Name: uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-04-22T14:00:00
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Ringraziamo l'NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) e l'NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan, R.O.C. [numero di sovvenzione MOST109-2314-B-002 -186 a K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 a S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 a W.-h.F.]. H.-L.C. ha ricevuto una borsa di dottorato dalla National Taiwan University. Finanziamento per la tassa di accesso aperto: Ministero della Scienza e della Tecnologia, R.O.C.

1. Preparazione del substrato/modello
<ol><li>Progettare il substrato/modello duplex di uracile con un contenuto G+C bilanciato di ~50 ± 10% e una temperatura minima di fusione di 50 °C per la regione duplex. NOTA: Una differenza nucleotidica tra 18 substrati nt e modelli 19 nt (Tabella 1 e Figura 1) aiuta a migliorare l'interpretazione del segnale MS e la ricottura appropriata. Il filamento modello funge da DNA complementare per generare discrepanze ...

Questo documento fornisce una procedura dettagliata per l'utilizzo di un metodo di analisi UDG MALDI-TOF MS per rilevare direttamente i prodotti a DNA contenenti AP. I principali vantaggi di questo metodo sono che i substrati contenenti uracile sono privi di etichette, scalabili, facili da lavorare e offrono una maggiore flessibilità nella progettazione del substrato.
L'estrazione di fenolo/cloroformio raccomandata dal fornitore UDG consente l'inattivazione dell'enzima per prevenire la degrad...

Sebbene l'uracile sia una base normale nell'RNA, è una lesione comune e altamente mutagena nel DNA genomico. L'uracile può derivare dalla deaminazione idrolitica spontanea/enzimatica di una deossicitidina. In ogni cellula vivente, questa deaminazione avviene 100-500 volte al giorno in condizioni fisiologiche1,2. Se queste alterazioni non vengono riparate, ci può essere un cambiamento nella composizione della sequenza del DNA, causando mutazioni. Poiché l'uracile nel DNA preferisce accoppiarsi con dATP durante la replicazione, se la citosina si deamina in uracile, in due eventi di replicazione, ci sarà una nuova mutazione di transizione da G:C ad A:T in metà del DNA della progenie3.
Tra le strategie cellulari per mantenere la stabilità genetica, la riparazione dell'escissione di base (BER) è un meccanismo essenziale che ripara le basi danneggiate, come l'uracile, nel DNA4. BER è un processo altamente conservato evolutivamente. Esistono due vie BER generali: la via a patch corta che porta a un tratto di riparazione di un singolo nucleotide e la via a patch lunga che produce un tratto di riparazione di almeno due nucleotidi5. BER è un meccanismo coordinato che si verifica in più passaggi. Il primo passo nel BER è l'idrolisi enzimatica della base nucleotidica danneggiata da una glicosilasi del DNA specifica per il danno per generare un sito intermedio apurinico/aprimidinico (AP)6. Questo è seguito dalla scissione della spina dorsale zucchero-fosfato nel sito AP da un'endonucleasi, pulizia delle estremità del DNA da una liasi, riempimento del gap da una DNA polimerasi e sigillatura del nick finale da una ligasi5.
Uracil-DNA glycosylase (UDG) idrolizza l'uracile dal DNA contenente uracile per BER in Escherichia coli. I saggi UDG convenzionali che utilizzano DNA radiomarcato che coinvolgono diverse tecniche di separazione6,7,8,9,10,11,12,13 sono di solito dispendiosi in termini di tempo, laboriosità, con costosi reagenti di etichettatura, procedure complicate e che richiedono una formazione e una pratica intensive per ridurre i rischi di esposizione a materiali radioattivi. I saggi oligonucleotidici fluorometrici sono stati sviluppati in sostituzione dell'etichettatura dei radioisotopi14, oltre ai beacon molecolari e alla tecnologia di trasferimento dell'energia di risonanza di Förster15,16,17,18,19,20. Tuttavia, è richiesta un'etichettatura specifica per tutti i metodi di cui sopra. Recentemente sono stati sviluppati saggi di biosensori privi di etichette21,22,23 e metodi colorimetrici basati sulla formazione di un G-quadruplex24,25,26. Tuttavia, più coppie A:U o sequenze appositamente progettate nelle sonde complicano la definizione dell'unità enzimatica.
MALDI-TOF MS è una tecnologia che potrebbe essere di grande utilità nell'analisi del DNA. Le applicazioni sviluppate includono la genotipizzazione del polimorfismo a singolo nucleotide27,28, l'analisi nucleotidica modificata29 e l'identificazione intermedia di riparazione del DNA30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS deve essere prontamente adottato per l'analisi della glicosilasi del DNA per rilevare prodotti a DNA contenenti sito AP. Tuttavia, i siti AP nel DNA sono soggetti a rottura del filamento in molte condizioni sperimentali33. Un test UDG viene presentato qui utilizzando MALDI-TOF MS per misurare direttamente la produzione del sito AP senza un significativo rumore di strand-break. Questo metodo senza etichette è facile da usare e ha un alto potenziale per l'applicazione farmaceutica dello screening degli inibitori della glicosilasi del DNA.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)</td>
			<td>J.T baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved deionized water</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>AQUAGLOVE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2,3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(0.5-10 &#181;L)</td>
			<td>extra gene</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(1,250 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(200 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 4, 5 
			Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td>RS1000</td>
			<td>Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Clubio</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>National scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P1000)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P2)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P10)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P100)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P200)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (SL2)</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Singapore)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quest Graph IC50 Calculator (v.1)</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Fig. 4 
			https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>WAKO</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCHIP array</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#01509</td>
			<td>Protocol 3, 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typer 4.0 software</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#10145</td>
			<td>Protocol 6 
			Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDG Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>B0280S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil Glycosylase Inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0281S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil-DNA Glycosylase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0280L</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis

L'uracil-DNA glicosilasi (UDG) è un componente chiave nella via di riparazione dell'escissione di base per la correzione dell'uracile formato dalla deaminazione idrolitica della citosina. Pertanto, è fondamentale per il mantenimento dell'integrità del genoma. È stato sviluppato un metodo altamente specifico, non etichettato, non radio-isotopico per misurare l'attività UDG. Un duplex di DNA sintetico contenente un uracile sito-specifico è stato scisso da UDG e quindi sottoposto all'analisi di spettrometria di massa a tempo di volo (MALDI-TOF MS) laser assistita da matrice. È stato stabilito un protocollo per preservare il prodotto del sito apurinico/aprimidinico (AP) nel DNA senza rottura del filamento. La variazione del valore m/z dal substrato al prodotto è stata utilizzata per valutare l'idrolisi dell'uracile da parte dell'UDG. Un substrato G:U è stato utilizzato per l'analisi cinetica UDG producendo Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s e Kcat = 9,31 s-1. L'applicazione di questo metodo a un saggio inibitore della glicosilasi dell'uracile (UGI) ha prodotto un valore IC50 di 7,6 pM. La specificità UDG che utilizza l'uracile in varie posizioni all'interno di substrati di DNA a singolo filamento e doppio filamento ha dimostrato diverse efficienze di scissione. Pertanto, questo metodo MALDI-TOF MS semplice, rapido e versatile potrebbe essere un eccellente metodo di riferimento per varie glicosilasi monofunzionali del DNA. Ha anche il potenziale come strumento per lo screening degli inibitori della glicosilasi del DNA.

Modelli e substrati Prendendo oligonucleotidi sintetici con U al centro (U + 9) accoppiato con un modello G come esempio (Figura 1A), un controllo vuoto di quantità equimolari di modello e substrato contenente uracile può essere utilizzato per il controllo di qualità della purezza degli oligonucleotidi sintetici (Figura 1B; i segnali corrispondono al m / z designato e al basso rumore di fondo). Per l'analisi dei dati MS, sono state misurat...

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Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Un metodo non marcato, non radio-isotopico per analizzare l'attività della glicosilasi uracil-DNA, è stato sviluppato utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF per l'analisi diretta del prodotto contenente sito apurinico/aprimidinico. Il test si è rivelato abbastanza semplice, specifico, rapido e facile da usare per la misurazione della glicosilasi del DNA.

Saggio di glicosilasi uracil-DNA mediante desorbimento laser assistito da matrice/analisi spettrometria di massa a tempo di volo

