Name: uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-04-22T14:00:00
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Nous remercions le Centre intégré de génomique fonctionnelle du NCFPB (Taipei, Taïwan) et le Laboratoire de pharmacogénomique du NRPB (Taipei, Taïwan) pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et de la Technologie, Taiwan, R.O.C. [numéro de subvention MOST109-2314-B-002 -186 à K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 à S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 à W.-h.F.]. H.-L.C. est récipiendaire d’une bourse de doctorat de l’Université nationale de Taiwan. Financement de la redevance pour le libre accès : Ministère des sciences et de la technologie, R.O.C.

1. Préparation du substrat/gabarit
<ol><li>Concevez un substrat d’uracile / gabarit duplex avec une teneur équilibrée en G + C d’environ 50 ± 10% et une température de fusion minimale de 50 ° C pour la région duplex. REMARQUE : Une différence de nucléotide entre les substrats de 18 nt et les gabarits de 19 nt (tableau 1 et figure 1) permet une meilleure interprétation du signal MS et un recuit approprié. Le brin modèle sert d’ADN compl...

Cet article fournit une procédure détaillée pour l’utilisation d’une méthode de dosage UDG MALDI-TOF MS pour détecter directement les produits d’ADN contenant de l’AP. Les principaux avantages de cette méthode sont que les substrats contenant de l’uracile sont sans étiquette, évolutifs, faciles à travailler et offrent une plus grande flexibilité dans la conception du substrat.
L’extraction phénol/chloroforme recommandée par le fournisseur UDG permet l’inactivation de ...

Bien que l’uracile soit une base normale dans l’ARN, il s’agit d’une lésion commune et hautement mutagène dans l’ADN génomique. L’uracile peut résulter d’une désamination hydrolytique spontanée/enzymatique d’une désoxycytidine. Dans chaque cellule vivante, cette désamination se produit 100 à 500 fois par jour dans des conditions physiologiques1,2. Si ces altérations ne sont pas réparées, il peut y avoir un changement dans la composition de la séquence d’ADN, provoquant une mutation. Comme l’uracile dans l’ADN préfère s’apparier avec le dATP pendant la réplication, si la cytosine se désamine en uracile, dans deux événements de réplication, il y aura une nouvelle mutation de transition G:C à A:T dans la moitié de l’ADN de la descendance3.
Parmi les stratégies cellulaires pour maintenir la stabilité génétique, la réparation de l’excision de base (BER) est un mécanisme essentiel qui répare les bases endommagées, telles que l’uracile, dans l’ADN4. Le BER est un processus hautement conservé sur le plan de l’évolution. Il existe deux voies BER générales : la voie à patch court menant à un tractus de réparation d’un seul nucléotide et la voie à long patch qui produit un tractus de réparation d’au moins deux nucléotides5. Le BER est un mécanisme coordonné qui se déroule en plusieurs étapes. La première étape du BER est l’hydrolyse enzymatique de la base nucléotidique endommagée par une glycosylase d’ADN spécifique aux dommages pour générer un site intermédiaire purinique/apyrimidinique (AP)6. Ceci est suivi par le clivage de l’épine dorsale sucre-phosphate sur le site AP par une endonucléase, le nettoyage des extrémités de l’ADN par une lyase, le remplissage de l’espace par une ADN polymérase et le scellement de l’entaille finale par une ligase5.
L’uracile-ADN glycosylase (UDG) hydrolyse l’uracile à partir de l’ADN contenant de l’uracile pour le BER chez Escherichia coli. Les tests UDG conventionnels utilisant de l’ADN radiomarqué impliquant différentes techniques de séparation6,7,8,9,10,11,12,13 prennent généralement beaucoup de temps, demandent beaucoup de main-d’œuvre, avec des réactifs d’étiquetage coûteux, des procédures compliquées et nécessitent une formation et une pratique intensives pour réduire les risques d’exposition aux matières radioactives. Des dosages fluorométriques d’oligonucléotides ont été développés en remplacement du marquage des radio-isotopes14, en plus des balises moléculaires et de la technologie de transfert d’énergie par résonance de Förster15,16,17,18,19,20. Cependant, un étiquetage spécifique est requis pour toutes les méthodes susmentionnées. Récemment, des tests de biocapteurs sans étiquette21,22,23 et des méthodes colorimétriques basées sur la formation d’un G-quadruplex24,25,26 ont été développés. Cependant, plusieurs paires A:U ou séquences spécialement conçues dans les sondes compliquent la définition de l’unité enzymatique.
MALDI-TOF MS est une technologie qui pourrait être d’une grande utilité dans l’analyse de l’ADN. Les applications développées comprennent le génotypage du polymorphisme mononucléotidique27,28, l’analyse de nucléotides modifiés29 et l’identification intermédiaire de réparation de l’ADN30,31,32,33,34. Maldi-TOF MS devrait être facilement adopté pour l’analyse de l’ADN glycosylase afin de détecter les produits d’ADN contenant du site AP. Cependant, les sites AP dans l’ADN sont sujets à la rupture des brins dans de nombreuses conditions expérimentales33. Un test UDG est présenté ici en utilisant MALDI-TOF MS pour mesurer directement la production du site AP sans bruit de rupture de brin significatif. Cette méthode sans étiquette est facile à utiliser et présente un potentiel élevé pour l’application pharmaceutique du dépistage des inhibiteurs de l’ADN glycosylase.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)</td>
			<td>J.T baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved deionized water</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>AQUAGLOVE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2,3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(0.5-10 &#181;L)</td>
			<td>extra gene</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(1,250 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(200 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 4, 5 
			Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td>RS1000</td>
			<td>Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Clubio</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>National scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P1000)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P2)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P10)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P100)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P200)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (SL2)</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Singapore)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quest Graph IC50 Calculator (v.1)</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Fig. 4 
			https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>WAKO</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCHIP array</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#01509</td>
			<td>Protocol 3, 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typer 4.0 software</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#10145</td>
			<td>Protocol 6 
			Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDG Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>B0280S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil Glycosylase Inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0281S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil-DNA Glycosylase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0280L</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis

L’uracile-ADN glycosylase (UDG) est un composant clé de la voie de réparation de l’excision de base pour la correction de l’uracile formé à partir de la désamination hydrolytique de la cytosine. Ainsi, il est crucial pour le maintien de l’intégrité du génome. Une méthode très spécifique, non étiquetée et non radio-isotopique a été développée pour mesurer l’activité UDG. Un duplex d’ADN synthétique contenant un uracile spécifique au site a été clivé par UDG, puis soumis à une analyse de spectrométrie de masse à temps de vol MALDI-TOF MS (MalDI-TOF MS) assistée par laser assistée par matrice. Un protocole a été établi pour préserver le produit du site purinique/apyrimidinique (AP) dans l’ADN sans rupture de brin. La variation de la valeur m/z du substrat au produit a été utilisée pour évaluer l’hydrolyse de l’uracile par UDG. Un substrat G:U a été utilisé pour l’analyse cinétique UDG donnant le Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s et Kcat = 9,31 s-1. L’application de cette méthode à un essai d’inhibiteur de l’uracile glycosylase (UGI) a donné une valeur IC50 de 7,6 pM. La spécificité de l’UDG utilisant l’uracile à différentes positions dans les substrats d’ADN simple brin et double brin a démontré différentes efficacités de clivage. Ainsi, cette méthode SIMPLE, rapide et polyvalente MALDI-TOF MS pourrait être une excellente méthode de référence pour diverses glycosylases d’ADN monofonctionnelles. Il a également le potentiel d’être un outil pour le dépistage des inhibiteurs de l’ADN glycosylase.

Modèles et substrats En prenant des oligonucléotides synthétiques avec U au centre (U + 9) associés à un gabarit G à titre d’exemple (Figure 1A), un contrôle à blanc des quantités équimolaires de substrat contenant du gabarit et de l’uracile peut être utilisé pour le contrôle de la qualité de la pureté des oligonucléotides synthétiques (Figure 1B; les signaux correspondent au m / z désigné et au faible bruit de fond). P...

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Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Une méthode non marquée et non radio-isotopique pour tester l’activité de l’uracile-ADN glycosylase a été mise au point à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour l’analyse directe du produit contenant un site apurinique/apyrimidinique. Le test s’est avéré assez simple, spécifique, rapide et facile à utiliser pour la mesure de l’ADN glycosylase.

Dosage de la glycosylase uracile-ADN par désorption laser assistée par matrice / ionisation Analyse par spectrométrie de masse au temps de vol

