverna för att kroniskt registrera signaler från sympatiska och parasympatiska nervsystem 30,45,46 delar ett liknande kirurgiskt område med frenisnerven, kan detta protokoll anpassas för deras implantation. Trådlösa långsiktiga biokompatibla stimulatorer för perifera nerver, som ReStore, är utmärkta verktyg för att hålla sig på plats och stimulera nerver efter behov 25,47,48,49,50. Relevanta flerkanaliga trådlösa inspelningsimplantat har också rapporterats51. Sammantaget tror vi att dessa kirurgiska och elektriska stimuleringsprotokoll kan anpassas som en standard för alla trådlösa perifera nervgränssnitt relaterade till elektrisk stimulering eller inspelning.

Traumatiska perifera nervskador (PNI) förekommer i USA med en årlig incidens på cirka 200 000 per år1. De flesta patienter som drabbas av PNI får bestående funktionsnedsättningar. I värsta fall kan detta leda till muskelförlamning och utlösa behandlingsrefraktär neuropatisk smärta som är så svår att patienterna är villiga att genomgå en amputation av extremiteterna som behandling2. Det största hindret för att förbättra PNI-resultaten är att axonregenereringen är för långsam i förhållande till de avstånd de måste växa igen. Till exempel växer ett vuxet mänskligt axon med 1 mm/dag men kan behöva regenerera över avstånd >1000 mm vid en lesion i en proximal extremitet.
I nuvarande klinisk praxis kräver ~50 % av PNI:erna kirurgisk reparation3. För framgångsrik nervregenerering måste axoner (i) växa över lesionsstället (dvs. gapkorsning) och sedan (ii) regenerera längs nervbanan för att nå ett mål för slutorganet (dvs. distal återväxt) (Figur 1). Det finns inga FDA-godkända läkemedel som visat sig påskynda nervregenerering. Status quo för PNI:s kliniska hantering har endast förändrats stegvis under de senaste decennierna och är begränsad till tekniska förbättringar av kirurgiska metoder såsom distala motoriska nervöverföringar för att minska avståndet som regenererande axoner måste färdas4, eller syntetiska nervledningar "från hyllan" för fall där den proximala nerven dras tillbaka och inte direkt kan sys ihop igen5. Det har dock gjorts fyra randomiserade kliniska prövningar på terapeutisk elektrisk stimulering applicerad på nerver postoperativt, som var enkelcenterstudier ledda av Dr. K. Ming Chan vid University of Alberta som visar signifikant förbättrad reinnervering av muskel 6,7,8 eller hud9. Det grundläggande arbetet för detta elektriska stimuleringsprotokoll utfördes på gnagare10,11, där det har visats att elektrisk stimulering fungerar specifikt genom att förbättra gap crossing (Figur 1) men inte distal återväxt 12,13,14,15.
Den kirurgiska placeringen av transkutana trådelektroder som användes i alla fyra randomiserade kliniska prövningar med elektrisk stimulering var nödvändig eftersom dess effekter beror på leveransen av tillräcklig ström för att depolarisera neuroncellkroppen vid 20 Hz kontinuerligt i 1 timme11. I klinisk praxis är detta elektriska stimuleringsprotokoll inte tolerabelt för de flesta patienter vid de intensiteter som krävs via ytstimulerande elektroder på huden på grund av smärta. Det finns icke-triviala risker förknippade med att köra transkutana elektroder postoperativt, såsom djup sårinfektion eller oavsiktlig förskjutning av ledningar från nerverna under patienttransport från operationssalen (OR). Dessutom är den höga kostnaden för operationstid i sig ett hinder för att försöka i den miljön snarare än under akut postoperativ återhämtning. En ny klass av trådlösa, batterifria och helt implanterbara perifera nervgränssnitt växer fram för att ta itu med denna brist i befintliga perifera nervgränssnitt.
Denna nya klass av trådlösa implanterbara elektroniska system är redo att öka enkelheten och flexibiliteten för elektrisk stimuleringsdosering och bryta ner de barriärer som förhindrar en bredare klinisk implementering. Denna artikel beskriver metoder för att (i) kirurgiskt implantera och (ii) trådlöst driva och kontrollera detta system i vuxna råttischias- och freninnervsmodeller. Den visar hur det perifera nervgränssnittet kan framkalla CMAP, leverera ett terapeutiskt elektriskt stimuleringsprotokoll och till och med fungera som en kanal för reparation av perifera nerver. Protokollen här kan anpassas för andra varianter av denna teknik som kan leverera ljuspulser för optogenetisk medierad neuromodulering16, kontrollerad läkemedelsfrisättning17 eller upprepade anfall av elektrisk stimulering över tid18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Electronics &#38; Innovation</td>
			<td>201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>RIGOL</td>
			<td>DG1032Z</td>
			<td>30 MHz, 2 Channel, 200 MS/s, 14bit Resolution, 8 Mpts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>655317</td>
			<td>Marcaine, 0.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper/polyimide/copper</td>
			<td>Pyralux</td>
			<td>AP8535R</td>
			<td>18 &#181;m thick top and bottom copper, 75 &#181;m thick polyimide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMG recording device</td>
			<td>Natus</td>
			<td>Nicolet VikingQuest</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOXY MARINE</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Butler Schein Animal Health</td>
			<td>1040603</td>
			<td>ISOTHESIA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>covetrus</td>
			<td></td>
			<td>5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle electrodes</td>
			<td>Technomed USA Inc.</td>
			<td>TE/B50600- 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (Silicone Elastomer Kit)</td>
			<td>DOW</td>
			<td>SYLGARD&#8482; 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProtoLaser U4</td>
			<td>LPKF</td>
			<td>U4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant</td>
			<td>Puralube</td>
			<td>83592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waveform generator</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>Agilent 33250A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation and control of wireless, battery-free systems for peripheral nerve interfacing

