Name: uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-04-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

אנו מודים למתקן הליבה המשולב NCFPB לגנומיקה פונקציונלית (טאיפיי, טייוואן) ולמעבדת הפרמקוגנומיקה של NRPB (טאיפיי, טייוואן) על התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן, R.O.C. [מספר מענק MOST109-2314-B-002-186 ל- K.-Y.S., רוב 107-2320-B-002-016-MY3 ל- S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 ל- W.h.F.]. H.-L.C. הוא מקבל מלגת דוקטורט מאוניברסיטת טייוואן הלאומית. מימון תשלום בגין גישה פתוחה: משרד המדע והטכנולוגיה, R.O..C.

1. הכנת מצע/תבנית
<ol><li>עיצוב מצע /תבנית דופלקס עם תוכן G+C מאוזן של ~ 50 ± 10% וטמפרטורת ההיתוך המינימלית של 50 °C (50 °F) עבור אזור הדופלקס. הערה: הבדל נוקלאוטיד אחד בין מצעים של 18 nt לבין תבניות 19 nt (טבלה 1 ואיור 1) מסייע לפרשנות טובה יותר של אותות טרשת נפוצה וחישול מ?...

מאמר זה מספק הליך מפורט לשימוש בשיטת בדיקת MS UDG MALDI-TOF MS לזיהוי ישיר של מוצרי DNA המכילים AP. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי מצעים המכילים uracil הם ללא תוויות, מדרגי, קל לעבוד עם, ולאפשר גמישות רבה יותר בעיצוב מצע.
מיצוי פנול/כלורופורם המומלץ על ידי ספק UDG מאפשר השבתה של האנזים כד?...

למרות uracil הוא בסיס נורמלי ב RNA, זה נגע נפוץ מאוד mutagenic מאוד בדנ"א גנומי. אורסיל יכול לנבוע מזיהום הידרוליטי ספונטני/אנזימטי של דיאוקסיציטדין. בכל תא חי, זיהום זה מתרחש 100-500 פעמים ביום בתנאים פיזיולוגיים1,2. אם שינויים אלה אינם מתוקנים, יכול להיות שינוי בהרכב רצף ה- DNA, גרימת מוטציה. כמו uracil ב- DNA מעדיף לזווג עם dATP במהלך השכפול, אם ציטוסין deaminates כדי uracil, בשני אירועי שכפול, תהיה מוטציה חדשה G:C כדי A:T מעבר במחצית DNA הצאצאים3.
בין האסטרטגיות התאיות לשמירה על יציבות גנטית, תיקון כריתת בסיס (BER) הוא מנגנון חיוני המתקנת בסיסים פגומים, כגון אורסיל, ב- DNA4. BER הוא תהליך שמור מאוד אבולוציונית. ישנם שני מסלולי BER כלליים: מסלול התיקון הקצר המוביל למערכת תיקון של נוקלאוטיד יחיד ומסלול התיקון הארוך המייצר מערכת תיקון של לפחות שני נוקלאוטידים5. BER הוא מנגנון מתואם המתרחש במספר שלבים. הצעד הראשון ב- BER הוא ההידרוליזה האנזימטית של בסיס הנוקלאוטיד הפגוע על ידי גליקוסילאז DNA ספציפי לנזק כדי ליצור אתר ביניים אפורני /אפירימידיני (AP)6. זה ואחריו המחשוף של עמוד השדרה סוכר-פוספט באתר AP על ידי אנדונוקלאז, ניקוי של ה- DNA מסתיים על ידי ליאז, מילוי פערים על ידי פולימראז DNA, ואיטום הניק הסופי על ידי ligase5.
גליקוסיל-DNA (UDG) עובר הידרוליזה של האורסיל מדנ"א המכיל אורסיל עבור BER באשריצ'יה קולי. בדיקות UDG קונבנציונליות באמצעות DNA עם תווית רדיואקטיבית הכוללות טכניקות הפרדה שונות6,7,8,9,10,11,11,12,13 הן בדרך כלל גוזלות זמן, דורשות עבודה אינטנסיבית, עתירות עבודה, עם ריאגנטים יקרים לתיוג, הליכים מסובכים, ודורש הכשרה ותרגול אינטנסיביים כדי להפחית את הסיכונים של חשיפה לחומרים רדיואקטיביים. בדיקות oligonucleotide פלואורומטריות פותחו כתחליף לתיוג רדיואיזוטופ14, בנוסף למשואות מולקולריות וטכנולוגיית העברת אנרגיה תהודה של Förster15,16,17,18,19,20. עם זאת, תיוג ספציפי נדרש עבור כל השיטות הנ"ל. לאחרונה פותחו ביו-סנסורים נטולי תוויות21,22,23 ושיטות צבע המבוססות על היווצרות של G-quadruplex24,25,26. עם זאת, זוגות A:U מרובים או רצפים שתוכננו במיוחד בבדיקות מסבכים את הגדרת יחידת האנזים.
מלדי-TOF טרשת נפוצה היא טכנולוגיה שיכולה להיות שימושית מאוד בניתוח DNA. יישומים שפותחו כוללים גנוטיפינג נוקלאוטיד יחיד-נוקלאוטיד27,28, ניתוח נוקלאוטיד שונה29, וזיהוי ביניים של תיקון DNA30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS צריך להיות מאומץ בקלות לניתוח גליקוסילאז DNA כדי לזהות מוצרי DNA המכילים אתר AP. עם זאת, אתרי AP בדנ"א נוטים להישבר בתנאים ניסיוניים רבים33. בדיקת UDG מוצגת כאן באמצעות MALDI-TOF MS כדי למדוד ישירות את הייצור באתר AP ללא רעש משמעותי של שבירת גדילים. שיטה זו ללא תוויות קלה לעבודה ויש לה פוטנציאל גבוה ליישום התרופות של הקרנת מעכבי גליקוזילאאז DNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)</td>
			<td>J.T baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved deionized water</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>AQUAGLOVE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2,3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(0.5-10 &#181;L)</td>
			<td>extra gene</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(1,250 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(200 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 4, 5 
			Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td>RS1000</td>
			<td>Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Clubio</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>National scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P1000)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P2)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P10)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P100)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P200)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (SL2)</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Singapore)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quest Graph IC50 Calculator (v.1)</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Fig. 4 
			https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>WAKO</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCHIP array</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#01509</td>
			<td>Protocol 3, 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typer 4.0 software</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#10145</td>
			<td>Protocol 6 
			Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDG Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>B0280S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil Glycosylase Inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0281S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil-DNA Glycosylase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0280L</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis

Uracil-DNA גליקוסילאז (UDG) הוא מרכיב מפתח במסלול תיקון כריתת הבסיס לתיקון של אורסיל שנוצר מ deamination הידרוליטי של ציטוזין. לכן, זה חיוני לתחזוקת שלמות הגנום. פותחה שיטה ספציפית מאוד, שאינה מתויגת, שאינה רדיו-איזוטופית, למדידת פעילות UDG. דופלקס דנ"א סינתטי המכיל אורסיל ספציפי לאתר נבקע על ידי UDG ולאחר מכן היה נתון לפירוק לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ספקטרומטריה מסה (MALDI-TOF MS) ניתוח. הוקם פרוטוקול לשימור המוצר של האתר האפוריני/אפירימידיני (AP) בדנ"א ללא שבירת גדילים. השינוי בערך m/z מהמצע למוצר שימש להערכת הידרוליזת אורסיל על ידי UDG. מצע G:U שימש לניתוח קינטי של UDG שהניב את ה- Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/ s, ו- Kcat = 9.31 s-1. יישום של שיטה זו למעכב גליקוסילאז uracil (UGI) בדיקה הניבה ערך IC50 של 7.6 pM. הספציפיות של UDG באמצעות uracil בעמדות שונות בתוך מצעים DNA חד גדילי כפול תקוע כפול הדגים יעילות מחשוף שונה. לפיכך, שיטת MALDI-TOF MS פשוטה, מהירה ורב-תכליתית זו יכולה להיות שיטת התייחסות מצוינת לגליקוסילות DNA מונו-תעשייתיות שונות. יש לו גם את הפוטנציאל ככלי עבור DNA גליקוסילאז מעכב הקרנה.