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

Les mécanismes de réparation de l’ADN sont très importants pour maintenir l’intégrité du génome dans tous les organismes vivants. L’uracile-ADN glycosylase est une protéine de réparation de l’ADN cruciale dans la voie de réparation des tissus de base. En utilisant la spectrométrie de masse MALDI-TOF, nous pouvons détecter directement le produit AP pour le dosage de l’activité enzymatique.Le dosage conventionnel de la glycosylase nécessite un travail du substrat. Cette méthode est sans étiquette et détecte directement le changement de masse d’un substrat d’uracile à un produit AP. Parmi les autres avantages, citons la spécificité élevée, la polyvalence, l’évolutivité, la rapidité et la facilité d’exécution.Nous avons utilisé E.coli uracile-ADN glycosylase comme exemple. Cette méthode peut être facilement modifiée pour d’autres tests d’ADN glycosylase. Un personnel de laboratoire bien formé avec des compétences précises en pipetage et en dilution est essentiel.Des réactifs fraîchement préparés et des tampons à faible teneur en sel doivent être utilisés pour de meilleurs signaux et un bruit de fond moindre. Hui-Lan Chang, un doctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour un dosage de l’ADN glycosylase utilisant un substrat de base guanine-uracile de T1 U+9 duplex, ajoutez 70 microlitres d’eau, 10 microlitres de 10X glycosylase uracile-ADN ou tampon de réaction UDG, cinq microlitres de stock T1 et cinq microlitres de stock U+9 dans un tube microcentrifuge stérile de 1,5 millilitre.Fermez le tube avant de l’incuber au bain-marie pendant 30 minutes à 65 degrés Celsius, puis 30 minutes à 37 degrés Celsius, et enfin sur de la glace pendant trois minutes pour assurer un recuit correct du duplex du gabarit de substrat. Ensuite, dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, ajoutez 49 microlitres de tampon de réaction UDG glacé et un microlitre d’UDG dilué, puis préparez des dilutions en série avec le tampon UDG pour les concentrations enzymatiques souhaitées et placez l’UDG dilué sur de la glace. Ensuite, dans un autre tube de 1,5 millilitre, ajoutez neuf microlitres du mélange de substrat préparé et préchauffez-le à 37 degrés Celsius, puis ajoutez un microlitre de l’UDG dilué et faites glisser le tube pour mélanger le contenu.Centrifugez brièvement le mélange réactionnel et placez le tube immédiatement pour l’incubation à 37 degrés Celsius. Utilisez la minuterie pour chronométrer la réaction. Pour la fin de la réaction, préparer 0,25 molaire d’acide chlorhydrique et 0,23 solution molaire de base tris.Utilisez le pH-mètre pour confirmer le pH lors de la préparation du réactif et testez par bande de pH avant d’opérer l’étape de fin de la réaction, puis acidifiez 10 microlitres de tris-EDTA avec un microlitre d’acide chlorhydrique molaire 0,25 et assurez-vous que le pH est d’environ deux plus ou moins 0,5. Neutraliser la solution avec un microlitre de base de tris et s’assurer que le pH final est d’environ 6,5 plus ou moins 0,5. Ensuite, ajoutez un microlitre d’acide chlorhydrique 0,25 molaire au mélange réactionnel pour inactiver l’enzyme et placez le tube sur de la glace pendant six minutes, puis ajoutez un microlitre de base tris pour neutraliser les produits de l’ADN et éviter la rupture du site AP par une exposition prolongée à l’acide.Après avoir ajouté 13 microlitres de tris-EDTA pour augmenter le volume du mélange de produits pour le transfert de puce matricielle, placez le tube sur de la glace. Enfin, transférez tous les produits de réaction UDG de 25 microlitres des tubes de microcentrifugation vers une plaque de microtitrage de 384 puits. Ouvrez la porte du distributeur de nanolitres et chargez la plaque de microtitrage de 384 puits sur le support de plaque du pont, puis insérez le réseau de puces matricielles dans la position de plaque de reconnaissance correspondante.Placez la plaque de reconnaissance chargée sur le pont de traitement du distributeur de nanolitres et fermez la porte. Appuyez sur le bouton de course sur l’écran de transfert et attendez que l’instrument commence à distribuer des échantillons de la plaque de microtitrage à la puce matricielle. Ensuite, à l’aide de l’option de l’onglet vision, affichez l’image de la puce et les volumes de distribution pour chaque endroit pendant la distribution.Assurez-vous que le volume tacheté sur la puce est compris entre cinq et 10 nanolitres. À l’aide du programme d’application approprié, préparez un fichier xlsx contenant la valeur prédite du signal M par Z pour l’importation. Utilisez ensuite le programme d’application pour créer et définir un nouveau test UDG en cliquant avec le bouton droit sur l’option Importer le groupe de tests au format concepteur et en sélectionnant le fichier Excel dans la liste déroulante.Ensuite, cliquez avec le bouton droit sur le bouton de la plaque de projet client et cliquez en haut de l’arborescence des options déroulantes pour établir une nouvelle plaque de test. Ensuite, dans la boîte de dialogue, tapez un nom de fichier. Et dans la liste déroulante type de plaque, sélectionnez le type de plaque à 384 puits.Appuyez sur OK et attendez qu’une plaque vierge apparaisse à droite de l’écran. Ensuite, cliquez sur l’option de test et sélectionnez le test dans la liste déroulante. Pour affecter le dosage sélectionné à chaque position de point d’échantillon sur la plaque, déplacez le curseur sur chaque position de la plaque vierge, cliquez pour mettre en surbrillance le puits, puis cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner Ajouter des plaques.