Name: uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-04-22T14:00:00
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Wir danken der NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) und dem NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan, R.O.C. unterstützt [Fördernummer MOST109-2314-B-002 -186 an K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 an S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 an W.-h.F.]. H.-L.C. ist Stipendiat der National Taiwan University. Finanzierung der Open-Access-Gebühr: Ministerium für Wissenschaft und Technologie, R.O.C.

1. Substrat-/Vorlagenvorbereitung
<ol><li>Entwerfen Sie Uracil-Substrat / Template-Duplex mit einem ausgewogenen G + C-Gehalt von ~ 50 ± 10% und einer minimalen Schmelztemperatur von 50 ° C für den Duplexbereich. HINWEIS: Ein Nukleotidunterschied zwischen 18 nt-Substraten und 19 nt-Schablonen (Tabelle 1 und Abbildung 1) trägt zu einer besseren MS-Signalinterpretation und einem geeigneten Glühen bei. Der Template-Strang dient als komplementäre DNA ...

Dieses Papier bietet ein detailliertes Verfahren für die Verwendung einer UDG MALDI-TOF MS-Assay-Methode zum direkten Nachweis von AP-haltigen DNA-Produkten. Die Hauptvorteile dieser Methode bestehen darin, dass Uracil-haltige Substrate markierungsfrei, skalierbar, einfach zu verarbeiten sind und eine größere Flexibilität im Substratdesign bieten.
Die vom UDG-Lieferanten empfohlene Phenol/Chloroform-Extraktion ermöglicht die Inaktivierung des Enzyms, um den Abbau der Produkt-DNA zu verhin...

Obwohl Uracil eine normale Base in RNA ist, ist es eine häufige und hochgradig mutagene Läsion in der genomischen DNA. Uracil kann durch spontane/enzymatische hydrolytische Desaminierung eines Desoxycytidins entstehen. In jeder lebenden Zelle tritt diese Desaminierung 100-500 Mal pro Tag unter physiologischen Bedingungen auf1,2. Wenn diese Veränderungen nicht repariert werden, kann es zu einer Veränderung der DNA-Sequenzzusammensetzung kommen, die zu einer Mutation führt. Da Uracil in der DNA es vorzieht, sich während der Replikation mit dATP zu paaren, wenn Cytosin zu Uracil deaminiert, wird es in zwei Replikationsereignissen eine neue G: C zu A: T-Übergangsmutation in der Hälfte der Nachkommen DNA3 geben.
Unter den zellulären Strategien zur Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität ist die Base Excision Repair (BER) ein wesentlicher Mechanismus, der beschädigte Basen wie Uracil in DNA4 repariert. Der BER ist ein hochgradig evolutionär konservierter Prozess. Es gibt zwei allgemeine BER-Signalwege: den Kurzfeldweg, der zu einem Reparaturtrakt eines einzelnen Nukleotids führt, und den Langfeldweg, der einen Reparaturtrakt von mindestens zwei Nukleotiden erzeugt5. Der BER ist ein koordinierter Mechanismus, der in mehreren Schritten erfolgt. Der erste Schritt im BER ist die enzymatische Hydrolyse der geschädigten Nukleotidbase durch eine schadensspezifische DNA-Glykosylase zur Erzeugung einer apurinisch/apyrimidinischen (AP) Zwischenstelle6. Es folgt die Spaltung des Zucker-Phosphat-Rückgrats an der AP-Stelle durch eine Endonuklease, die Reinigung der DNA-Endung durch eine Lyase, die Lückenfüllung durch eine DNA-Polymerase und die Versiegelung des letzten Nicks durch eine Ligase5.
Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) hydrolysiert das Uracil aus Uracil-haltiger DNA für BER in Escherichia coli. Herkömmliche UDG-Assays mit radioaktiv markierter DNA mit unterschiedlichen Trenntechniken6,7,8,9,10,11,12,13 sind in der Regel zeitaufwendig, arbeitsintensiv, mit kostspieligen Markierungsreagenzien, komplizierten Verfahren und erfordern intensive Schulungen und Übungen, um das Risiko einer Exposition gegenüber radioaktiven Stoffen zu reduzieren. Fluorometrische Oligonukleotid-Assays wurden als Ersatz für die Radioisotopenmarkierung14 entwickelt, zusätzlich zu molekularen Beacons und Förster-Resonanzenergieübertragungstechnologie15,16,17,18,19,20. Für alle oben genannten Methoden ist jedoch eine spezifische Kennzeichnung erforderlich. Kürzlich wurden markierungsfreie Biosensor-Assays21,22,23 und kolorimetrische Methoden entwickelt, die auf der Bildung eines G-Quadruplex24,25,26 basieren. Mehrere A:U-Paare oder speziell entwickelte Sequenzen in den Sonden erschweren jedoch die Definition der Enzymeinheit.
MALDI-TOF MS ist eine Technologie, die bei der DNA-Analyse von großem Nutzen sein könnte. Zu den entwickelten Anwendungen gehören die Einzelnukleotid-Polymorphismus-Genotypisierung27,28, die modifizierte Nukleotidanalyse29 und die DNA-Reparatur-Zwischenidentifikation30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS sollte leicht für die DNA-Glykosylase-Analyse eingesetzt werden, um AP-Site-haltige DNA-Produkte nachzuweisen. AP-Stellen in der DNA sind jedoch unter vielen experimentellen Bedingungen anfällig für Strangbrüche33. Hier wird ein UDG-Assay vorgestellt, der MALDI-TOF MS verwendet, um die AP-Standortproduktion ohne signifikantes Strangbruchrauschen direkt zu messen. Diese markierungsfreie Methode ist einfach zu bedienen und hat ein hohes Potenzial für die pharmazeutische Anwendung des DNA-Glykosylase-Inhibitor-Screenings.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)</td>
			<td>J.T baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved deionized water</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>AQUAGLOVE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2,3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(0.5-10 &#181;L)</td>
			<td>extra gene</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(1,250 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(200 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 4, 5 
			Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td>RS1000</td>
			<td>Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Clubio</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>National scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P1000)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P2)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P10)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P100)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P200)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (SL2)</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Singapore)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quest Graph IC50 Calculator (v.1)</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Fig. 4 
			https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>WAKO</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCHIP array</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#01509</td>
			<td>Protocol 3, 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typer 4.0 software</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#10145</td>
			<td>Protocol 6 
			Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDG Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>B0280S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil Glycosylase Inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0281S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil-DNA Glycosylase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0280L</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis

Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) ist eine Schlüsselkomponente im Reparaturweg der Basenexzision zur Korrektur von Uracil, das durch hydrolytische Desaminierung von Cytosin gebildet wird. Daher ist es entscheidend für die Aufrechterhaltung der Genomintegrität. Zur Messung der UDG-Aktivität wurde eine hochspezifische, nicht markierte, nicht-radioisotopische Methode entwickelt. Ein synthetisches DNA-Duplex, das ein ortsspezifisches Uracil enthielt, wurde von UDG gespalten und dann einer matrixgestützten Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie-Analyse (MALDI-TOF MS) unterzogen. Es wurde ein Protokoll erstellt, um das Produkt der apurinischen / apyrimidinischen Stelle (AP) in der DNA ohne Strangbruch zu erhalten. Die Änderung des m/z-Wertes vom Substrat zum Produkt wurde genutzt, um die Uracilhydrolyse mittels UDG zu bewerten. Für die kinetische UDG-Analyse wurde ein G:U-Substrat verwendet, das Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s und Kcat = 9,31 s-1 ergibt. Die Anwendung dieser Methode auf einen Uracil-Glykosylase-Inhibitor (UGI)-Assay ergab einen IC50-Wert von 7,6 pM. Die UDG-Spezifität unter Verwendung von Uracil an verschiedenen Positionen innerhalb von einzelsträngigen und doppelsträngigen DNA-Substraten zeigte unterschiedliche Spaltungseffizienzen. Somit könnte diese einfache, schnelle und vielseitige MALDI-TOF MS-Methode eine ausgezeichnete Referenzmethode für verschiedene monofunktionelle DNA-Glykosylasen sein. Es hat auch das Potenzial als Werkzeug für das DNA-Glykosylase-Inhibitor-Screening.

Schablonen und Substrate Am Beispiel synthetischer Oligonukleotide mit U in der Mitte (U+9) gepaart mit einer G-Schablone (Abbildung 1A) kann eine Leerkontrolle der äquimolaren Mengen an Schablone und Uracil-haltigem Substrat zur Qualitätskontrolle der Reinheit synthetischer Oligonukleotide verwendet werden (Abbildung 1B; die Signale stimmen mit dem angegebenen m/z und dem geringen Hintergrundrauschen überein). Für die MS-Datenanalyse wur...