תבניות ומצעים אם ניקח אוליגונוקלאוטידים סינתטיים עם U במרכז (U+9) בשילוב עם תבנית G כדוגמה (איור 1A), בקרה ריקה של כמויות שיווימולריות של תבנית ומצע המכיל אורסיל יכולה לשמש לבקרת איכות של טוהר אוליגונוקלאוטיד סינתטי (איור 1B; האותות תואמים ל- m/z המיועד ...

Watch this Scientific Journal Video about Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

שיטה לא מתויגת, לא רדיו-איזוטופית כדי לבדוק פעילות גליקוסילאז uracil-DNA פותחה באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF לניתוח מוצר ישיר apurinic / apyrimidinic המכיל אתרים. הבדיקה הוכיחה להיות די פשוט, ספציפי, מהיר, וקל לשימוש עבור מדידת גליקוזילאאז DNA.

Uracil-DNA Glycosylase בדיקה על ידי טיהור לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ניתוח ספקטרומטריה מסה

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

מנגנוני תיקון DNA חשובים מאוד לשמירה על שלמות הגנום בכל האורגניזמים החיים. גליקוסיל-DNA Uracil-DNA הוא חלבון תיקון DNA חיוני במסלול תיקון הרקמות הבסיסי. באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF, אנו יכולים לזהות ישירות מוצר AP לבדיקת פעילות אנזימים.בדיקת גליקוסילאז קונבנציונלית דורשת עבודת מצע. שיטה זו היא ללא תוויות ולזהות ישירות את השינוי ההמוני ממצע uracil למוצר AP. יתרונות נוספים כוללים ספציפיות גבוהה, רב-תכליתיות, מדרגיות, מהירות וקל לביצועים.השתמשנו E.coli uracil-DNA גליקוסילאז כדוגמה. שיטה זו ניתן לשנות בקלות עבור בדיקות גליקוסילאז DNA אחרים. אנשי מעבדה מאומנים היטב עם צינורות מדויקים וכישורי דילול הם חיוניים.ריאגנטים טריים ומאגרי מלח נמוכים צריכים לשמש לאותות טובים יותר ורעש רקע פחות. מי שידגים את ההליך יהיה הוי-לאן צ'אנג, דוקטורנט מהמעבדה שלי. לקבלת בדיקת גליקוסילאז DNA באמצעות מצע נושא בסיס guanine-uracil של דופלקס T1 U + 9, להוסיף 70 מיקרוליטרים של מים, 10 מיקרוליטרים של 10X uracil-DNA גליקוסילאז או מאגר תגובת UDG, חמישה מיקרוליטרים של מלאי T1, וחמישה מיקרוליטרים של מלאי U + 9 בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר.סגור את הצינור לפני הדגירה באמבט מים במשך 30 דקות ב 65 מעלות צלזיוס, ואחריו 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולבסוף על קרח במשך שלוש דקות כדי להבטיח חישול נאות של דופלקס תבנית המצע. לאחר מכן, בצינור חדש של 1.5 מיליליטר, הוסיפו 49 מיקרוליטרים של מאגר תגובת UDG קר כקרח ומיקרוליטר אחד של UDG מדולל, ולאחר מכן הכינו דילול סדרתי עם מאגר UDG לריכוזי האנזים הרצויים והניחו את ה- UDG המדולל על הקרח. לאחר מכן, בצינור אחר של 1.5 מיליליטר, מוסיפים תשעה מיקרוליטרים מתערובת המצע המוכן ומחממים אותה מראש ב -37 מעלות צלזיוס, ואז מוסיפים מיקרוליטר אחד של UDG המדולל ומזיזים את הצינור כדי לערבב את התוכן.צנטריפוגה קצרה את תערובת התגובה ומניחים את הצינור מיד לדגירה ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש בטיימר כדי לתזמן את התגובה. לסיום תגובה, להכין 0.25 חומצה הידרוכלורית מולרית ו 0.23 פתרון בסיס tris טוחנת.