Name: uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis
Uploaded: 2022-04-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

NCFPB Fonksiyonel Genomik Entegre Çekirdek Tesisi'ne (Taipei, Tayvan) ve NRPB Farmakogenomik Laboratuvarı'na (Taipei, Tayvan) teknik destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Tayvan, R.O..C. Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından desteklenmiştir [hibe numarası MOST109-2314-B-002 -186 - K.-Y.S., ÇOĞU 107-2320-B-002-016-MY3 - S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 - W.-h.F.]. H.-L.C., Ulusal Tayvan Üniversitesi'nden doktora bursu almıştır. Açık erişim ücreti için finansman: Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, R.O.C.

1. Substrat/şablon hazırlama
<ol><li>Dubleks bölge için ~50 ± %10 dengeli G + C içeriğine ve minimum 50 °C erime sıcaklığına sahip urasil substrat/şablon dubleks tasarlayın. NOT: 18 nt substratlar ve 19 nt şablonları arasındaki bir nükleotid farkı (Tablo 1 ve Şekil 1) daha iyi MS sinyali yorumlamasına ve uygun tavlamaya yardımcı olur. Şablon iplikçik, A-U veya G-U uyumsuzlukları üretmek için tamamlayıcı DNA görevi görür ...

Bu yazıda, AP içeren DNA ürünlerini doğrudan tespit etmek için UDG MALDI-TOF MS tahlil yönteminin kullanılması için ayrıntılı bir prosedür sunulmaktadır. Bu yöntemin temel avantajları, urasil içeren substratların etiketsiz, ölçeklenebilir, kullanımı kolay olması ve substrat tasarımında daha fazla esneklik sağlamasıdır.
UDG tedarikçisi tarafından önerilen fenol / kloroform ekstraksiyonu, ürün DNA'sının bozulmasını önlemek için enzimin inaktivasyonunu sağ...

