Name: uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-04-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

نشكر المرفق الأساسي المتكامل لعلم الجينوم الوظيفي التابع للمجلس الوطني لعلم الجينوم الوظيفي (تايبيه، تايوان) ومختبر الجينوم الدوائي NRPB (تايبيه، تايوان) على دعمهما التقني. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا ، تايوان ، R.O.C. [رقم المنحة MOST109-2314-B-002 -186 إلى K.-Y.S. ، ومعظمها 107-2320-B-002-016-MY3 إلى S.-Y.C. ، ومعظمها 110-2320-B-002-043 إلى W.-h.F.]. H.-L.C. حاصل على زمالة الدكتوراه من جامعة تايوان الوطنية. تمويل رسوم الوصول المفتوح: وزارة العلوم والتكنولوجيا، R.O.C.

1. إعداد الركيزة / القالب
<ol><li>تصميم الركيزة / قالب اليوراسيل دوبلكس مع محتوى G + C متوازن من ~ 50 ± 10 ٪ والحد الأدنى من درجة حرارة الانصهار من 50 درجة مئوية لمنطقة دوبلكس. ملاحظة: يساعد اختلاف واحد في النيوكليوتيدات بين ركائز 18 nt وقوالب 19 nt (الجدول 1 والشكل 1) عل?...

توفر هذه الورقة إجراء مفصلا لاستخدام طريقة فحص UDG MALDI-TOF MS للكشف مباشرة عن منتجات الحمض النووي المحتوية على AP. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أن الركائز التي تحتوي على اليوراسيل خالية من الملصقات ، وقابلة للتطوير ، وسهلة العمل معها ، وتوفر مرونة أكبر في تصميم الركيزة.
يتيح ?...

على الرغم من أن اليوراسيل هو قاعدة طبيعية في الحمض النووي الريبي ، إلا أنه آفة شائعة ومطفرة للغاية في الحمض النووي الجينومي. يمكن أن ينشأ Uracil من إزالة الأمين المائي التلقائي / الأنزيمي من deoxycytidine. في كل خلية حية ، يحدث هذا التطهير 100-500 مرة في اليوم في ظل الظروف الفسيولوجية1,2. إذا لم يتم إصلاح هذه التعديلات ، فقد يكون هناك تغيير في تكوين تسلسل الحمض النووي ، مما يسبب طفرة. نظرا لأن اليوراسيل في الحمض النووي يفضل الاقتران مع dATP أثناء التكرار ، إذا كان السيتوزين يزيل الأمينات إلى اليوراسيل ، في حدثين للتكرار ، ستكون هناك طفرة انتقالية جديدة من G:C إلى A:T في نصف الحمض النووي للذرية 3.
من بين الاستراتيجيات الخلوية للحفاظ على الاستقرار الوراثي ، يعد إصلاح استئصال القاعدة (BER) آلية أساسية لإصلاح القواعد التالفة ، مثل اليوراسيل ، في DNA4. BER هي عملية محفوظة تطوريا للغاية. هناك مساران عامان ل BER: مسار التصحيح القصير المؤدي إلى مسار إصلاح لنيوكليوتيد واحد ومسار التصحيح الطويل الذي ينتج مسارا لإصلاح اثنين على الأقل من النيوكليوتيدات 5. BER هي آلية منسقة تحدث في عدة خطوات. الخطوة الأولى في BER هي التحلل المائي الأنزيمي لقاعدة النيوكليوتيدات التالفة بواسطة جليكوزيلاز الحمض النووي الخاص بالتلف لتوليد موقع وسيط أبورينيك / أبيريميدينيك (AP) 6. ويتبع ذلك انقسام العمود الفقري للسكر والفوسفات في موقع AP بواسطة endonuclease ، وينتهي تنظيف الحمض النووي بواسطة لياز ، وملء الفجوة بواسطة بوليميراز الحمض النووي ، وختم النيك النهائي بواسطة ligase5.
يقوم اليوراسيل-الحمض النووي غليكوزيلاز (UDG) بتحلل اليوراسيل من الحمض النووي المحتوي على اليوراسيل ل BER في الإشريكية القولونية. عادة ما تكون فحوصات UDG التقليدية باستخدام الحمض النووي الموسوم إشعاعيا والتي تنطوي على تقنيات فصل مختلفة6،7،8،9،10،11،12،13 تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة ، مع كواشف وضع العلامات المكلفة ، والإجراءات المعقدة ، وتتطلب تدريبا وممارسة مكثفين للحد من مخاطر التعرض للمواد المشعة. تم تطوير مقايسات أوليغونوكليوتيد الفلورومترية كبديل لوضع العلامات على النظائر المشعة14، بالإضافة إلى المنارات الجزيئية وتكنولوجيا نقل طاقة الرنين Förster15,16,17,18,19,20. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى وضع علامات محددة لجميع الطرق المذكورة أعلاه. تم مؤخرا تطوير اختبارات أجهزة الاستشعار الحيوية الخالية من الملصقات 21،22،23 وطرق قياس الألوان القائمة على تشكيل G-quadruplex24،25،26. ومع ذلك ، فإن أزواج A: U المتعددة أو التسلسلات المصممة خصيصا في المجسات تعقد تعريف وحدة الإنزيم.
MALDI-TOF MS هي تقنية يمكن أن تكون ذات فائدة كبيرة في تحليل الحمض النووي. وتشمل التطبيقات التي تم تطويرها التنميط الجيني متعدد الأشكال أحادي النوكليوتيدات27،28، وتحليل النيوكليوتيدات المعدلة29، وتحديد وسيط إصلاح الحمض النووي30،31،32،33،34. يجب اعتماد MALDI-TOF MS بسهولة لتحليل جليكوزيلاز الحمض النووي للكشف عن منتجات الحمض النووي التي تحتوي على موقع AP. ومع ذلك ، فإن مواقع AP في الحمض النووي عرضة لكسر الخيوط في ظل العديد من الظروف التجريبية 33. يتم عرض فحص UDG هنا باستخدام MALDI-TOF MS لقياس إنتاج موقع AP مباشرة دون ضوضاء كبيرة في كسر الحبل السري. هذه الطريقة الخالية من الملصقات سهلة الاستخدام ولديها إمكانات عالية للتطبيق الصيدلاني لفحص مثبطات الحمض النووي للجليكوزيلاز.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)</td>
			<td>J.T baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved deionized water</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>AQUAGLOVE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2,3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(0.5-10 &#181;L)</td>
			<td>extra gene</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(1,250 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(200 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 4, 5 
			Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td>RS1000</td>
			<td>Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Clubio</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>National scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P1000)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P2)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P10)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P100)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P200)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (SL2)</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Singapore)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quest Graph IC50 Calculator (v.1)</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Fig. 4 
			https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>WAKO</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCHIP array</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#01509</td>
			<td>Protocol 3, 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typer 4.0 software</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#10145</td>
			<td>Protocol 6 
			Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDG Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>B0280S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil Glycosylase Inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0281S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil-DNA Glycosylase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0280L</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis

يعد اليوراسيل - الحمض النووي غليكوزيلاز (UDG) مكونا رئيسيا في مسار إصلاح استئصال القاعدة لتصحيح اليوراسيل المتكون من إزالة الأمين المائي للسيتوزين. وبالتالي ، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على سلامة الجينوم. ووضعت طريقة محددة للغاية وغير موسومة وغير نظائر مشعة لقياس نشاط ال UDG. تم شق دوبلكس الحمض النووي الاصطناعي الذي يحتوي على يوراسيل خاص بالموقع بواسطة UDG ثم تم إخضاعه لتحليل الطيف الكتلي للامتصاص بالليزر / التأين بمساعدة المصفوفة (MALDI-TOF MS). تم إنشاء بروتوكول للحفاظ على منتج موقع apurinic / apyrimidinic (AP) في الحمض النووي دون كسر حبل. تم استخدام التغيير في قيمة m / z من الركيزة إلى المنتج لتقييم التحلل المائي لليوراسيل بواسطة UDG. تم استخدام الركيزة G:U للتحليل الحركي UDG مما أسفر عن Km = 50 nM ، Vmax = 0.98 nM / s ، و Kcat = 9.31 s-1. أدى تطبيق هذه الطريقة على اختبار مثبط جليكوزيلاز اليوراسيل (UGI) إلى قيمة IC50 تبلغ 7.6 جزء في المليون. أظهرت خصوصية UDG باستخدام uracil في مواقع مختلفة داخل ركائز الحمض النووي المفردة والمزدوجة التي تقطعت بها السبل كفاءات انقسام مختلفة. وبالتالي ، يمكن أن تكون طريقة MALDI-TOF MS البسيطة والسريعة ومتعددة الاستخدامات طريقة مرجعية ممتازة لمختلف جليكوزيلاز الحمض النووي أحادي الوظيفة. كما أن لديها القدرة كأداة لفحص مثبطات الحمض النووي للجليكوزيلاز.

