Name: uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-04-22T14:00:00
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我们感谢NCFPB功能基因组学综合核心设施（台湾台北）和NRPB药物基因组学实验室（台湾台北）的技术支持。这项工作得到了台湾科学技术部的支持，R.O.C[批准号MOST109-2314-B-002 -186至K.-Y.S.，MOST 107-2320-B-002-016-MY3至S.-Y.C，MOST 110-2320-B-002-043至W.-h.F.]。H.-L.C.是国立台湾大学博士奖学金的获得者。开放获取收费资金：科学技术部，R.O.C。

1. 基材/模板准备
<ol><li>双相区域设计 G+C 含量平衡至 50 ± 10% 且最低熔化温度为 50 °C 的 uracil 基板/模板双相。 注：18 nt底物和19 nt模板之间的一个核苷酸差异（表1 和 图1）有助于更好的MS信号解释和适当的退火。模板链可作为互补DNA以产生A-U或G-U不匹配（表1），但也可以用作MS测量中的参考信号。HPLC纯化的合成寡核苷酸的使用对本?...

本文提供了使用UDG MALDI-TOF MS测定方法直接检测含AP的DNA产物的详细程序。该方法的主要优点是含尿嘧啶的底物无需标记，可扩展，易于使用，并在基底设计中提供更大的灵活性。
UDG供应商推荐的苯酚/氯仿提取能够使酶失活，以防止产品DNA降解。然而，苯酚提取方案涉及危险化学品的繁琐相分离。另一种酸终止方法使用HCl将反应pH降低到2±0.5也有效地灭活了UDG。随后用Tris碱基?...

虽然尿嘧啶是RNA中的正常碱基，但它是基因组DNA中常见且高度致突变的病变。尿嘧啶可由脱氧胞苷的自发/酶解脱氨引起。在每个活细胞中，这种脱氨在生理条件下每天发生100-500次1，2。如果这些改变没有得到修复，DNA序列组成可能会发生变化，从而导致突变。由于DNA中的尿嘧啶在复制过程中更喜欢与dATP配对，如果胞嘧啶脱氨为尿嘧啶，在两个复制事件中，在一半的后代DNA3中将出现新的G：C到A：T过渡突变。
在维持遗传稳定性的细胞策略中，碱基切除修复（BER）是修复DNA4中受损碱基（如尿嘧啶）的重要机制。BER是一个高度进化保守的过程。有两种常见的 BER 通路：短贴片通路，通向单个核苷酸的修复束，以及产生至少两个核苷酸修复束的长贴片通路5。BER 是一种协调机制，分几个步骤进行。BER的第一步是通过损伤特异性DNA糖基酶水解受损的核苷酸碱基，以产生阳极/嘧啶（AP）中间位点6。随后，通过核酸内切酶在AP位点切割糖磷酸主链，通过裂解酶清除DNA末端，通过DNA聚合酶填充间隙，并通过连接酶密封最终的缺口5。
尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）从含有尿嘧啶的DNA中水解尿嘧啶，用于大肠杆菌中的BER。使用放射性标记DNA的传统UDG测定涉及不同的分离技术6，7，8，9，10，11，12，13通常耗时，劳动密集型，标记试剂昂贵，程序复杂，并且需要强化培训和实践以降低暴露于放射性物质的风险。除了分子信标和Förster共振能量转移技术15，16，17，18，19，20之外，荧光定量寡核苷酸测定已被开发出来作为放射性同位素标记的替代品14。但是，上述所有方法都需要特定的标签。最近开发了无标记生物传感器测定法21，22，23和基于G-四链体24，25，26形成的比色方法。然而，探针中的多个A：U对或专门设计的序列使酶单元定义复杂化。
MALDI-TOF MS是一种在DNA分析中可能非常有用的技术。开发的应用包括单核苷酸多态性基因分型27，28，修饰核苷酸分析29和DNA修复中间体鉴定30，31，32，33，34。应易于用于DNA糖基化酶分析的MALDI-TOF MS，以检测含AP位点的DNA产物。然而，在许多实验条件下，DNA中的AP位点容易断裂33。这里介绍了一种UDG测定，使用MALDI-TOF MS直接测量AP位点的产生，没有明显的断链噪声。这种无标记方法易于使用，并且在DNA糖基化酶抑制剂筛选的药物应用中具有很高的潜力。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)</td>
			<td>J.T baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved deionized water</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>AQUAGLOVE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2,3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(0.5-10 &#181;L)</td>
			<td>extra gene</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(1,250 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(200 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 4, 5 
			Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td>RS1000</td>
			<td>Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Clubio</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>National scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P1000)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P2)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P10)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P100)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P200)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (SL2)</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Singapore)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quest Graph IC50 Calculator (v.1)</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Fig. 4 
			https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>WAKO</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCHIP array</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#01509</td>
			<td>Protocol 3, 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typer 4.0 software</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#10145</td>
			<td>Protocol 6 
			Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDG Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>B0280S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil Glycosylase Inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0281S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil-DNA Glycosylase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0280L</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis

尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）是碱基切除修复途径中的关键成分，用于校正由胞嘧啶水解脱氨形成的尿嘧啶。因此，它对于基因组完整性的维持至关重要。开发了一种高度特异性，无标记，非放射性同位素的方法来测量UDG活性。UDG切割含有位点特异性尿嘧啶的合成DNA双链体，然后进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析。建立了一种方案来保存DNA中的apurinic/apyrimidinic位点（AP）产物而不会断裂。利用底物到产物的m/z值变化来评价UGG对尿嘧啶的水解作用。使用G：U底板进行UDG动力学分析，得到Km = 50 nM，Vmax = 0.98 nM /s，Kcat = 9.31 s-1。将该方法应用于尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）测定，IC50值为7.6 pM。在单链和双链DNA底物中不同位置使用尿嘧啶的UDG特异性显示出不同的切割效率。因此，这种简单，快速和多功能的MALDI-TOF MS方法可以成为各种单功能DNA糖基化酶的极好参考方法。它还具有作为DNA糖基化酶抑制剂筛选工具的潜力。

模板和基材 以以U为中心（U+9）的合成寡核苷酸与G模板配对为例（图1A），对模板和含尿嘧啶的底物的等摩尔量的空白控制可用于合成寡核苷酸纯度的质量控制（图1B;信号与指定的m/ z和低背景噪声相匹配）。对于MS数据分析，测量了峰高（图2）。预计19 nt模板DNA在糖基化酶水解后保持不变;因此，该信号可以作为AP产...

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Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

使用MALDI-TOF质谱法开发了一种非标记，非放射性同位素方法来测定尿嘧啶-DNA糖基化酶活性，用于直接分析含阳离子/嘧啶位点的产品。该测定被证明是非常简单，特异性，快速且易于使用的DNA糖基化酶测量。