Urasil RNA'da normal bir baz olmasına rağmen, genomik DNA'da sık görülen ve oldukça mutajenik bir lezyondur. Urasil, bir deoksisitidinin spontan/enzimatik hidrolitik deaminasyonundan kaynaklanabilir. Her canlı hücrede, bu deaminasyon fizyolojik koşullar altında günde 100-500 kez gerçekleşir1,2. Bu değişiklikler onarılmazsa, DNA dizisi bileşiminde mutasyona neden olan bir değişiklik olabilir. DNA'daki urasil, replikasyon sırasında dATP ile eşleşmeyi tercih ettiğinden, sitozin urasil'e deaminasyon yaparsa, iki replikasyon olayında, döl DNA3'ün yarısında yeni bir G: C'den A: T'ye geçiş mutasyonu olacaktır.
Genetik stabiliteyi korumak için hücresel stratejiler arasında, baz eksizyon onarımı (BER), DNA4'teki urasil gibi hasarlı bazları onaran önemli bir mekanizmadır. BER, evrimsel olarak oldukça korunmuş bir süreçtir. İki genel BER yolu vardır: tek bir nükleotidin onarım yoluna giden kısa yama yolu ve en az iki nükleotidin onarım yolunu üreten uzun yama yolu5. BER, birkaç adımda gerçekleşen koordineli bir mekanizmadır. BER'deki ilk adım, hasarlı nükleotid bazının hasara özgü bir DNA glikozilaz tarafından enzimatik hidrolizidir ve bir apurinik / apirimididinik (AP) ara bölge oluşturur6. Bunu, AP bölgesindeki şeker-fosfat omurgasının bir endonükleaz tarafından bölünmesi, DNA uçlarının bir liyaz ile temizlenmesi, bir DNA polimeraz ile boşluk doldurulması ve son nickin bir ligaz ile kapatılması izler5.
Urasil-DNA glikozilaz (UDG), urasili Escherichia coli'deki BER için urasil içeren DNA'dan hidrolize eder. Farklı ayırma tekniklerini içeren radyo-etiketli DNA kullanan geleneksel UDG testleri6,7,8,9,10,11,12,13 genellikle zaman alıcı, emek yoğun, maliyetli etiketleme reaktifleri, karmaşık prosedürler ve radyoaktif maddelere maruz kalma risklerini azaltmak için yoğun eğitim ve uygulama gerektirir. Florometrik oligonükleotid testleri, moleküler işaretçilere ve Förster rezonans enerji transfer teknolojisine15,16,17,18,19,20 ek olarak radyoizotop etiketlemesinin14 yerine geliştirilmiştir. Bununla birlikte, yukarıda belirtilen tüm yöntemler için özel etiketleme gereklidir. Son zamanlarda etiketsiz biyosensör tahlilleri21,22,23 ve G-dörtlüx24,25,26 oluşumuna dayanan kolorimetrik yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, problardaki çoklu A: U çiftleri veya özel olarak tasarlanmış diziler, enzim birimi tanımını zorlaştırır.
MALDI-TOF MS, DNA ANALIZINDE ÇOK FAYDALı OLABILECEK BIR TEKNOLOJIDIR. Geliştirilen uygulamalar arasında tek nükleotid polimorfizmi genotipleme27,28, modifiye nükleotid analizi29 ve DNA onarımı ara tanımlama30,31,32,33,34 bulunmaktadır. MALDI-TOF MS, AP bölgesi içeren DNA ürünlerini tespit etmek için DNA glikozilaz analizi için kolayca benimsenmelidir. Bununla birlikte, DNA'daki AP bölgeleri birçok deneysel koşulda iplikçik kopmasına eğilimlidir33. Burada, önemli bir iplik kopma gürültüsü olmadan AP saha üretimini doğrudan ölçmek için MALDI-TOF MS kullanılarak bir UDG testi sunulmaktadır. Bu etiketsiz yöntemle çalışmak kolaydır ve DNA glikozilaz inhibitörü taramasının farmasötik uygulaması için yüksek bir potansiyele sahiptir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)</td>
			<td>J.T baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved deionized water</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>AQUAGLOVE</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2,3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(0.5-10 &#181;L)</td>
			<td>extra gene</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(1,250 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low retention pipette tips(200 &#181;L)</td>
			<td>national scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 4, 5 
			Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td>RS1000</td>
			<td>Protocol 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Kubota</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Clubio</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>National scientific supply co, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube rack</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P1000)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette&#160; (P2)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P10)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P100)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (P200)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (SL2)</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Singapore)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quest Graph IC50 Calculator (v.1)</td>
			<td>AAT Bioquest, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Fig. 4 
			https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>WAKO</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCHIP array</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#01509</td>
			<td>Protocol 3, 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Taiwan.Inc</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typer 4.0 software</td>
			<td>&#160;Agena Bioscience, CA</td>
			<td>#10145</td>
			<td>Protocol 6 
			Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDG Reaction Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>B0280S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil Glycosylase Inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0281S</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil-DNA Glycosylase</td>
			<td>New England Biolabs, MA</td>
			<td>M0280L</td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601</td>
			<td>SHIMADZU</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)</td>
			<td></td>
			<td>Protocol 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

uracil-dna glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis

Urasil-DNA glikozilaz (UDG), sitozinin hidrolitik deaminasyonundan oluşan urasilin düzeltilmesi için baz eksizyon onarım yolunda önemli bir bileşendir. Bu nedenle, genom bütünlüğünün korunması için çok önemlidir. UDG aktivitesini ölçmek için oldukça spesifik, etiketsiz, radyo-izotopik olmayan bir yöntem geliştirilmiştir. Bölgeye özgü bir urasil içeren sentetik bir DNA dubleks, UDG tarafından bölündü ve daha sonra Matris destekli Lazer Desorpsiyon / İyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometrisi (MALDI-TOF MS) analizine tabi tutuldu. DNA'daki apurinik / apirimidinik bölge (AP) ürününü iplik kopmadan korumak için bir protokol oluşturuldu. Substrattan ürüne m/z değerindeki değişim, urasil hidrolizini UDG ile değerlendirmek için kullanıldı. UDG kinetik analizi için Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM / s ve Kcat = 9.31 s-1 veren bir G: U substratı kullanıldı. Bu yöntemin urasil glikozilaz inhibitörü (UGI) testine uygulanması, 7.6 pM'lik bir IC50 değeri vermiştir. Tek sarmallı ve çift sarmallı DNA substratları içinde çeşitli pozisyonlarda urasil kullanan UDG özgüllüğü, farklı bölünme verimlilikleri göstermiştir. Bu nedenle, bu basit, hızlı ve çok yönlü MALDI-TOF MS yöntemi, çeşitli monofonksiyonel DNA glikozilazları için mükemmel bir referans yöntemi olabilir. Aynı zamanda DNA glikozilaz inhibitörü taraması için bir araç olarak potansiyele sahiptir.