Perifera nervgränssnitt används ofta inom experimentell neurovetenskap och regenerativ medicin för en mängd olika tillämpningar. Sådana gränssnitt kan vara sensorer, ställdon eller båda. Traditionella metoder för perifer nervgränssnitt måste antingen vara bundna till ett externt system eller förlita sig på batterikraft som begränsar tidsramen för drift. Med den senaste utvecklingen av trådlösa, batterifria och helt implanterbara perifera nervgränssnitt kan en ny klass av enheter erbjuda funktioner som matchar eller överträffar deras trådbundna eller batteridrivna prekursorer. Denna artikel beskriver metoder för att (i) operera in och (ii) trådlöst driva och kontrollera detta system hos vuxna råttor. Ischias- och frenisnervsmodellerna valdes ut som exempel för att belysa mångsidigheten i detta tillvägagångssätt. Artikeln visar hur det perifera nervgränssnittet kan framkalla sammansatta muskelaktionspotentialer (CMAP), leverera ett terapeutiskt elektriskt stimuleringsprotokoll och införliva en ledning för reparation av perifer nervskada. Sådana enheter erbjuder utökade behandlingsalternativ för terapeutisk stimulering med engångsdos eller upprepad dosering och kan anpassas till en mängd olika nervplatser.

I ischiasnervskademodellen placeras implantatet runt den högra ischiasnerven före end-to-end-reparation av tibialnervgrenen (Figur 3, Figur 4A och Figur 7A). En 30 G koncentrisk nålelektrod placeras i den högra främre tibialismuskeln för att definiera de stimulusparametrar som behövs för maximal intensitet av elektrisk stimulering. Dessa experiment inkluderar att höja stimuleringsintensiteten tills responsstorleken planar ut maximalt. Eftersom tibialis anterior innerveras av den fibulära grenen av ischiasnerven, skonas den vid tibialnervens transektionsskada. Registrering från tibialis anterior möjliggör således kontinuerlig övervakning av den elektriska stimuleringsbehandlingen.
För en enda stimuluspuls som levereras av en trådelektrod till höger ischiasnerv (5 mA, 0,02 ms) erhålls ett maximalt CMAP-svar med en 5,4 mV negativ toppamplitud registrerad på ipsilateral tibialis anterior (Figur 7B; svart spår). För en jämförbar stimuluspuls som levereras av det trådlösa, batterifria implantatet erhålls ett jämförbart CMAP-svar med en negativ toppamplitud på 4,6 mV (figur 7B; orange spår). Detta stämmer överens med en nyligen publicerad rapport om att trådlös nervstimulering i genomsnitt uppnår 88 % av CMAP från trådbaserad nervstimulering21, långt över den tröskel som krävs för terapeutiska effekter i kliniska studier 6,7,8,9. I exemplet som visas berodde den längre latensen för den trådlösa stimulatorn jämfört med trådbunden stimulator på dess större avstånd från den registrerade muskeln.
I frenicnervmodellen placeras implantatet runt den högra freniska nerven före transsektion (figur 5). För att definiera de stimulusparametrar som behövs för maximal intensitet av elektrisk stimulering placeras en 30 G koncentrisk nålelektrod subkutant vid den högra (ipsilaterala) främre revbensmarginalen för att registrera från höger hemidiafragma. Experimenten går ut på att höja stimuleringsspänningen tills responsmagnituden planar ut maximalt. Eftersom frenusnerven kan vara svår att isolera från omgivande neurovaskulära strukturer, kan dess identitet bekräftas genom att framkalla en ryckrespons (Figur 6; orange spår). Stimuleringens specificitet kan verifieras ytterligare genom transsektion av frenusnerven distalt om nervelektrodmanschetten med efterföljande eliminering av ryckresponsen (Figur 6; svart spår).