尿嘧啶-DNA糖基化酶测定，采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

DNA修复机制对于维持所有生物体的基因组完整性非常重要。尿嘧啶-DNA糖基化酶是基本组织修复途径中至关重要的DNA修复蛋白。使用MALDI-TOF质谱法，我们可以直接检测AP产物用于酶活性测定。传统的糖基化酶测定需要底物劳动。该方法无需标记，可直接检测从尿嘧啶底物到AP产物的质量变化。其他优点包括高特异性、多功能性、可扩展性、快速性和易于执行。我们以大肠杆菌尿嘧啶-DNA糖基化酶为例。该方法可以很容易地被修改用于其他DNA糖基化酶测定。训练有素的实验室人员具有准确的移液和稀释技能至关重要。应使用新鲜制备的试剂和低盐缓冲液，以获得更好的信号和更小的背景噪声。演示该程序的将是来自我实验室的博士生Hui-Lan Chang。对于使用T1 U + 9双链鸟嘌呤 - 尿嘧啶碱基底物的DNA糖基化酶测定，在1.5毫升无菌微量离心管中加入70微升水，10微升10X尿嘧啶 - DNA糖基化酶或UDG反应缓冲液，5微升T1储备和5微升U + 9储备。关闭管子，然后在65摄氏度的水浴中孵育30分钟，然后在37摄氏度下孵育30分钟，最后在冰上三分钟，以确保基板模板双相正确退火。接下来，在新的1.5毫升管中，加入49微升冰冷的UDG反应缓冲液和一微升稀释的UDG，然后用UDG缓冲液制备连续稀释液以获得所需的酶浓度，并将稀释的UDG放在冰上。接下来，在另一个1.5毫升的管中，加入9微升制备的底物混合物，并在37摄氏度下预热，然后加入一微升稀释的UDG并轻拂管以混合内容物。短暂离心反应混合物并立即将管置于37摄氏度下孵育。使用计时器对反应进行计时。为了终止反应，制备0.25摩尔盐酸和0.23摩尔三碱溶液。在制备试剂时，使用pH计确认pH值，并在操作反应终止步骤之前通过pH条进行测试，然后用一微升0.25摩尔盐酸化10微升tris-EDTA，并确保pH值约为2正负0.5。用一微升tris碱中和溶液，并确保最终pH值约为6.5正负0.5。接下来，向反应混合物中加入一微升0.25摩尔盐酸以灭活酶并将管放在冰上六分钟，然后加入一微升tris碱以中和DNA产物并避免AP位点因长时间暴露于酸而破裂。加入13微升tris-EDTA以增加用于基质芯片转移的产物混合物的体积后，将管放在冰上。最后，将所有25微升UDG反应产物从微量离心管转移到384孔微量滴定板中。打开纳升分配器的门，将384孔微量滴定板加载到甲板的板架上，然后将基质芯片阵列插入相应的侦察板位置。将装载的侦察板放在纳升分配器的处理甲板上，然后关闭门。触摸转印屏幕上的运行按钮，等待仪器开始将样品从微量滴定板分配到基质芯片。接下来，使用视觉选项卡选项，在点胶过程中显示芯片的图像和每个点的点胶量。确保芯片上的斑点体积在5到10纳升的范围内。使用适当的应用程序，准备一个包含预测信号 M x Z 值的 xlsx 文件以进行导入。然后使用应用程序创建和定义新的UDG测定，方法是右键单击设计器格式的导入测定组选项，并从下拉列表中选择Excel文件。接下来，右键单击客户项目板按钮，然后单击下拉选项树的顶部以建立新的测定板。然后在对话框中，键入文件名。在板类型下拉列表中，选择384孔板类型。按确定，然后等待屏幕右侧出现空白板。接下来，单击检测选项，然后从下拉列表中选择检测方法。要将所选检测方法分配给板上的每个样品点位置，请将光标移动到空白板的每个位置，单击以突出显示孔，然后单击以选择添加斑块。使用台式机或笔记本电脑，为芯片上的所有样本准备xlsx格式的工作列表，没有标题，然后单击添加新的示例项目按钮并从下拉列表中选择文件以导入工作列表。在屏幕左侧的工作列表中查找所有测试示例代码，然后单击工作列表中的示例代码并右键单击板的相应位置以将测试链接到每个位置。按下质谱仪的输入/输出按钮以扩展甲板并取出芯片支架。将样品芯片插入芯片支架，将装载的芯片支架放在扩展的甲板上，然后再次按下输入/输出按钮，以便样品芯片进入仪器。在质谱仪控制程序中，双击采集图标。在采集窗口中，单击自动运行选项卡以启动仪器并从芯片上的样品中获取质谱。对于数据分析，请运行数据分析程序，然后浏览数据库树并选择芯片ID。单击以突出显示芯片上的目标井，然后单击光谱图标以显示质谱。右键单击以选择自定义对话框并在新窗口中裁剪特定频谱范围，然后单击x轴以键入M x Z的上限和下限，然后按OK显示指定范围的频谱，包括感兴趣的信号。要测量信号M的峰值高度，Z值对应于尿嘧啶底物，AP积和模板，请单击峰值并在屏幕左上角查看峰值高度。最后，要保存频谱以进行记录保存，请右键单击导出并在下拉列表中选择文件类型为JPEG。单击目标并浏览磁盘以在下拉列表中选择存储设备，然后键入文件名并单击导出。此处显示了用于 DNA 糖基化酶测定的模型系统。19个核苷酸模板DNA在糖基化酶水解后保持不变。因此，该信号可以作为AP产品定量的参考。底物和相应模板之间一个核苷酸的差异为两者产生了一个分离良好的信号曲线。AP产物的信号也与含尿嘧啶的底物的信号很好地分离。对于MS数据分析，测量了峰高。UDG 活性在 0.01、0.02、0.05 和 0.1 的时间过程分析表明剂量和时间依赖性。这里显示了产物和底物在纳摩尔浓度下具有相对MS信号强度的反应速率图的示例。UDG反应速率表示为每秒产生的AP位点的纳摩尔。KM 和 VMAX 是根据 Lineweaver Burk 图计算得出的。MALDI-TOF质谱测量单位与定义的单位成正比，从0.001单位到0.02单位，具有可观的测定系数。这里显示了尿嘧啶糖基化酶抑制剂对UDG活性的抑制。在存在100皮摩尔的抑制剂时，0.05单位的UDG的活性被抑制到检测不到的水平，并且发现IC50为7.6皮摩尔。由于 AP 大小不稳定，可在极端 pH 值和高温下通过 β 消除反应水解，因此应在规定的时间段内在冰上进行测定淬灭。此外，使用pH计确保HCL将反应缓冲液酸化至所需的pH值，并且tris碱正确中和产物混合物。该方法也可以被修改以分析双功能DNA糖基化酶。例如，U + 2 T3是甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶测定的合适底物。FPG AP连接酶活性的裂解产物可以很容易地被MALDI-TOF质量检测到。该方法有可能成为单官能糖基化酶测量的参考方法，也可以用作药物开发中糖基化酶抑制剂筛选的工具。

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