Şablonlar ve alt tabakalar Örnek olarak bir G şablonu ile eşleştirilmiş merkezde U ile sentetik oligonükleotidler (U + 9) alındığında (Şekil 1A), sentetik oligonükleotid saflığının kalite kontrolü için eşdeğer miktarda şablon ve urasil içeren substratın boş bir kontrolü kullanılabilir (Şekil 1B; sinyaller belirlenen m / z ve düşük arka plan gürültüsü ile eşleşir). MS veri analizi için tepe yükseklikleri ...

Watch this Scientific Journal Video about Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Urasil-DNA glikozilaz aktivitesini test etmek için etiketlenmemiş, radyo-izotopik olmayan bir yöntem, doğrudan apurinik / apirimidinik alan içeren ürün analizi için MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak geliştirilmiştir. Tahlil, DNA glikozilaz ölçümü için oldukça basit, spesifik, hızlı ve kullanımı kolay olduğunu kanıtladı.

Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

DNA onarım mekanizmaları, tüm canlı organizmalarda genom bütünlüğünün korunması için çok önemlidir. Urasil-DNA glikozilaz, temel doku onarım yolunda çok önemli bir DNA onarım proteinidir. MALDI-TOF kütle spektrometrisini kullanarak, enzim aktivitesi testi için AP ürününü doğrudan tespit edebiliriz.Geleneksel glikozilaz testi, substrat emeği gerektirir. Bu yöntem etiketsizdir ve urasil substratından AP ürününe kütle değişimini doğrudan tespit eder. Diğer avantajlar arasında yüksek özgüllük, çok yönlülük, ölçeklenebilirlik, hız ve gerçekleştirilmesi kolay bulunur.Örnek olarak E.coli urasil-DNA glikozilaz kullandık. Bu yöntem diğer DNA glikozilaz testleri için kolayca değiştirilebilir. Doğru pipetleme ve seyreltme becerilerine sahip iyi eğitimli laboratuvar personeli çok önemlidir.Daha iyi sinyaller ve daha az arka plan gürültüsü için taze hazırlanmış reaktifler ve düşük tuz tamponları kullanılmalıdır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Hui-Lan Chang olacak. T1 U+9 dubleksin guanin-urasil baz taşıyan substratını kullanan bir DNA glikozilaz testi için, 1,5 mililitrelik steril mikrosantrifüj tüpüne 70 mikrolitre su, 10 mikrolitre 10X urasil-DNA glikozilaz veya UDG reaksiyon tamponu, beş mikrolitre T1 stoğu ve beş mikrolitre U+9 stoğu ekleyin.Tüpü 65 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe etmeden önce, ardından 37 santigrat derecede 30 dakika ve son olarak substrat şablonu dubleksin uygun şekilde tavlanmasını sağlamak için üç dakika boyunca buz üzerinde kapatın. Daha sonra, yeni bir 1,5 mililitrelik tüpte, 49 mikrolitre buz gibi soğuk UDG reaksiyon tamponu ve bir mikrolitre seyreltilmiş UDG ekleyin, ardından istenen enzim konsantrasyonları için UDG tamponu ile seri seyreltmeler hazırlayın ve seyreltilmiş UDG'yi buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, başka bir 1.5 mililitrelik tüpte, hazırlanan substrat karışımının dokuz mikrolitresini ekleyin ve 37 santigrat derecede önceden ısıtın, ardından seyreltilmiş UDG'nin bir mikrolitresini ekleyin ve içeriği karıştırmak için tüpü hareket ettirin.Reaksiyon karışımını kısaca santrifüj edin ve tüpü inkübasyon için hemen 37 santigrat dereceye yerleştirin. Reaksiyonu zamanlamak için zamanlayıcıyı kullanın. Reaksiyon sonlandırma için, 0.25 molar hidroklorik asit ve 0.23 molar tris baz çözeltisi hazırlayın.Reaktifi hazırlarken pH'ı doğrulamak için pH metre kullanın ve reaksiyon sonlandırma adımını çalıştırmadan önce pH şeridi ile test edin, ardından bir mikrolitre 0.25 molar hidroklorik asit ile 10 mikrolitre