Name: uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-04-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

We danken de NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) en het NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan, R.O.C. [subsidienummer MOST109-2314-B-002 -186 naar K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 naar S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 naar W.-h.F.]. H.-L.C. is een ontvanger van een doctoraatsbeurs van de National Taiwan University. Financiering voor open access charge: Ministerie van Wetenschap en Technologie, R.O.C.

1. Voorbereiding van substraat/sjabloon
<ol><li>Ontwerp uracil substraat/sjabloon duplex met een gebalanceerd G+C gehalte van ~50 ± 10% en minimale smelttemperatuur van 50 °C voor het duplexgebied. OPMERKING: Eén nucleotideverschil tussen 18 nt substraten en 19 nt sjablonen (tabel 1 en figuur 1) helpt een betere ms-signaalinterpretatie en de juiste gloeiing. De sjabloonstreng dient als aanvullend DNA om A-U- of G-U-mismatches te genereren (ta...

Dit artikel biedt een gedetailleerde procedure voor het gebruik van een UDG MALDI-TOF MS-testmethode om AP-bevattende DNA-producten direct te detecteren. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat uracil-bevattende substraten labelvrij, schaalbaar, gemakkelijk om mee te werken zijn en meer flexibiliteit bieden in substraatontwerp.
De door de leverancier aanbevolen fenol/chloroform-extractie van UDG maakt inactivatie van het enzym mogelijk om afbraak van product-DNA te voorkomen. Het ...

Hoewel uracil een normale base is in RNA, is het een veel voorkomende en zeer mutagene laesie in genomisch DNA. Uracil kan ontstaan door spontane/enzymatische hydrolytische deaminering van een deoxycytidine. In elke levende cel vindt deze deaminering 100-500 keer per dag plaats onder fysiologische omstandigheden1,2. Als deze veranderingen niet worden gerepareerd, kan er een verandering in de samenstelling van de DNA-sequentie optreden, waardoor mutatie ontstaat. Omdat uracil in DNA de voorkeur geeft aan paring met dATP tijdens replicatie, als cytosine deaminateert naar uracil, in twee replicatiegebeurtenissen, zal er een nieuwe G: C naar A: T overgangsmutatie zijn in de helft van het nageslacht DNA3.
Onder de cellulaire strategieën om de genetische stabiliteit te behouden, is base excision repair (BER) een essentieel mechanisme dat beschadigde basen, zoals uracil, in DNA4 herstelt. BER is een zeer evolutionair geconserveerd proces. Er zijn twee algemene BER-routes: de korte-patch pathway die leidt naar een reparatiekanaal van een enkel nucleotide en de long-patch pathway die een repair tract van ten minste twee nucleotiden produceert5. BER is een gecoördineerd mechanisme dat in verschillende stappen plaatsvindt. De eerste stap in BER is de enzymatische hydrolyse van de beschadigde nucleotidebasis door een schadespecifiek DNA-glycosylase om een apurine / apyrimidinische (AP) tussenliggende plaats te genereren6. Dit wordt gevolgd door de splitsing van de suiker-fosfaat ruggengraat op de AP-site door een endonuclease, opschoning van de DNA-uiteinden door een lyase, gap-vulling door een DNA-polymerase en het afdichten van de laatste nick door een ligase5.
Uracil-DNA glycosylase (UDG) hydrolyseert het uracil uit uracil-bevattend DNA voor BER in Escherichia coli. Conventionele UDG-testen met behulp van radioactief gelabeld DNA met verschillende scheidingstechnieken6,7,8,9,10,11,12,13 zijn meestal tijdrovend, arbeidsintensief, met dure etiketteringsreagentia, gecompliceerde procedures en vereisen intensieve training en oefening om de risico's van blootstelling aan radioactieve materialen te verminderen. Fluorometrische oligonucleotide assays zijn ontwikkeld als vervanging voor radio-isotoop labeling14, naast moleculaire bakens en Förster resonantie energieoverdracht technologie15,16,17,18,19,20. Voor alle bovengenoemde methoden is echter specifieke etikettering vereist. Onlangs zijn labelvrije biosensoren getest21,22,23 en colorimetrische methoden op basis van de vorming van een G-quadruplex24,25,26. Meerdere A: U-paren of speciaal ontworpen sequenties in de sondes bemoeilijken echter de definitie van enzymeenheden.