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

I meccanismi di riparazione del DNA sono molto importanti per mantenere l'integrità del genoma in tutti gli organismi viventi. L'uracil-DNA glicosilasi è una proteina cruciale per la riparazione del DNA nel percorso di riparazione dei tessuti di base. Utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF, possiamo rilevare direttamente il prodotto AP per il saggio di attività enzimatica.Il saggio convenzionale della glicosilasi richiede il lavoro del substrato. Questo metodo è privo di etichette e rileva direttamente il cambiamento di massa da un substrato di uracile a un prodotto AP. Altri vantaggi includono elevata specificità, versatilità, scalabilità, rapidità e facilità di esecuzione.Abbiamo usato E.coli uracil-DNA glicosilasi come esempio. Questo metodo può essere facilmente modificato per altri saggi di DNA glicosilasi. Personale di laboratorio ben addestrato con accurate capacità di pipettaggio e diluizione sono essenziali.I reagenti appena preparati e i tamponi a basso contenuto di sale dovrebbero essere utilizzati per segnali migliori e un minore rumore di fondo. A dimostrare la procedura sarà Hui-Lan Chang, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Per un test della glicosilasi del DNA utilizzando il substrato di base guanina-uracile del duplex T1 U + 9, aggiungere 70 microlitri di acqua, 10 microlitri di 10X uracil-DNA glicosilasi o tampone di reazione UDG, cinque microlitri di T1 stock e cinque microlitri di U + 9 in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri.Chiudere il tubo prima di incubarlo a bagnomaria per 30 minuti a 65 gradi Celsius, seguito da 30 minuti a 37 gradi Celsius, e infine sul ghiaccio per tre minuti per garantire la corretta ricottura del modello di substrato duplex. Successivamente, in un nuovo tubo da 1,5 millilitri, aggiungere 49 microlitri di tampone di reazione UDG ghiacciato e un microlitro di UDG diluito, quindi preparare diluizioni seriali con il tampone UDG per le concentrazioni enzimatiche desiderate e posizionare l'UDG diluito sul ghiaccio. Successivamente, in un altro tubo da 1,5 millilitri, aggiungere nove microlitri della miscela di substrato preparata e preriscaldarlo a 37 gradi Celsius, quindi aggiungere un microlitro dell'UDG diluito e scorrere il tubo per mescolare il contenuto.Centrifugare brevemente la miscela di reazione e posizionare immediatamente il tubo per l'incubazione a 37 gradi Celsius. Usa il timer per cronometrare la reazione. Per la terminazione della reazione, preparare 0,25 molare acido cloridrico e 0,23 molare tris base soluzione.Utilizzare il pHmetro per confermare il pH durante la preparazione del reagente e il test mediante striscia di pH prima di eseguire la fase di terminazione della reazione, quindi acidificare 10 microlitri di tris-EDTA con un microlitro di acido cloridrico molare 0,25 e assicurarsi che il pH sia di circa due più o meno 0,5. Neutralizzare la soluzione con un microlitro di base tris e assicurarsi che il pH finale sia di circa 6,5 più o meno 0,5. Quindi, aggiungere un microlitro di acido cloridrico molare 0,25 alla miscela di reazione per inattivare l'enzima e posizionare il tubo sul ghiaccio per sei minuti, quindi aggiungere un microlitro di base tris per neutralizzare i prodotti del DNA ed evitare la rottura del sito AP mediante esposizione prolungata all'acido.Dopo aver aggiunto 13 microlitri di tris-EDTA per aumentare il volume della miscela di prodotti per il trasferimento del chip della matrice, posizionare il tubo sul ghiaccio. Infine, trasferire tutti i prodotti di reazione UDG da 25 microlitri dai tubi microcentrifuga a una piastra di microtitolazione a 384 pozzetti. Aprire la porta del distributore di nanolitri e caricare la piastra di microtitolazione a 384 pozzetti sul supporto della piastra del ponte, quindi inserire l'array di chip a matrice nella posizione della piastra scout corrispondente.Posizionare la piastra di esplorazione caricata sul piano di lavorazione del distributore di nanolitri e chiudere la porta. Toccare il pulsante di esecuzione sulla schermata di trasferimento e attendere che lo strumento inizi a erogare campioni dalla piastra del microtitolazione al chip della matrice. Successivamente, utilizzando l'opzione della scheda di visione, mostra l'immagine del chip e i volumi di erogazione per ciascun punto durante l'erogazione.Assicurarsi che il volume individuato sul chip sia compreso tra cinque e 10 nanolitri. Utilizzando il programma applicativo appropriato, preparare un file xlsx contenente il valore del segnale previsto M per Z per l'importazione. Quindi utilizzare il programma applicativo per creare e definire un nuovo test UDG facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'opzione Importa gruppo di saggi nel formato di progettazione e selezionando il file Excel dall'elenco a discesa.Quindi, fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante della piastra del progetto del cliente e fare clic sulla parte superiore dell'albero delle opzioni a discesa per stabilire una nuova piastra di analisi. Quindi, nella finestra di dialogo, digitare un nome file. E nel menu a discesa del tipo di piastra, selezionare il tipo di piastra a 384 pozzetti.Premere OK e attendere che venga visualizzata una targhetta vuota sulla destra dello schermo. Quindi, fare clic sull'opzione test e selezionare il test dall'elenco a discesa. Per assegnare il test selezionato a ciascuna posizione del punto campione sulla piastra, spostare il cursore su ciascuna posizione della piastra vuota, fare clic per evidenziare il pozzetto e fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare aggiungi placche.Utilizzando un computer desktop o portatile, preparare una lista di lavoro in formato xlsx senza intestazione per tutti i campioni sul chip, quindi fare clic sul pulsante Aggiungi nuovo progetto di esempio e selezionare il file dall'elenco a discesa per importare l'elenco di lavoro. Cerca tutti i codici campione di prova nell'elenco di lavoro a sinistra dello schermo, quindi fai clic su un codice campione nell'elenco di lavoro e fai clic con il pulsante destro del mouse sulla posizione corrispondente della piastra per collegare i test a ciascuna posizione. Premere il pulsante di ingresso / uscita dello spettrometro di massa per estendere il ponte ed estrarre il supporto del chip.Inserire il chip campione nel supporto del chip, posizionare il supporto del chip caricato sul ponte esteso e premere nuovamente il pulsante di ingresso/uscita affinché il chip campione entri nello strumento. Nel programma di controllo dello spettrometro di massa, fare doppio clic sull'icona di acquisizione. Nella finestra di acquisizione, fare clic sulla scheda di esecuzione automatica per avviare lo strumento e acquisire spettri di massa dai campioni sul chip.Per l'analisi dei dati, eseguire il programma di analisi dei dati, quindi sfogliare l'albero del database e selezionare l'ID del chip.Fare clic per evidenziare un bersaglio bene sul chip e fare clic sull'icona dello spettro per mostrare lo spettro di massa. Fare clic con il pulsante destro del mouse per scegliere la finestra di dialogo di personalizzazione e ritagliare un intervallo di spettro specifico in una nuova finestra, quindi fare clic sull'asse x per digitare i limiti superiore e inferiore di M per Z e premere OK per mostrare lo spettro di gamma specificato inclusi i segnali di interesse. Per misurare l'altezza di picco dei valori dei segnali M per Z corrispondenti al substrato uracile, al prodotto AP e al modello, fare clic sul picco e visualizzare l'altezza del picco nell'angolo in alto a sinistra dello schermo.Infine, per salvare lo spettro per la registrazione, fare clic con il pulsante destro del mouse su Esporta e selezionare il tipo di file come JPEG nell'elenco a discesa. Fare clic sulla destinazione e sfogliare il disco per selezionare il dispositivo di archiviazione nell'elenco a discesa, quindi digitare il nome del file e fare clic su Esporta. Il sistema modello per un test della dna glicosilasi è mostrato qui.Il DNA modello di 19 nucleotidi è rimasto invariato dopo l'idrolisi della glicosilasi. Pertanto, il segnale potrebbe servire come riferimento per la quantificazione del prodotto AP. La differenza di un nucleotide tra il substrato e il modello corrispondente ha prodotto un profilo di segnale ben separato per entrambi.Il segnale del prodotto AP era anche ben separato da quello del substrato contenente uracile. Per l'analisi dei dati MS, sono state misurate le altezze dei picchi. L'analisi del corso temporale per l'attività UDG a 0,01, 0,02, 0,05 e 0,1 ha dimostrato sia la dipendenza dalla dose che dal tempo.Un esempio di grafico della velocità di reazione con le relative intensità del segnale MS del prodotto e del substrato in concentrazioni nanomolari è mostrato qui. La velocità di reazione UDG è presentata come nanomoli del sito AP prodotti al secondo. Il KM e il VMAX sono stati calcolati dal diagramma di Lineweaver Burk.L'unità misurata con spettrometria di massa MALDI-TOF era proporzionale all'unità definita da 0,001 unità a 0,02 unità con un coefficiente di determinazione apprezzabile. L'inibizione dell'attività UDG da parte di un inibitore della glicosilasi uracile è mostrata qui. In presenza di 100 picomoli dell'inibitore, l'attività di 0,05 unità di UDG è stata inibita a un livello non rilevabile e l'IC50 è risultato essere 7,6 picomoli.Poiché le dimensioni ap sono labili e possono essere idrolizzate da una reazione di eliminazione beta a pH estremo e temperatura elevata, la tempra del saggio deve essere eseguita su ghiaccio per il periodo definito. Inoltre, utilizzare un pHmetro per assicurarsi che HCL acidifichi il tampone di reazione al pH desiderato e tris base neutralizzato correttamente la miscela di prodotto. Questo metodo può anche essere modificato per analizzare la glicosilasi del DNA bifunzionale.Ad esempio, U + 2 T3 è un substrato adatto per il test della glicosilasi dna formamidopirimidina. I prodotti di scissione dell'attività della legasi FPG AP possono essere facilmente rilevati dalla massa MALDI-TOF. Questo metodo ha il potenziale per diventare il metodo di riferimento per la misurazione della glicosilasi monofunzionale e può anche essere utilizzato come strumento per lo screening degli inibitori della glicosilasi per lo sviluppo farmaceutico.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Ricerca

Biochimica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Isolamento Droplet per l&#39;analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Glycoproteomics della matrice extracellulare: Un metodo per l&#39;analisi Intact Glycopeptide Utilizzando la spettrometria di massa

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

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The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Correzione di bozze e saggio di riparazione del DNA usando l'analisi di spettrometria di massa di singolo Nucleotide estensione e MALDI-TOF

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

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Nitropeptide Profilazione e identificazione illustrata da Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Preparazione del campione per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...