tris-EDTA'yı asitleştirin ve pH'ın yaklaşık iki artı veya eksi 0.5 olduğundan emin olun. Çözeltiyi bir mikrolitre tris baz ile nötralize edin ve nihai pH'ın yaklaşık 6.5 artı veya eksi 0.5 olduğundan emin olun. Daha sonra, enzimi inaktive etmek için reaksiyon karışımına bir mikrolitre 0.25 molar hidroklorik asit ekleyin ve tüpü altı dakika boyunca buz üzerine yerleştirin, ardından DNA ürünlerini nötralize etmek ve aside uzun süre maruz kalarak AP bölgesi kırılmasını önlemek için bir mikrolitre tris baz ekleyin.Matris çip transferi için ürün karışımının hacmini artırmak için 13 mikrolitre tris-EDTA ekledikten sonra, tüpü buzun üzerine yerleştirin. Son olarak, 25 mikrolitrelik UDG reaksiyon ürünlerinin tümünü mikrosantrifüj tüplerinden 384 delikli bir mikrotitre plakasına aktarın. Nanolitre dağıtıcının kapısını açın ve 384 delikli mikrotitre plakasını güvertenin plaka tutucusuna yükleyin, ardından matris çip dizisini ilgili keşif plakası konumuna yerleştirin.Yüklü izci plakasını nanolitre dağıtıcının işleme güvertesine yerleştirin ve kapıyı kapatın. Aktarım ekranındaki çalıştır düğmesine dokunun ve cihazın mikrotitre plakasından matris çipine numune dağıtmaya başlamasını bekleyin. Ardından, vizyon sekmesi seçeneğini kullanarak, dağıtım sırasında her nokta için çipin görüntüsünü ve dağıtım hacimlerini gösterin.Çip üzerindeki lekeli hacmin beş ila 10 nanolitre aralığında olduğundan emin olun. Uygun uygulama programını kullanarak, içe aktarma için tahmin edilen M by Z değerini içeren bir xlsx dosyası hazırlayın. Ardından, tahlil grubunu tasarımcı biçiminde içe aktar seçeneğine sağ tıklayıp açılır listeden Excel dosyasını seçerek yeni bir UDG testi oluşturmak ve tanımlamak için uygulama programını kullanın.Ardından, müşteri proje plakası düğmesine sağ tıklayın ve yeni bir tahlil plakası oluşturmak için açılır seçenek ağacının üst kısmına tıklayın. Ardından iletişim kutusuna bir dosya adı yazın. Plaka tipi açılır menüsünde, 384 delikli plaka tipini seçin.Tamam'a basın ve ekranın sağında boş bir plaka görünmesini bekleyin. Ardından, tahlil seçeneğini tıklayın ve açılır listeden tahlili seçin. Seçilen tahlili plaka üzerindeki her numune nokta konumuna atamak için, imleci boş plakanın her bir konumuna getirin, kuyuyu vurgulamak için tıklatın ve plak ekle'yi seçmek için sağ tıklatın.Bir masaüstü veya dizüstü bilgisayar kullanarak, çipteki tüm örnekler için üstbilgi içermeyen xlsx biçiminde bir çalışma listesi hazırlayın, ardından yeni örnek proje ekle düğmesine tıklayın ve çalışma listesini içe aktarmak için açılır listeden dosyayı seçin. Ekranın solundaki çalışma listesinde tüm test numune kodlarını arayın, ardından çalışma listesinde bir örnek kodu tıklayın ve testleri her bir konuma bağlamak için plakanın ilgili konumuna sağ tıklayın. Güverteyi uzatmak ve talaş tutucuyu çıkarmak için kütle spektrometresinin giriş/çıkış düğmesine basın.Numune çipini talaş tutucuya yerleştirin, yüklü talaş tutucuyu genişletilmiş güverteye yerleştirin ve numune çipinin cihaza girmesi için giriş/çıkış düğmesine tekrar basın. Kütle spektrometresi kontrol programında, al simgesine çift tıklayın. Al penceresinde, cihazı başlatmak ve çip üzerindeki örneklerden kütle spektrumları elde etmek için otomatik çalıştırma sekmesine tıklayın.Veri analizi için, veri analizi programını çalıştırın, ardından veritabanı ağacına göz atın ve çip ID'sini seçin.