MALDI-TOF MS is een technologie die van groot nut kan zijn bij DNA-analyse. Ontwikkelde toepassingen omvatten single-nucleotide polymorfisme genotypering27,28, gemodificeerde nucleotideanalyse29 en DNA-reparatie intermediaire identificatie30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS moet gemakkelijk worden gebruikt voor DNA-glycosylaseanalyse om AP-site-bevattende DNA-producten te detecteren. AP-sites in DNA zijn echter gevoelig voor strengbreuk onder veel experimentele omstandigheden33. Een UDG-test wordt hier gepresenteerd met behulp van MALDI-TOF MS om de productie van AP-locaties rechtstreeks te meten zonder significant strengbreukgeluid. Deze labelvrije methode is gemakkelijk om mee te werken en heeft een hoog potentieel voor de farmaceutische toepassing van DNA-glycosylaseremmerscreening.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)</td>
			<td>J.T baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved deionized water</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>AQUAGLOVE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2,3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(0.5-10 &#181;L)</td>
			<td>extra gene</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(1,250 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(200 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 4, 5 
			Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td>RS1000</td>
			<td>Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Clubio</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>National scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P1000)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P2)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P10)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P100)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P200)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (SL2)</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Singapore)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quest Graph IC50 Calculator (v.1)</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Fig. 4 
			https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>WAKO</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCHIP array</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#01509</td>
			<td>Protocol 3, 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typer 4.0 software</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#10145</td>
			<td>Protocol 6 
			Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDG Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>B0280S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil Glycosylase Inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0281S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil-DNA Glycosylase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0280L</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is een belangrijk onderdeel in de base excisie reparatie route voor de correctie van uracil gevormd door hydrolytische deaminering van cytosine. Het is dus cruciaal voor het behoud van de genoomintegriteit. Een zeer specifieke, niet-gelabelde, niet-radio-isotopische methode werd ontwikkeld om UDG-activiteit te meten. Een synthetische DNA-duplex met een site-specific uracil werd gesplitst door UDG en vervolgens onderworpen aan Matrix-assisted Laser Desorption / Ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analyse. Er werd een protocol opgesteld om het apurine/apyrimidinische site (AP) product in DNA te bewaren zonder strengbreuk. De verandering in de m/z-waarde van het substraat naar het product werd gebruikt om uracilhydrolyse door UDG te evalueren. Een G:U-substraat werd gebruikt voor UDG-kinetische analyse die de Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s en Kcat = 9,31 s-1 opleverde. Toepassing van deze methode op een uracilglycosylaseremmer (UGI)-test leverde een IC50-waarde van 7,6 pM op. De UDG-specificiteit met behulp van uracil op verschillende posities binnen enkelstrengs en dubbelstrengs DNA-substraten toonde verschillende splitsingsefficiënties. Deze eenvoudige, snelle en veelzijdige MALDI-TOF MS-methode zou dus een uitstekende referentiemethode kunnen zijn voor verschillende monofunctionele DNA-glycosylasen. Het heeft ook het potentieel als een hulpmiddel voor DNA-glycosylaseremmer screening.