Repetitiv, lågfrekvent elektrisk stimuleringsterapi kan levereras till ischiasnerven i 1 timme med hjälp av ett etablerat protokoll som förbättrar axonregenerering (6,7,8,9,10,11; Figur 8). Manschettgränssnittet för det trådlösa implantatet placerades på höger ischiasnerv och den koncentriska nålelektroden på 30 G placerades på den högra främre tibialismuskeln för att övervaka behandlingen. Figur 8A visar fyra sekventiella spikar i den registrerade elektromyografin i början (0 min) av den elektriska stimuleringen på 1 h 20 Hz. Figur 8B visar fyra andra toppar registrerade vid 40 minuter av den elektriska stimuleringen på 1 timme med en liten minskning av toppamplituden, vilket överensstämmer med det trötthetsmönster som noterats med trådbaserad elektrisk stimuleringsterapi15,21.
Graden av perifer nervregenerering kan bedömas med hjälp av retrograda spårämnen som appliceras distalt på nervlesionsstället. Eftersom perifera axoner gror multipla kollaterala groddar, möjliggör retrograd spårning och räkning av den motoriska nervcellen soma i ryggmärgen en mer exakt bedömning av antalet regenererande neuroner än att räkna regenererande axoner i själva nerven31. För att demonstrera detta transekterades ischiasnervstammen av en krosskada. Efter 3 veckors återhämtning administrerades två olika fluorescerande retrograda färgämnen på två grenar av ischiasnerven: fibularnerven (grön) respektive tibialnerven (röd) (Figur 9A). Figur 9B-D visar upplysta undergrupper av nedre motorneuroner i ländryggsryggmärgens främre horn som bildar antingen tibialnerven (Figur 9B) eller vadbensnerven (Figur 9C). Överlagringsbilden visar två distinkta kolumner av märkta neuroner i ryggmärgens främre horn, som kan kvantifieras i termer av rumslig fördelning och antalet motoriska neuroner som har regenererat ett axon distalt om lesionsstället (Figur 9D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig01.jpg"> Figur 1: Modell för nervregenerering. (A) Gap crossing sker tidigt efter nervreparation när axoner växer från proximal till distal nervände efter reparation. (B) Varaktigheten av distal återväxt är relaterad till avståndet till målorganet (t.ex. hud, muskel) och hastigheten för axonåterväxt. De flesta terapier för att förbättra nervreparation riktar sig mot en eller båda av dessa processer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig02.jpg"> Figur 2: Illustration av en trådlös elektronisk stimulatortillverkning. Till vänster, detaljerade lager av enhetens struktur, inklusive en cirkulär radiofrekvensskördarspole, en töjbar förlängningselektrod och en nervmanschett som lindas runt en nerv av intresse. Till höger, en förenklad illustration som visar tre delar av enheten. Förkortningar: PLGA = poly(mjölk-co-glykolsyra); b-DCPU = bioresorberbar dynamisk kovalent polyuretan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig03.jpg"> Figur 3: Implantation av trådlöst, batterifritt nervgränssnitt i ischiasnervmodellen hos råtta. (A) Illustrationen visar ett helt implanterbart system i den högra ischiasnerven hos en råtta. (B) Den övre panelen visar ett elektrodgränssnitt placerat på ischiasnerven