القوالب والركائز مع أخذ oligonucleotides الاصطناعية مع U في الوسط (U + 9) مقترنة بقالب G كمثال (الشكل 1A) ، يمكن استخدام تحكم فارغ في الكميات متساوية المولار من القالب والركيزة المحتوية على اليوراسيل لمراقبة جودة نقاء oligonucleotide الاصطناعي (الشكل 1B ؛ تتطابق الإش...

Watch this Scientific Journal Video about Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

تم تطوير طريقة غير موسومة وغير نظيرية مشعة لفحص نشاط اليوراسيل - الحمض النووي للجليكوسيلاز باستخدام مطياف الكتلة MALDI-TOF لتحليل المنتج المباشر المحتوي على موقع apurinic / apyrimidinic. أثبت الفحص أنه بسيط للغاية ومحدد وسريع وسهل الاستخدام لقياس جليكوزيلاز الحمض النووي.

فحص الجليكوزيلاز Uracil-DNA بواسطة تحليل الطيف الكتلي للامتصاص / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

آليات إصلاح الحمض النووي مهمة جدا للحفاظ على سلامة الجينوم في جميع الكائنات الحية. Uracil-DNA glycosylase هو بروتين حاسم لإصلاح الحمض النووي في مسار إصلاح الأنسجة الأساسي. باستخدام مطياف الكتلة MALDI-TOF ، يمكننا الكشف مباشرة عن منتج AP لفحص نشاط الإنزيم.يتطلب فحص الجليكوسيلاز التقليدي عمل الركيزة. هذه الطريقة خالية من الملصقات وتكتشف مباشرة تغير الكتلة من ركيزة اليوراسيل إلى منتج AP. وتشمل المزايا الأخرى الدقة العالية والتنوع وقابلية التوسع والسرعة وسهولة الأداء.لقد استخدمنا E.coli uracil-DNA glycosylase كمثال. يمكن تعديل هذه الطريقة بسهولة لفحوصات جليكوزيلاز الحمض النووي الأخرى. ومن الضروري وجود موظفين مدربين تدريبا جيدا في المختبر يتمتعون بمهارات دقيقة في السحب والتخفيف.يجب استخدام الكواشف الطازجة والمخازن المؤقتة منخفضة الملح للحصول على إشارات أفضل وضوضاء خلفية أقل. سيوضح الإجراء هوي لان تشانغ ، طالب الدكتوراه من مختبري. لفحص جليكوزيلاز الحمض النووي باستخدام الركيزة الحاملة لقاعدة الجوانين يوراسيل من T1 U + 9 duplex ، أضف 70 ميكرولتر من الماء ، و 10 ميكرولترات من 10X uracil-DNA glycosylase أو المخزن المؤقت لتفاعل UDG ، وخمسة ميكرولترات من مخزون T1 ، وخمسة ميكرولترات من مخزون U + 9 في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 ملليلتر.أغلق الأنبوب قبل احتضانه في حمام مائي لمدة 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية ، تليها 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، وأخيرا على الجليد لمدة ثلاث دقائق لضمان التلدين السليم لقالب الركيزة على الوجهين. بعد ذلك ، في أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر ، أضف 49 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل UDG البارد المثلج وميكرولتر واحد من UDG المخفف ، ثم قم بإعداد تخفيفات تسلسلية باستخدام المخزن المؤقت UDG لتركيزات الإنزيم المطلوبة ووضع UDG المخفف على الجليد. بعد ذلك ، في أنبوب آخر سعة 1.5 ملليلتر ، أضف تسعة ميكرولترات من مزيج الركيزة المحضر وقم بتسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية ، ثم أضف ميكرولتر واحد من UDG المخفف وقم بتحريك الأنبوب لخلط المحتويات.قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لخليط التفاعل ووضع الأنبوب على الفور للحضانة عند 37 درجة مئوية. استخدم المؤقت لتوقيت التفاعل. لإنهاء التفاعل ، قم بإعداد 0.25 حمض الهيدروكلوريك المولي و 0.23 محلول قاعدة تريس المولي.