Sjablonen en substraten Met synthetische oligonucleotiden met U in het midden (U+9) in combinatie met een G-sjabloon als voorbeeld (figuur 1A), kan een blanco controle van equimolaire hoeveelheden sjabloon- en uracilbevattend substraat worden gebruikt voor kwaliteitscontrole van synthetische oligonucleotidezuiverheid (figuur 1B; de signalen komen overeen met de aangewezen m /z en de lage achtergrondruis). Voor de MS-data-analyse zijn de piekh...

Watch this Scientific Journal Video about Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Een niet-gelabelde, niet-radio-isotopische methode om uracil-DNA glycosylase activiteit te testen werd ontwikkeld met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie voor directe apurine / apyrimidinische site-bevattende productanalyse. De test bleek vrij eenvoudig, specifiek, snel en gemakkelijk te gebruiken voor DNA-glycosylasemeting.

Uracil-DNA Glycosylase Assay door Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

DNA-reparatiemechanismen zijn erg belangrijk voor het behoud van de genoomintegriteit in alle levende organismen. Uracil-DNA glycosylase is een cruciaal DNA-reparatie-eiwit in de basisweefselherstelroute. Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie kunnen we AP-producten direct detecteren voor enzymactiviteitstests.Conventionele glycosylase-assay vereist substraatarbeid. Deze methode is labelvrij en detecteert direct de massaverandering van een uracilsubstraat naar AP-product. Andere voordelen zijn hoge specificiteit, veelzijdigheid, schaalbaarheid, snelheid en eenvoudig uit te voeren.We hebben E.coli uracil-DNA glycosylase als voorbeeld gebruikt. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor andere DNA-glycosylase-assays. Goed opgeleid laboratoriumpersoneel met nauwkeurige pipetteer- en verdunningsvaardigheden zijn essentieel.Vers bereide reagentia en zoutbuffers met een laag zoutgehalte moeten worden gebruikt voor betere signalen en minder achtergrondgeluid. De procedure wordt gedemonstreerd door Hui-Lan Chang, een promovendus uit mijn laboratorium. Voeg voor een DNA-glycosylasetest met behulp van guanine-uracilbasisdragend substraat van T1 U +9 duplex 70 microliter water, 10 microliter 10X uracil-DNA glycosylase of UDG-reactiebuffer, vijf microliter T1-voorraad en vijf microliter U +9-voorraad toe in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Sluit de buis voordat u deze gedurende 30 minuten in een waterbad bij 65 graden Celsius broedt, gevolgd door 30 minuten bij 37 graden Celsius en ten slotte drie minuten op ijs om een goede gloeiing van de substraatsjabloon duplex te garanderen. Voeg vervolgens in een nieuwe buis van 1,5 milliliter 49 microliter ijskoude UDG-reactiebuffer en één microliter verdund UDG toe, bereid vervolgens seriële verdunningen voor met de UDG-buffer voor de gewenste enzymconcentraties en plaats de verdunde UDG op ijs. Voeg vervolgens in een andere buis van 1,5 milliliter negen microliter van het bereide substraatmengsel toe en verwarm het voor op 37 graden Celsius, voeg vervolgens een microliter van het verdunde UDG toe en veeg de buis om de inhoud te mengen.Centrifugeer het reactiemengsel kort en plaats de buis onmiddellijk voor incubatie bij 37 graden Celsius. Gebruik de timer om de reactie te timen. Bereid voor reactiebeëindiging 0,25 molair zoutzuur en 0,23 molaire tris base-oplossing voor.Gebruik de pH-meter om de pH te bevestigen bij het bereiden van het reagens en het testen met een pH-strip voordat u de reactie-beëindigingsstap uitvoert, verzuur vervolgens 10 microliter tris-EDTA met één microliter van 0,25 molair zoutzuur en zorg ervoor dat de pH ongeveer twee plus of min 0,5 is. Neutraliseer de oplossing met één microliter tris-base en zorg ervoor dat de uiteindelijke pH ongeveer 6,5 plus of min 0,5 is. Voeg vervolgens een microliter van 0,25 molair zoutzuur toe aan het reactiemengsel om het enzym te inactiveren en plaats de buis gedurende zes minuten op ijs, voeg vervolgens één microliter tris base toe om de DNA-producten te neutraliseren en te voorkomen dat de AP-site breekt door langdurige blootstelling aan zuur.Na het toevoegen van 13 microliter tris-EDTA om het volume van het productmengsel te vergroten voor matrixchipoverdracht, plaatst u de buis op ijs. Breng ten slotte alle 25 microliter UDG-reactieproducten over van microcentrifugebuizen naar een 384-well microtiterplaat. Open de deur van de nanoliterdispenser en laad de 384-well microtiterplaat op de plaathouder van het dek en plaats vervolgens de matrixchiparray in de overeenkomstige verkennerplaatpositie.Plaats de geladen scoutingplaat op het verwerkingsdek van de nanoliterdispenser en sluit de deur. Raak de run-knop op het overdrachtsscherm aan en wacht tot het instrument begint met het doseren van monsters van de microtiterplaat naar de matrixchip. Gebruik vervolgens de optie vision tab om het beeld van de chip en de doseervolumes voor elke plek tijdens het doseren weer te geven.Zorg ervoor dat het gevlekte volume op de chip zich in het bereik van vijf tot 10 nanoliter bevindt. Bereid met behulp van het juiste toepassingsprogramma een xlsx-bestand voor met de voorspelde signaal M door Z-waarde voor het importeren. Gebruik vervolgens het toepassingsprogramma om een nieuwe UDG-test te maken en te definiëren door met de rechtermuisknop op de optie importtestgroep in ontwerpindeling te klikken en het Excel-bestand in de vervolgkeuzelijst te selecteren.Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de knop klantprojectplaat en klik bovenaan de vervolgkeuzelijst om een nieuwe testplaat vast te stellen. Typ vervolgens in het dialoogvenster een bestandsnaam. En selecteer in de vervolgkeuzelijst plaattype het type plaat met 384 putten.Druk op OK en wacht tot er een lege plaat aan de rechterkant van het scherm verschijnt. Klik vervolgens op de testoptie en selecteer de test in de vervolgkeuzelijst. Als u de geselecteerde test wilt toewijzen aan elke positie van de monstervlek op de plaat, verplaatst u de cursor naar elke positie van de lege plaat, klikt u om de put te markeren en klikt u met de rechtermuisknop om plaques toevoegen te selecteren.Maak met behulp van een desktop- of laptopcomputer een werklijst in xlsx-indeling zonder koptekst voor alle voorbeelden op de chip, klik vervolgens op de knop Nieuw voorbeeldproject toevoegen en selecteer het bestand in de vervolgkeuzelijst om de werklijst te importeren. Zoek naar alle testmonstercodes in de werklijst aan de linkerkant van het scherm, klik vervolgens op een voorbeeldcode in de werklijst en klik met de rechtermuisknop op de overeenkomstige positie van de plaat om de tests aan elke positie te koppelen. Druk op de in/uit-knop van de massaspectrometer om het dek uit te breiden en de spaanhouder eruit te halen.Steek de monsterchip in de chiphouder, plaats de geladen spaanhouder op het verlengde dek en druk nogmaals op de in/uit-knop zodat de samplechip het instrument kan betreden. Dubbelklik in het besturingsprogramma van de massaspectrometer op het pictogram Acquire. Klik in het acquire-venster op het tabblad auto-run om het instrument te starten en massaspectra te verkrijgen van de monsters op de chip.Voor gegevensanalyse voert u het gegevensanalyseprogramma uit, bladert u door de databasestructuur en selecteert u de chip-ID.Klik om een doelvak op de chip te markeren en klik op het spectrumpictogram om het massaspectrum weer te geven. Klik met de rechtermuisknop om het aanpassingsdialoogvenster te kiezen en een specifiek spectrumbereik bij te snijden in een nieuw venster, klik vervolgens op de x-as om de boven- en ondergrenzen van M bij Z te typen en druk op OK om het opgegeven bereikspectrum weer te geven, inclusief de signalen van belang. Om de piekhoogte van de M bij Z-waarden te meten die overeenkomen met het uracilsubstraat, AP-product en sjabloon, klikt u op de piek en bekijkt u de piekhoogte in de linkerbovenhoek van het scherm.Ten slotte, om het spectrum op te slaan voor het bijhouden van gegevens, klikt u met de rechtermuisknop op exporteren en selecteert u bestandstype als JPEG in de vervolgkeuzelijst. Klik op bestemming en blader door de schijf om het opslagapparaat in de vervolgkeuzelijst te selecteren, typ vervolgens de bestandsnaam en klik op exporteren. Het modelsysteem voor een DNA-glycosylasetest wordt hier getoond.Het 19 nucleotide template DNA bleef onveranderd na glycosylase hydrolyse. Daarom zou het signaal kunnen dienen als referentie voor de kwantificering van het AP-product. Het verschil van één nucleotide tussen het substraat en de bijbehorende sjabloon leverde voor beide een goed gescheiden signaalprofiel op.Het signaal van het AP-product was ook goed gescheiden van dat van het uracil-bevattende substraat. Voor MS-data-analyse werden de piekhoogtes gemeten. Tijdsverloopanalyse voor UDG-activiteit bij 0,01, 0,02, 0,05 en 0,1 toonde zowel dosis- als tijdsafhankelijkheid aan.Een voorbeeld van een reactiesnelheidsgrafiek met relatieve MS-signaalintensiteiten van het product en substraat in nanomolaire concentraties wordt hier getoond. De UDG-reactiesnelheid wordt gepresenteerd als nanomol van de AP-site die per seconde wordt geproduceerd. De KM en VMAX werden berekend op basis van de Lineweaver Burk plot.De gemeten eenheid van de MALDI-TOF-massaspectrometrie was evenredig met de gedefinieerde eenheid van 0,001 eenheden tot 0,02 eenheden met een merkbare bepalingscoëfficiënt. De remming van UDG-activiteit door een uracilglycosylaseremmer wordt hier getoond. In aanwezigheid van 100 picomol van de remmer werd de activiteit van 0,05 eenheden UDG geremd tot een niet-detecteerbaar niveau en bleek de IC50 7,6 picomol te zijn.Aangezien de AP-grootte labiel is en kan worden gehydrolyseerd door een bèta-eliminatiereactie bij extreme pH en verhoogde temperatuur, moet het blussen van de test gedurende de gedefinieerde periode op ijs worden uitgevoerd. Gebruik ook een pH-meter om ervoor te zorgen dat HCL de reactiebuffer verzuurt tot de gewenste pH en tris base het productmengsel goed neutraliseert. Deze methode kan ook worden aangepast om bifunctioneel DNA-glycosylase te analyseren.U+2 T3 is bijvoorbeeld een geschikt substraat voor formamidopyrimidine DNA glycosylase assay. De splitsingsproducten van FPG AP ligase activiteit kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd door MALDI-TOF massa. Deze methode heeft het potentieel om de referentiemethode te worden voor monofunctionele glycosylasemeting en kan ook worden gebruikt als een hulpmiddel voor glycosylaseremmerscreening voor farmaceutische ontwikkeling.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteoomanalyses van de extracellulaire matrix: Een methode voor Intact Glycopeptide analyse met behulp van massaspectrometrie

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...