precis proximalt till reparationen av den högra tibialnerven. Den nedre panelen visar ett elektrodgränssnitt med en förlängd nervmanschett som överbryggar gapreparation mellan den proximala änden och den distala nervstumpen. Förkortning: PLGA = poly(mjölk-co-glykolsyra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig04.jpg"> Figur 4: Procedur för implantation av ischiasnerven. (A) Snitt på huden, subkutan bindväv och sätesmuskeln för att exponera hamstring. (B) Isolerad ischiasnerv (svart pil). (C) Anordning efter implantation med nervmanschett, trådar (vit asterisk) och synligt implantat (stjärna). (D) Förslutning av bindväven genom sutur. (E) Förslutning av snittet med sårklämmor. (F) Trådlös elektrisk stimulering genererad av en spole ovanför huden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig05.jpg"> Figur 5: Procedur för implantation av frenisk nerv. (A) Ventral vy av nacken i ryggläge. B) Snitt på huden och subkutan bindväv för att blotta sternohyoidmuskeln. C) Dissekering genom det potentiella utrymmet mellan omohyoidmuskeln och sternocleidomastoideusmuskeln. (D) Frenisk nerv (pil), isolerad från plexus brachialis. (E) Diafragmatisk elektromyografisk bekräftelse av frenusnerven. Svart pil, inspelningselektrod. Röd pil, stimulatorer. f) Implantation. (G) Förslutning av huden med djupa dermala stygn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig06.jpg"> Figur 6: Bekräftelse av fullständig frenisk nervtranssektionsskada genom framkallade sammansatta muskelaktionspotentialer från diafragman. Före frenisk nervtranssektion (ORANGE) framkallade elektrisk stimulering av frenusnerven sammansatta muskelaktionspotentialer på det ipsilaterala membranet, vilket avskaffades genom frenisk nervtranssektion (BLACK). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig07.jpg"> Figur 7: Representativa nervledningsstudier som jämför trådlös och trådbaserad elektrisk stimulering. (A) Illustration av trådlösa (SVART) och trådbundna (ORANGE) enheters placering på ischiasnerven. Inspelningselektroden placerades i tibialis anterior. (B) Sammansatta muskelaktionspotentialer framkallade av trådbundet implantat (ORANGE) kontra trådlöst implantat (SVART). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig08.jpg"> Figur 8: EMG-inspelning från TA-muskel med 20 Hz repetitiv elektrisk stimulering i 1 timme från implantat. (A) Spår av EMG vid min 1 av e-stim. (B) Spår av EMG vid min 40 av e-stim. Förkortningar: EMG = elektromyografi; TA = tibialis anterior; e-stimulering = elektrisk stimulering; min = minut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig08large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63085/63085fig09.jpg"> Figur 9: Representativa bilder av ischiasnervens regenerering. (A) Illustration av ischiasnervskada och fluorescerande retrograd märkning. Ischiasnervaxonerna transekterades av krosskador. Efter 3 veckors återhämtning märktes dess distala grenar - vadbensnerven (i grönt) och tibialnerven (i rött) - retrogradt. (B-D) Bilder av en ländryggmärg som visar neuronal soma i det ipsilesionella främre hornet. Skalstreck = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63085/63085fig09large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Implantation and Control of Wireless, Battery-free Systems for Peripheral Nerve Interfacing at JoVE.com