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Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Eine nicht markierte, nicht-radioisotopische Methode zur Bestimmung der Uracil-DNA-Glykosylase-Aktivität wurde unter Verwendung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für die direkte apurinische/apyrimidinische standorthaltige Produktanalyse entwickelt. Der Assay erwies sich als ziemlich einfach, spezifisch, schnell und leicht zu bedienen für die DNA-Glykosylase-Messung.

Uracil-DNA-Glykosylase-Assay durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie-Analyse

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

DNA-Reparaturmechanismen sind sehr wichtig für die Aufrechterhaltung der Genomintegrität in allen lebenden Organismen. Uracil-DNA-Glykosylase ist ein entscheidendes DNA-Reparaturprotein im grundlegenden Gewebereparaturweg. Mit Hilfe der MALDI-TOF-Massenspektrometrie können wir das AP-Produkt für den Enzymaktivitätsassay direkt nachweisen.Der konventionelle Glykosylase-Assay erfordert Substratarbeit. Diese Methode ist markierungsfrei und erkennt direkt die Massenänderung von einem Uracil-Substrat zu einem AP-Produkt. Weitere Vorteile sind hohe Spezifität, Vielseitigkeit, Skalierbarkeit, Schnelligkeit und einfache Leistung.Wir haben E.coli Uracil-DNA-Glykosylase als Beispiel verwendet. Diese Methode kann leicht für andere DNA-Glykosylase-Assays modifiziert werden. Gut ausgebildetes Laborpersonal mit genauen Pipettier- und Verdünnungsfähigkeiten ist unerlässlich.Frisch zubereitete Reagenzien und salzarme Puffer sollten für bessere Signale und weniger Hintergrundgeräusche verwendet werden. Demonstrieren wird das Verfahren von Hui-Lan Chang, einem Doktoranden aus meinem Labor. Für einen DNA-Glykosylase-Assay unter Verwendung eines Guanin-Uracil-basentragenden Substrats aus T1 U+9-Duplex fügen Sie 70 Mikroliter Wasser, 10 Mikroliter 10-fachen Uracil-DNA-Glykosylase- oder UDG-Reaktionspuffer, fünf Mikroliter T1-Stamm und fünf Mikroliter U+9-Stamm in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.Schließen Sie die Röhre, bevor Sie sie in einem Wasserbad für 30 Minuten bei 65 Grad Celsius inkubieren, gefolgt von 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und schließlich auf Eis für drei Minuten, um ein ordnungsgemäßes Glühen der Substratschablone Duplex zu gewährleisten. Als nächstes fügen Sie in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen 49 Mikroliter eiskalten UDG-Reaktionspuffer und einen Mikroliter verdünntes UDG hinzu, bereiten dann serielle Verdünnungen mit dem UDG-Puffer für die gewünschten Enzymkonzentrationen vor und legen das verdünnte UDG auf Eis. Als nächstes fügen Sie in einem weiteren 1,5-Milliliter-Röhrchen neun Mikroliter der vorbereiteten Substratmischung hinzu und wärmen sie bei 37 Grad Celsius vor, fügen dann einen Mikroliter des verdünnten UDG hinzu und streichen Sie die Röhre, um den Inhalt zu mischen.Das Reaktionsgemisch kurz zentrifugieren und das Röhrchen sofort zur Inkubation bei 37 Grad Celsius platzieren. Verwenden Sie den Timer, um die Reaktion zu timen. Für den Reaktionsabschluss werden 0,25 molare Salzsäure und 0,23 molare Tris-Basenlösung hergestellt.Verwenden Sie ein pH-Messgerät, um den pH-Wert bei der Herstellung des Reagenzes und der Prüfung mit dem pH-Streifen zu bestätigen, bevor Sie den Reaktionsabschlussschritt ausführen, dann 10 Mikroliter Tris-EDTA mit einem Mikroliter 0,25 molare Salzsäure ansäuern und sicherstellen, dass der pH-Wert etwa zwei plus oder minus 0,5 beträgt. Neutralisieren Sie die Lösung mit einem Mikroliter Tris-Base und stellen Sie sicher, dass der endgültige pH-Wert etwa 6,5 plus oder minus 0,5 beträgt. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter 0,25 molare Salzsäure zu der Reaktionsmischung hinzu, um das Enzym zu inaktivieren, und legen Sie die Röhre für sechs Minuten auf Eis, dann fügen Sie einen Mikroliter Tris-Base hinzu, um die DNA-Produkte zu neutralisieren und einen Bruch der AP-Stelle durch längere Säureeinwirkung zu vermeiden.Nachdem Sie 13 Mikroliter Tris-EDTA hinzugefügt haben, um das Volumen der Produktmischung für den Matrixchiptransfer zu erhöhen, legen Sie die Tube auf Eis. Übertragen Sie schließlich alle 25-Mikroliter-UDG-Reaktionsprodukte aus Mikrozentrifugenröhrchen auf eine 384-Well-Mikrotiterplatte. Öffnen Sie die Tür des Nanoliter-Spenders und laden Sie die 384-Well-Mikrotiterplatte auf den Plattenhalter des Decks, dann setzen Sie das Matrix-Chip-Array in die entsprechende Scout-Plattenposition ein.Legen Sie die geladene Scout-Platte auf das Verarbeitungsdeck des Nanoliter-Spenders und schließen Sie die Tür. Berühren Sie die Ausführungstaste auf dem Übertragungsbildschirm und warten Sie, bis das Gerät mit der Abgabe von Proben von der Mikrotiterplatte an den Matrixchip beginnt. Als nächstes zeigen Sie mit der Option Vision Tab das Bild des Chips und die Dosiervolumina für jede Stelle während der Dosierung an.Stellen Sie sicher, dass das gefleckte Volumen auf dem Chip im Bereich von fünf bis 10 Nanolitern liegt. Bereiten Sie mit dem entsprechenden Anwendungsprogramm eine xlsx-Datei mit dem vorhergesagten Signalwert M by Z für den Import vor. Verwenden Sie dann das Anwendungsprogramm, um einen neuen UDG-Assay zu erstellen und zu definieren, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Option Assaygruppe im Designerformat importieren klicken und die Excel-Datei aus der Dropdown-Liste auswählen.Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche Kundenprojektplatte und klicken Sie oben im Dropdown-Optionsbaum, um eine neue Assay-Platte einzurichten. Geben Sie dann im Dialogfeld einen Dateinamen ein. Wählen Sie im Dropdown-Menü Plattentyp den Plattentyp mit 384 Vertiefungen aus.Drücken Sie OK und warten Sie, bis rechts auf dem Bildschirm eine leere Platte angezeigt wird. Klicken Sie anschließend auf die Assay-Option und wählen Sie den Assay aus der Dropdown-Liste aus. Um den ausgewählten Assay jeder Position des Probenflecks auf der Platte zuzuweisen, bewegen Sie den Cursor an jede Position der leeren Platte, klicken Sie, um den Brunnen zu markieren, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Plaketten hinzufügen auszuwählen.Bereiten Sie mit einem Desktop- oder Laptop-Computer eine Arbeitsliste im xlsx-Format ohne Header für alle Proben auf dem Chip vor, klicken Sie dann auf die Schaltfläche Neues Beispielprojekt hinzufügen und wählen Sie die Datei aus der Dropdown-Liste aus, um die Arbeitsliste zu importieren. Suchen Sie nach allen Testbeispielcodes in der Arbeitsliste auf der linken Seite des Bildschirms, klicken Sie dann auf einen Beispielcode in der Arbeitsliste und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die entsprechende Position der Platte, um die Tests mit jeder Position zu verknüpfen. Drücken Sie die Ein-/Aus-Taste des Massenspektrometers, um das Deck auszufahren und den Chiphalter herauszunehmen.Stecken Sie den Probenchip in den Chiphalter, legen Sie den geladenen Chiphalter auf das verlängerte Deck und drücken Sie die Ein-/Aus-Taste erneut, damit der Probenchip in das Instrument gelangt. Doppelklicken Sie im Massenspektrometer-Steuerungsprogramm auf das Erfassungssymbol. Klicken Sie im Erfassungsfenster auf die Registerkarte Auto-Run, um das Instrument zu starten und Massenspektren aus den Proben auf dem Chip zu erfassen.Führen Sie für die Datenanalyse das Datenanalyseprogramm aus, durchsuchen Sie dann den Datenbankbaum und wählen Sie die Chip-ID aus.Klicken Sie, um eine Zielvertiefung auf dem Chip zu markieren, und klicken Sie auf das Spektrumsymbol, um das Massenspektrum anzuzeigen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um