Çip üzerinde bir hedef kuyusunu vurgulamak için tıklayın ve kütle spektrumunu göstermek için spektrum simgesine tıklayın. Özelleştirme iletişim kutusunu seçmek için sağ tıklayın ve yeni bir pencerede belirli bir spektrum aralığını kırpın, ardından M x üst sınırlarını Z'nin üst ve alt sınırlarını yazın ve ilgilenilen sinyaller de dahil olmak üzere belirtilen aralık spektrumunu göstermek için Tamam'a basın. Urasil substratına, AP ürününe ve şablonuna karşılık gelen M sinyallerinin tepe yüksekliğini Z değerleriyle ölçmek için, tepe noktasına tıklayın ve ekranın sol üst köşesindeki tepe yüksekliğini görüntüleyin.Son olarak, kayıt tutma spektrumunu kaydetmek için, dışa aktarmaya sağ tıklayın ve açılır listeden dosya türünü JPEG olarak seçin. Hedefe tıklayın ve açılır listeden depolama cihazını seçmek için diske göz atın, ardından dosya adını yazın ve dışa aktar'ı tıklayın. DNA glikozilaz testi için model sistem burada gösterilmiştir.19 nükleotid şablon DNA'sı glikozilaz hidrolizinden sonra değişmeden kaldı. Bu nedenle, sinyal AP ürününün niceliği için bir referans görevi görebilir. Substrat ve ilgili şablon arasındaki bir nükleotidin farkı, her ikisi için de iyi ayrılmış bir sinyal profili üretti.AP ürününün sinyali de urasil içeren substratınkinden iyi bir şekilde ayrılmıştı. MS veri analizi için tepe yükseklikleri ölçüldü. UDG aktivitesi için 0.01, 0.02, 0.05 ve 0.1'deki zaman kursu analizi hem doz hem de zaman bağımlılığını göstermiştir.Nanomolar konsantrasyonlarda ürünün ve substratın göreceli MS sinyal yoğunlukları ile reaksiyon hızı grafiğine bir örnek burada gösterilmiştir. UDG reaksiyon hızı, saniyede üretilen AP bölgesinin nanomolleri olarak sunulur. KM ve VMAX, Lineweaver Burk arsasından hesaplandı.MALDI-TOF kütle spektrometresi ölçülen birimi, 0.001 birimden 0.02 birime kadar tanımlanan birimle orantılıydı ve kayda değer bir belirleme katsayısı vardı. UDG aktivitesinin bir urasil glikozilaz inhibitörü tarafından inhibisyonu burada gösterilmiştir. İnhibitörün 100 pikomol varlığında, 0.05 ünite UDG'nin aktivitesi saptanamayan bir seviyeye inhibe edildi ve IC50'nin 7.6 pikomol olduğu bulundu.AP boyutu kararsız olduğundan ve aşırı pH ve yüksek sıcaklıkta bir beta eliminasyon reaksiyonu ile hidrolize edilebildiğinden, tanımlanan süre boyunca buz üzerinde tahlil söndürme yapılmalıdır. Ayrıca, HCL'nin reaksiyon tamponunu istenen pH'a asitleştirdiğinden ve tris bazının ürün karışımını uygun şekilde nötralize ettiğinden emin olmak için bir pH metre kullanın. Bu yöntem aynı zamanda iki fonksiyonlu DNA glikozilazını analiz etmek için de değiştirilebilir.Örneğin, U + 2 T3, formamidopirimidin DNA glikozilaz testi için uygun bir substrattır. FPG AP ligaz aktivitesinin bölünme ürünleri MALDI-TOF kütlesi ile kolayca tespit edilebilir. Bu yöntem, monofonksiyonel glikozilaz ölçümü için referans yöntem olma potansiyeline sahiptir ve farmasötik gelişim için glikozilaz inhibitörü taraması için bir araç olarak da kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Hücre dışı Matrix Glycoproteomics: Kütle Spektrometresi kullanarak Sağlam GLİKOPEPTİT Analizi için Bir Yöntem

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Örnekleri için matris peptit esaslı tamir Formalin en iyi hazırlık lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi iş akışlarını görüntüleme destekli

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probuelektrosprey Iyonizasyon Kütle Spektrometresi için Örnek Hazırlama

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...