השתמש ב- pH meter כדי לאשר את ה- pH בעת הכנת ריאגנט ובדיקה על ידי רצועת pH לפני הפעלת שלב סיום התגובה, ולאחר מכן חומצה 10 microliters של tris-EDTA עם מיקרוליטר אחד של 0.25 חומצה הידרוכלורית מולרית ולוודא כי ה- pH הוא סביב שני פלוס או מינוס 0.5. נטרלו את הפתרון באמצעות מיקרוליטר אחד של בסיס טריס וודאו שה-pH הסופי הוא בסביבות 6.5 פלוס או מינוס 0.5. לאחר מכן, להוסיף מיקרוליטר אחד של 0.25 חומצה הידרוכלורית מולרית לתערובת התגובה כדי להשבית את האנזים ולהניח את הצינור על קרח במשך שש דקות, ולאחר מכן להוסיף מיקרוליטר אחד של בסיס tris כדי לנטרל את מוצרי ה- DNA ולהימנע שבירת אתר AP על ידי חשיפה ממושכת לחומצה.לאחר הוספת 13 מיקרוליטרים של tris-EDTA כדי להגדיל את נפח תערובת המוצר להעברת שבב מטריצה, הנח את הצינור על קרח. לבסוף, העבירו את כל 25 מוצרי התגובה של microliter UDG מצינורות מיקרוצנטריפוגה לצלחת מיקרוטיטר של 384 well. פתח את הדלת של מתקן הננו-ליטר וטען את צלחת המיקרוטיטר 384-well על מחזיק הצלחת של הסיפון, ולאחר מכן הכנס את מערך שבב המטריצה למיקום צלחת הסקאוט המתאימה.מניחים את צלחת הסקאוט הטעונה על סיפון העיבוד של מתקן הננו-ליטר וסוגרים את הדלת. גע בלחצן הריצה במסך ההעברה והמתן שהמכשיר יתחיל לחלק דגימות מלוחית המיקרוטיטר לשבב המטריצה. לאחר מכן, באמצעות אפשרות כרטיסיית הראייה, הצג את התמונה של השבב ואת אמצעי האחסון לחלק עבור כל נקודה במהלך חלוקה.ודא שהנפח המנוקד על השבב נמצא בטווח של 5 עד 10 ננו-ליטרים. באמצעות תוכנית היישום המתאימה, הכן קובץ xlsx המכיל את ערך האות החזוי M by Z לייבוא. לאחר מכן השתמש בתוכנית היישום כדי ליצור ולהגדיר בדיקת UDG חדשה על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על קבוצת בדיקת הייבוא בתבנית מעצב ובחירה בקובץ Excel מהרשימה הנפתחת.לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על לחצן לוחית הפרוייקט של הלקוח ולחץ על החלק העליון של עץ האפשרויות הנפתח כדי ליצור לוח בדיקה חדש. לאחר מכן, בתיבת הדו-שיח , הקלד שם קובץ. וברשימה הנפתחת סוג צלחת, בחר את סוג הצלחת 384-well.לחץ על אישור והמתן להופעת לוח ריק בצד שמאל של המסך. לאחר מכן, לחץ על אפשרות הבדיקה ובחר את הבדיקה מהרשימה הנפתחת. כדי להקצות את הבדיקה שנבחרה לכל מיקום נקודה לדוגמה בלוח, הזז את הסמן לכל מיקום של הלוח הריק, לחץ כדי לסמן את הבאר ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור הוספת לוחות.באמצעות מחשב שולחני או מחשב נישא, הכן רשימת עבודה בתבנית xlsx ללא כותרת עליונה עבור כל הדוגמאות בשבב ולאחר מכן לחץ על לחצן הוסף פרוייקט לדוגמה חדש ובחר את הקובץ מהרשימה הנפתחת כדי לייבא את רשימת העבודה. חפש את כל קודי מדגם הבדיקה ברשימת העבודה בצד שמאל של המסך, ולאחר מכן לחץ על קוד מדגם ברשימת העבודה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על המיקום המתאים של הצלחת כדי לקשר את הבדיקות לכל מיקום. לחץ על כפתור הכניסה / היציאה של ספקטרומטר המסה כדי להרחיב את הסיפון ולהוציא את מחזיק השבב.הכנס את שבב הדגימה למחזיק השבב, הנח את מחזיק השבב הטעון על הסיפון המורחב ולחץ שוב על כפתור הכניסה/יציאה כדי ששבב הדגימה ייכנס למכשיר. בתוכנית בקרת ספקטרומטר המסה, לחץ פעמיים על סמל הרכישה. בחלון הרכישה, לחץ על כרטיסיית ההפעלה האוטומטית כדי להפעיל את המכשיר ולרכוש ספקטרום מסה מהדגימות על השבב.