das Anpassungsdialogfeld auszuwählen und einen bestimmten Spektrumbereich in einem neuen Fenster zuzuschneiden, klicken Sie dann auf die x-Achse, um die oberen und unteren Grenzen von M by Z einzugeben, und drücken Sie OK, um das angegebene Bereichsspektrum einschließlich der interessierenden Signale anzuzeigen. Um die Spitzenhöhe der Signale M by Z-Werte zu messen, die dem Uracil-Substrat, dem AP-Produkt und der Vorlage entsprechen, klicken Sie auf den Peak und sehen Sie sich die Peakhöhe in der oberen linken Ecke des Bildschirms an.Um das Spektrum für die Aufzeichnung zu speichern, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Exportieren und wählen Sie in der Dropdown-Liste Dateityp als JPEG aus. Klicken Sie auf Ziel und durchsuchen Sie die Festplatte, um das Speichergerät in der Dropdown-Liste auszuwählen, geben Sie dann den Dateinamen ein und klicken Sie auf Exportieren. Hier wird das Modellsystem für einen DNA-Glykosylase-Assay gezeigt.Die 19 Nukleotid-Template-DNA blieb nach der Glykosylase-Hydrolyse unverändert. Daher könnte das Signal als Referenz für die Quantifizierung des AP-Produkts dienen. Die Differenz eines Nukleotids zwischen dem Substrat und der entsprechenden Schablone ergab für beide ein gut getrenntes Signalprofil.Auch das Signal des AP-Produkts war gut von dem des Uracil-haltigen Substrats getrennt. Für die MS-Datenanalyse wurden die Spitzenhöhen gemessen. Die Zeitverlaufsanalyse für die UDG-Aktivität bei 0,01, 0,02, 0,05 und 0,1 zeigte sowohl Dosis- als auch Zeitabhängigkeit.Ein Beispiel für die Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit mit relativen MS-Signalintensitäten des Produkts und des Substrats in nanomolaren Konzentrationen ist hier dargestellt. Die UDG-Reaktionsgeschwindigkeit wird als Nanomol der pro Sekunde produzierten AP-Stelle dargestellt. KM und VMAX wurden aus dem Lineweaver Burk-Diagramm berechnet.Die gemessene Einheit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie war proportional zur definierten Einheit von 0,001 Einheiten bis 0,02 Einheiten mit einem nennenswerten Bestimmtheitskoeffizienten. Hier wird die Hemmung der UDG-Aktivität durch einen Uracil-Glykosylase-Inhibitor gezeigt. In Gegenwart von 100 Picomolen des Inhibitors wurde die Aktivität von 0,05 Einheiten UDG auf ein nicht nachweisbares Niveau gehemmt und der IC50 wurde als 7,6 Picomolen befunden.Da die AP-Größe labil ist und durch eine Beta-Eliminationsreaktion bei extremem pH-Wert und erhöhter Temperatur hydrolysiert werden kann, sollte die Assay-Abschreckung für den definierten Zeitraum auf Eis durchgeführt werden. Verwenden Sie auch ein pH-Messgerät, um sicherzustellen, dass HCL den Reaktionspuffer auf den gewünschten pH-Wert ansäuert und Tris-Base die Produktmischung richtig neutralisiert. Diese Methode kann auch modifiziert werden, um die bifunktionelle DNA-Glykosylase zu analysieren.Zum Beispiel ist U+2 T3 ein geeignetes Substrat für den Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase-Assay. Die Spaltprodukte der FPG AP-Ligaseaktivität können leicht durch MALDI-TOF-Masse nachgewiesen werden. Diese Methode hat das Potenzial, die Referenzmethode für die monofunktionelle Glykosylasemessung zu werden und kann auch als Werkzeug für das Glykosylase-Inhibitor-Screening für die pharmazeutische Entwicklung verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Forschung

Biochemie

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics der extrazellulären Matrix: eine Methode zur Intact Glycopeptidthioestern Analyse unter Verwendung von Massenspektrometrie

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimale Vorbereitung von Formalin fixiert Proben für Peptid-Matrix basierten Assisted Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie Imaging-Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...