استخدم مقياس الأس الهيدروجيني لتأكيد الرقم الهيدروجيني عند تحضير الكاشف واختباره بواسطة شريط الأس الهيدروجيني قبل تشغيل خطوة إنهاء التفاعل ، ثم قم بتحمض 10 ميكرولترات من tris-EDTA مع ميكرولتر واحد من 0.25 حمض الهيدروكلوريك المولي وتأكد من أن الرقم الهيدروجيني حوالي اثنين زائد أو ناقص 0.5. قم بتحييد المحلول باستخدام ميكرولتر واحد من قاعدة tris وتأكد من أن الرقم الهيدروجيني النهائي حوالي 6.5 زائد أو ناقص 0.5. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من 0.25 حمض الهيدروكلوريك المولي إلى خليط التفاعل لتعطيل الإنزيم ووضع الأنبوب على الجليد لمدة ست دقائق ، ثم أضف ميكرولتر واحد من قاعدة تريس لتحييد منتجات الحمض النووي وتجنب كسر موقع AP عن طريق التعرض المطول للحمض.بعد إضافة 13 ميكرولتر من tris-EDTA لزيادة حجم خليط المنتج لنقل رقاقة المصفوفة ، ضع الأنبوب على الجليد. أخيرا ، انقل جميع منتجات تفاعل UDG البالغة 25 ميكرولتر من أنابيب الطرد المركزي الدقيق إلى لوحة ميكروتيتر 384 بئرا. افتح باب موزع النانولتر وقم بتحميل لوحة microtiter 384 بئر على حامل اللوحة في سطح السفينة ، ثم أدخل صفيف رقاقة المصفوفة في موضع لوحة الكشافة المقابلة.ضع لوحة الكشافة المحملة على سطح المعالجة الخاص بموزع النانولتر وأغلق الباب. المس زر التشغيل على شاشة النقل وانتظر حتى يبدأ الجهاز في توزيع العينات من لوحة microtiter إلى شريحة المصفوفة. بعد ذلك ، باستخدام خيار علامة تبويب الرؤية ، اعرض صورة الشريحة ووحدات التخزين الموزعة لكل بقعة أثناء التوزيع.تأكد من أن الحجم المرقط على الشريحة يتراوح بين خمسة إلى 10 نانولترات. باستخدام برنامج التطبيق المناسب ، قم بإعداد ملف xlsx يحتوي على قيمة الإشارة المتوقعة M × Z للاستيراد. ثم استخدم البرنامج التطبيقي لإنشاء فحص UDG جديد وتعريفه بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق الخيار استيراد مجموعة المقايسة بتنسيق مصمم وتحديد ملف Excel من القائمة المنسدلة.بعد ذلك ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق زر لوحة مشروع العميل وانقر فوق الجزء العلوي من شجرة الخيارات المنسدلة لإنشاء لوحة فحص جديدة. ثم في مربع الحوار، اكتب اسم ملف. وفي القائمة المنسدلة نوع اللوحة، حدد نوع اللوحة 384 بئرا.اضغط على موافق ( OK) وانتظر حتى تظهر لوحة فارغة على يسار الشاشة. بعد ذلك ، انقر فوق خيار الفحص وحدد الفحص من القائمة المنسدلة. لتعيين المقايسة المحددة لكل موضع بقعة عينة على اللوحة، حرك المؤشر إلى كل موضع من مواضع اللوحة الفارغة، وانقر لتمييز البئر، وانقر بزر الماوس الأيمن لتحديد إضافة لويحات.باستخدام كمبيوتر سطح مكتب أو كمبيوتر محمول، قم بإعداد قائمة عمل بتنسيق xlsx بدون رأس لجميع العينات الموجودة على الشريحة، ثم انقر فوق الزر إضافة نموذج مشروع جديد وحدد الملف من القائمة المنسدلة لاستيراد قائمة العمل. ابحث عن جميع رموز عينة الاختبار في قائمة العمل على يسار الشاشة، ثم انقر فوق نموذج التعليمات البرمجية في قائمة العمل وانقر بزر الماوس الأيمن على الموضع المقابل للوحة لربط الاختبارات بكل موضع. اضغط على زر الإدخال/الخروج من مطياف الكتلة لتمديد سطح السفينة وإخراج حامل الشريحة.أدخل شريحة العينة في حامل الرقاقة ، وضع حامل الشريحة المحملة على السطح الممتد واضغط على زر الدخول / الخروج مرة أخرى حتى تدخل شريحة العينة إلى الأداة. في برنامج التحكم في مطياف الكتلة، انقر نقرا مزدوجا فوق رمز الاكتساب. في نافذة الاستحواذ، انقر فوق علامة التبويب التشغيل التلقائي لبدء تشغيل الجهاز والحصول على أطياف الكتلة من العينات الموجودة على الشريحة.