לניתוח נתונים, הפעל את תוכנית ניתוח הנתונים ולאחר מכן עיין בעץ מסד הנתונים ובחר את מזהה השבב.לחץ כדי לסמן באר יעד על השבב ולחץ על סמל הספקטרום כדי להציג את ספקטרום המסה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור את תיבת הדו-שיח של ההתאמה האישית ולחתוך טווח ספקטרום מסוים בחלון חדש, ולאחר מכן לחץ על ציר ה- x כדי להקליד את הגבולות העליונים והתחתונים של M by Z ולחץ על אישור כדי להציג את ספקטרום הטווח שצוין כולל אותות העניין. כדי למדוד את גובה השיא של ערכי האותות M by Z התואמים למצע האורסיל, מוצר AP ותבנית, לחץ על הפסגה והצג את גובה השיא בפינה הימנית העליונה של המסך.לבסוף, כדי לשמור את הספקטרום לשמירת רשומות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ייצוא ובחר סוג קובץ כ- JPEG ברשימה הנפתחת. לחץ על היעד ועיין בדיסק כדי לבחור את התקן האחסון ברשימה הנפתחת ולאחר מכן הקלד את שם הקובץ ולחץ על ייצוא. מערכת המודל לבדיקת גליקוסילאז DNA מוצגת כאן.ה- DNA של תבנית הנוקלאוטיד 19 נותר ללא שינוי לאחר הידרוליזה של גליקוסילאז. לכן, האות יכול לשמש הפניה לכמות של מוצר AP. ההבדל של נוקלאוטיד אחד בין המצע לבין התבנית המתאימה יצר פרופיל אות מופרד היטב עבור שניהם.האות של מוצר AP הופרד היטב גם מזה של המצע המכיל אורסיל. עבור ניתוח נתוני טרשת נפוצה, נמדדו שיאי השיא. ניתוח קורס זמן עבור פעילות UDG ב 0.01, 0.02, 0.05, ו 0.1 הדגים הן במינון והן בתלות בזמן.דוגמה של עלילת קצב תגובה עם עוצמות אות טרשת נפוצה יחסית של המוצר ומצע בריכוזים ננומולריים מוצגת כאן. קצב התגובה UDG מוצג כננומולים של אתר AP המיוצר לשניה. הק.מ.מ. ו-VMAX חושבו מהתכנית של Lineweaver Burk.יחידת ספקטרומטריית המסה MALDI-TOF נמדדה הייתה פרופורציונלית ליחידה המוגדרת מ 0.001 יחידות ל 0.02 יחידות עם מקדם ניכר של קביעה. עיכוב של פעילות UDG על ידי מעכב גליקוסילאז uracil מוצג כאן. בנוכחות 100 picomoles של המדכא, הפעילות של 0.05 יחידות של UDG היה מעוכב לרמה בלתי ניתנת לגילוי ואת IC50 נמצא להיות 7.6 picomoles.מאז גודל AP הם labile וניתן הידרוליזה על ידי תגובת חיסול בטא ב- pH קיצוני וטמפרטורה גבוהה, מרווה לבדיקה צריך להתבצע על קרח לתקופה המוגדרת. כמו כן, השתמש במד pH כדי להבטיח כי HCL חומצי את מאגר התגובה ל- pH הרצוי בסיס tris מנטרל את תערובת המוצר כראוי. שיטה זו יכולה גם להשתנות כדי לנתח גליקוסילאז DNA bifunctional.לדוגמה, U +2 T3 הוא מצע מתאים לבדיקת גליקוסילאז DNA פורמידופירמידין. מוצרי המחשוף של פעילות FPG AP ligase ניתן לזהות בקלות על ידי מסה MALDI-TOF. שיטה זו יש פוטנציאל להיות שיטת הייחוס עבור מדידת גליקוסילאז מונו-תעשייתי והוא יכול לשמש גם ככלי עבור הקרנת מעכבי גליקוסילאז לפיתוח תרופות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics של מטריקס: שיטה Intact ניתוח Glycopeptide באמצעות ספקטרומטריית מסה

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

הגהה ואת וזמינותו תיקון ה-DNA באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה MALDI-TOF והסיומת נוקלאוטיד יחיד

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...