Implantation and Control of Wireless, Battery-free Systems for Peripheral Nerve Interfacing

Detta är ett protokoll för kirurgisk implantation och drift av ett trådlöst drivet gränssnitt för perifera nerver. Vi demonstrerar användbarheten av detta tillvägagångssätt med exempel från nervstimulatorer placerade på antingen råttischiasnerven eller frenisnerven.

Implantation och kontroll av trådlösa, batterifria system för perifer nervgränssnitt

Peripheral nerve interfaces are frequently used in experimental neuroscience and regenerative medicine for a wide variety of applications. Such interfaces ...

Perifer nervskada är ganska vanligt. Den elektriska stimuleringen visade terapeutisk effekt på nervregenerering. Så här visade vi en generaliserad metod för implantation av nervgränssnitt och enhetsanvändning.Denna teknik undviker att ha ledningar som går genom huden, vilket kan vara infektionsställen. Den implanterade stimulatorn kan drivas trådlöst och ställas in efter behandlingsbehov. Denna elektriska stimuleringsanordning har hög terapeutisk potential att förbättra perifer nervregenerering efter skada eller sjukdom, vilket hjälper till att återställa förlorad funktion som annars skulle kunna förbli nedsatt.Att isolera nerven och uppnå god kontakt med manschetten kräver delikatess. Ta aldrig tag i nerven direkt med instrument, utan manipulera istället nerven med trubbiga verktyg och behåll en spänningsfri placering. Innan det kirurgiska ingreppet påbörjas, placera råttan i bukläge på ett förberedelsebord och bekräfta lämpligt anestesidjup genom att kontrollera pinnalreflexen.Under hela operationen, fortsätt att bedöma andningsfrekvens, vävnadsfärg och anestesidjup var 15:e minut och upprätthåll iso-fluornivåerna i enlighet med detta. Övervaka slemhinnorna, som ska förbli rosa och fuktiga. Lägg råttan på förberedelsebordet.Raka operationsområdet, inklusive höger ben och nedre halvan av ryggen. När du är klar, flytta djuret till operationsbordet och skrubba det rakade operationsområdet med en Betadine-dyna, följt av en 70% etanolpinne tre gånger. Använd en vävnadssax för att göra ett snitt i huden parallellt med höger lårben, följt av trubbig separation av den subkutana bindväven på ryggen, direkt medialt om snittet för att rensa en subkutan ficka för mottagarspolen.Gör sedan ett efterföljande snitt på höger sätesmuskel parallellt med hudsnittet. Med hjälp av metalldissektionssonder med trubbiga ändar, isolera ischiasnerven och implantera sedan den trådlösa batterifria enheten på den isolerade ischiasnerven genom att linda manschetten runt utan att sätta nerven under spänning eller förvränga dess väg. När du är klar, markera ut på huden där mottagarspolen är placerad för ytterligare elektrisk stimulering.Suturera sätesmuskelsnittet med hjälp av absorberbara suturer. Omslut hudsnittet med sårklämmor genom att matcha hudkanterna. Under en timme efter operationen, leverera kontinuerlig 20 hertz elektrisk stimulering med 200 mikrosekunders pulsbredd till djuret under narkos.När djuret har återhämtat sig helt från narkos ska det sättas tillbaka i hemburen. Efter att ha förberett omslaget för det kirurgiska ingreppet enligt beskrivningen tidigare, raka operationsområdet på den ventrala aspekten av halsen. Flytta djuret till operationsbordet och skrubba det rakade operationsområdet med en Betadine-dyna, följt av en 70-procentig etanolpinne tre gånger.Gör sedan ett tre centimeter mittlinjesnitt genom huden i den ytliga cervikala fascian på den bedövade råttan för att exponera sterno hyoid och sternocleidomastoideusmusklerna. Använd en sond för bloddissektion för att höja sternocleidomastoideusmuskeln innan sternocleidomastoideusmuskeln dras tillbaka lateralt med hjälp av en kärlögla. Frigör och dra sedan tillbaka omohyoidmuskeln, följt av att frigöra och medialt dra tillbaka vagusnerven och halspulsådern under omohyoidmuskeln.Isolera frenusnerven. Implantera den trådlösa batterifria enheten på frenusnerven genom att placera enhetens mottagarspole på sternohyoiden, djupt i förhållande till de bilaterala sternocleidomastoideusmusklerna, med manschetten runt frenusnerven och kontaktelektroderna placerade vinkelrätt mot nerven. Stäng huden med