لتحليل البيانات ، قم بتشغيل برنامج تحليل البيانات ، ثم تصفح شجرة قاعدة البيانات وحدد معرف الشريحة.انقر لتمييز هدف جيدا على الشريحة وانقر فوق رمز الطيف لإظهار الطيف الكتلي. انقر بزر الماوس الأيمن لاختيار مربع حوار التخصيص واقتصاص نطاق طيف معين في نافذة جديدة، ثم انقر فوق المحور x لكتابة الحدود العليا والسفلية ل M by Z واضغط على موافق لإظهار طيف النطاق المحدد بما في ذلك إشارات الاهتمام. لقياس ارتفاع الذروة للإشارات M by Z القيم المقابلة لركيزة uracil ومنتج AP والقالب ، انقر فوق الذروة وعرض ارتفاع الذروة في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة.أخيرا ، لحفظ الطيف لحفظ السجلات ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق تصدير وحدد نوع الملف بتنسيق JPEG في القائمة المنسدلة. انقر فوق الوجهة وتصفح القرص لتحديد جهاز التخزين في القائمة المنسدلة ، ثم اكتب اسم الملف وانقر على تصدير. يظهر هنا النظام النموذجي لفحص جليكوزيلاز الحمض النووي.بقي الحمض النووي لقالب النيوكليوتيدات ال 19 دون تغيير بعد التحلل المائي للجليكوزيلاز. لذلك ، يمكن أن تكون الإشارة بمثابة مرجع لقياس كمية منتج AP. أنتج اختلاف نيوكليوتيد واحد بين الركيزة والقالب المقابل ملف تعريف إشارة منفصل جيدا لكليهما.كما تم فصل إشارة منتج AP بشكل جيد عن إشارة الركيزة المحتوية على اليوراسيل. بالنسبة لتحليل بيانات مرض التصلب العصبي المتعدد، تم قياس ارتفاعات الذروة. أظهر تحليل الدورة الزمنية لنشاط UDG عند 0.01 و 0.02 و 0.05 و 0.1 اعتمادا على الجرعة والوقت.يظهر هنا مثال على مخطط معدل التفاعل مع كثافة إشارة MS النسبية للمنتج والركيزة بتركيزات نانومولاري. يتم تقديم معدل تفاعل UDG على أنه نانومول من موقع AP المنتج في الثانية الواحدة. تم حساب KM و VMAX من مؤامرة Lineweaver Burk.كانت وحدة قياس الطيف الكتلي MALDI-TOF متناسبة مع الوحدة المحددة من 0.001 وحدة إلى 0.02 وحدة مع معامل تحديد ملحوظ. يظهر هنا تثبيط نشاط UDG بواسطة مثبط اليوراسيل غليكوزيلاز. في وجود 100 بيكومول من المثبط ، تم تثبيط نشاط 0.05 وحدة من UDG إلى مستوى لا يمكن اكتشافه ووجد أن IC50 هو 7.6 بيكومول.نظرا لأن حجم AP قابل للتحلل ويمكن تحلله بواسطة تفاعل التخلص من بيتا عند درجة الحموضة القصوى ودرجة الحرارة المرتفعة ، يجب إجراء تبريد الفحص على الجليد للفترة المحددة. أيضا ، استخدم مقياس الأس الهيدروجيني للتأكد من أن HCL يحمض المخزن المؤقت للتفاعل إلى الرقم الهيدروجيني المطلوب وقاعدة tris تحييد خليط المنتج بشكل صحيح. يمكن أيضا تعديل هذه الطريقة لتحليل جليكوزيلاز الحمض النووي ثنائي الوظيفة.على سبيل المثال ، U + 2 T3 هي ركيزة مناسبة لفحص جليكوزيلاز الحمض النووي فورماميدوبيريميدين. يمكن بسهولة اكتشاف منتجات الانقسام لنشاط FPG AP ligase بواسطة كتلة MALDI-TOF. هذه الطريقة لديها القدرة على أن تصبح الطريقة المرجعية لقياس الجليكوسيلاز أحادي الوظيفة ويمكن استخدامها أيضا كأداة لفحص مثبطات الجليكوسيلاز لتطوير المستحضرات الصيدلانية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics من مصفوفة خارج الخلية: منهج في تحليل سكري سليمة عن طريق قياس الطيف الكتلي

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

الإعداد الأمثل من الفورمالين الثابتة عينات الببتيد تستند إلى مصفوفة بمساعدة الليزر التصوير مهام سير العمل الطيف الكتلي الامتزاز/التأين

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...