À l’aide d’un ordinateur de bureau ou portable, préparez une liste de travail au format xlsx sans en-tête pour tous les exemples de la puce, puis cliquez sur le bouton Ajouter un nouvel exemple de projet et sélectionnez le fichier dans la liste déroulante pour importer la liste de travail. Recherchez tous les exemples de codes de test dans la liste de travail à gauche de l’écran, puis cliquez sur un exemple de code dans la liste de travail et cliquez avec le bouton droit de la souris sur la position correspondante de la plaque pour lier les tests à chaque position. Appuyez sur le bouton d’entrée / sortie du spectromètre de masse pour étendre le pont et retirer le porte-puce.Insérez la puce d’échantillon dans le porte-puce, placez le porte-puce chargé sur le pont étendu et appuyez à nouveau sur le bouton d’entrée / sortie pour que la puce d’échantillon pénètre dans l’instrument. Dans le programme de contrôle du spectromètre de masse, double-cliquez sur l’icône d’acquisition. Dans la fenêtre d’acquisition, cliquez sur l’onglet Exécution automatique pour démarrer l’instrument et acquérir des spectres de masse à partir des échantillons de la puce.Pour l’analyse des données, exécutez le programme d’analyse des données, puis parcourez l’arborescence de la base de données et sélectionnez l’ID de la puce.Cliquez pour mettre en surbrillance un puits cible sur la puce et cliquez sur l’icône de spectre pour afficher le spectre de masse. Cliquez avec le bouton droit de la souris pour choisir la boîte de dialogue de personnalisation et recadrer une plage de spectre spécifique dans une nouvelle fenêtre, puis cliquez sur l’axe des x pour taper les limites supérieure et inférieure de M par Z et appuyez sur OK pour afficher le spectre de plage spécifié, y compris les signaux d’intérêt. Pour mesurer la hauteur de crête des signaux M par Z correspondant au substrat d’uracile, au produit AP et au modèle, cliquez sur le pic et affichez la hauteur de crête dans le coin supérieur gauche de l’écran.Enfin, pour enregistrer le spectre pour la tenue de dossiers, cliquez avec le bouton droit sur Exporter et sélectionnez le type de fichier au format JPEG dans la liste déroulante. Cliquez sur destination et parcourez le disque pour sélectionner le périphérique de stockage dans la liste déroulante, puis tapez le nom du fichier et cliquez sur exporter. Le système modèle pour un dosage de l’ADN glycosylase est présenté ici.L’ADN modèle de 19 nucléotides est resté inchangé après l’hydrolyse de la glycosylase. Par conséquent, le signal pourrait servir de référence pour la quantification du produit AP. La différence d’un nucléotide entre le substrat et le gabarit correspondant a produit un profil de signal bien séparé pour les deux.Le signal du produit AP était également bien séparé de celui du substrat contenant de l’uracile. Pour l’analyse des données sur la SEP, les hauteurs maximales ont été mesurées. L’analyse de l’évolution dans le temps pour l’activité UDG à 0,01, 0,02, 0,05 et 0,1 a démontré une dépendance à la dose et au temps.Un exemple de diagramme de la vitesse de réaction avec les intensités relatives du signal MS du produit et du substrat en concentrations nanomolaires est présenté ici. La vitesse de réaction UDG est présentée sous forme de nanomoles du site AP produites par seconde. Le KM et le VMAX ont été calculés à partir du diagramme de Burk de Lineweaver.L’unité mesurée par spectrométrie de masse MALDI-TOF était proportionnelle à l’unité définie de 0,001 unité à 0,02 unité avec un coefficient de détermination appréciable. L’inhibition de l’activité UDG par un inhibiteur de l’uracile glycosylase est montrée ici. En présence de 100 picomoles de l’inhibiteur, l’activité de 0,05 unité d’UDG a été inhibée à un niveau indétectable et la CI50 s’est avérée être de 7,6 picomoles.Étant donné que la taille du PA est labile et peut être hydrolysée par une réaction d’élimination bêta à un pH extrême et à une température élevée, la trempe du test doit être effectuée sur de la glace pendant la période définie. Utilisez également un pH-mètre pour vous assurer que HCL acidifie le tampon de réaction au pH souhaité et que la base tris neutralise correctement le mélange de produits. Cette méthode peut également être modifiée pour analyser l’ADN glycosylase bifonctionnel.Par exemple, U+2 T3 est un substrat approprié pour le dosage de l’ADN glycosylase de la formamidopyrimidine. Les produits de clivage de l’activité de la ligase FPG AP peuvent être facilement détectés par la masse MALDI-TOF. Cette méthode a le potentiel de devenir la méthode de référence pour la mesure monofonctionnelle de la glycosylase et peut également être utilisée comme outil de dépistage des inhibiteurs de la glycosylase pour le développement pharmaceutique.

Research

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