inverterade absorberbara suturer i den djupa dermis.Under en timme efter operationen, leverera kontinuerlig 20 hertz elektrisk stimulering med 200 mikrosekunders pulsbredd till djuret under narkos. Efter fullständig återhämtning från narkosen ska djuret återföras till hemburen. För den trådlösa stimuleringen, använd en vågformsfunktionsgenerator för att ge elektrisk ström till en extern induktiv transmissionsspole.Matcha resonansfrekvensen och placeringen av den implanterade mottagarspolen för att säkerställa god induktiv koppling. När inställningen är klar, leverera monofasiska 200 mikrosekunderspulser vid 20 hertz i en timme. För att verifiera och kvantifiera elektrisk stimulering, registrera de sammansatta muskelaktionspotentialerna, eller CMAPs, från tibialis anteriora muskel samtidigt som stimuleringsspänningen justeras för att ge supramaximal aktivering av ischiasnerven.Den fullständiga freniska nervtranssektionsskadan bekräftades i studien genom att framkalla en ryckningsrespons. Före transsektion framkallade elektrisk stimulering av frenusnerven sammansatta muskelaktionspotentialer på det ipsilaterala diafragman, vilket avskaffades av frenisk nervtranssektion. Ett maximalt CMAP-svar som framkallades efter att ha levererat en enda stimuluspuls till höger ischias med en trådelektrod jämfördes med en trådlös elektrod.Det observerades att den trådlösa nervstimuleringen kunde uppnå i genomsnitt 88 % av CMAP från trådbaserad nervstimulering. Den representativa elektromyografianalysen visar fyra sekventiella spikar i början och de 40 minuterna av den elektriska stimuleringen på en timme och 20 hertz. Efter 40 minuter noterades en liten minskning av toppamplituden.Graden av perifer nervregenerering bedömdes med hjälp av retrograda spårämnen som applicerades distalt på nervlesionsstället. De regenererade undergrupperna av tibialnerven eller vadbensnerven i ländryggmärgens främre horn observerades. Kom ihåg att sändarspolen måste vara väl inriktad mot mottagarspolen för att driva enheten när du kanske ska justera avståndet, orienteringen eller positionen för att uppnå full effekt.Metoden kan även utföras på andra föredragna nervgränssnitt, såsom läkemedelsfrisättning och optogenetik. Tekniken kan användas för att studera olika mekanismer genom vilka elektrisk stimulering leder till olika effekter på olika nerver.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Organotypic Slice Kultur av GFP-uttryckande musembryon i realtid avbildning av perifera nerver utväxt

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplantation av Lukt Ensheathing celler att utvärdera funktionell återhämtning efter perifer nervskada

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Optogenetic Stimulering av hörselnerven

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsalrotsganglier Neuroner och differentierade Fett-härledda Stem Cells: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-kultur modell för att studera perifera nerver Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Bedömning av neuromuskulära funktionen Använda perkutan elektrisk nervstimulering

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Gränssnitt 3D Engineered neuronala kulturer Micro-Elektrod arrayer: Ett innovativt<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimentellt

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Toluidin blå färgning av harts-Embedded sektioner för utvärdering av perifer nerv morfologi

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Inriktning alpha Synuclein aggregat i kutan perifer nerv fibrer av fritt flytande immunofluorescens assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

WheelCon: A Wheel Control-Based Gaming Platform for Studying Human Sensorimotor Control

WheelCon: En hjulkontrollbaserad spelplattform för att studera mänsklig sensorimotorisk kontroll

Feedback control theory has been extensively implemented to theoretically model human sensorimotor control. However, experimental platforms capable of ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Beredning av perifera nervstimulering elektroder för kronisk implantation hos råttor

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...