Name: collection, expansion, and differentiation of primary human nasal epithelial cell models for quantification of cilia beat frequency
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency at JoVE.com

Vi takker undersøgelsesdeltagerne og deres familier for deres bidrag. Vi sætter pris på hjælpen fra Sydney Children's Hospitals (SCH) Randwick respiratoriske afdeling i organisationen og indsamlingen af patientbiospecimens - særlig tak til Dr. John Widger, Dr. Yvonne Belessis, Leanne Plush, Amanda Thompson og Rhonda Bell. Vi anerkender hjælpen fra Iveta Slapetova og Renee Whan fra Katharina Gaus Light Microscopy Facility inden for Mark Wainwright Analytical Center ved UNSW Sydney. Dette arbejde støttes af National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), CF Foundation Australia og Sydney Children's Hospital Foundation. Forfatterne vil gerne anerkende Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health for dets bidrag og støtte. Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health er et non-profit kooperativt joint venture mellem Sydney Children's Hospitals Network, Children's Medical Research Institute og Children's Cancer Institute. Det er blevet oprettet med støtte fra NSW-regeringen for at koordinere og integrere pædiatrisk forskning. Luminesce Alliance er også tilknyttet University of Sydney og University of New South Wales Sydney. KMA støttes af et australsk regerings forskningsuddannelsesprogramstipendium. LKF er støttet af Rotary Club of Sydney Cove / Sydney Children's Hospital Foundation og UNSW University postgraduate award stipendier.

Undersøgelsesgodkendelse blev modtaget fra Sydney Children's Hospital Network Ethics Review Board (HREC/16/SCHN/120). Der blev indhentet skriftligt samtykke fra alle deltagere (eller deltagernes værge) forud for indsamlingen af biospecimens.
1. Forberedelser til etablering af luftvejsepitelcellemodeller
<ol><li>Forbered næsecelleopsamlingsmedier ved at kombinere 80% Dulbeccos modificerede Eagle Medium og 20% Føtalt Bovin Serum. Suppler med 1 μL/ml penicillin/streptomyci...

<ol>
	<li>Barbato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+a+consensus+statement+on+diagnostic+and+treatment+approaches+in+children.">Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children.</a> European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).</li><li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Chioccioli, M., Feriani, L., Kotar, J., Bratcher, P. E., Cicuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+ciliary+dynamics+and+coordination+in+response+to+CFTR-modulators+in+Cystic+Fibrosis+respiratory+epithelial+cells.">Phenotyping ciliary dynamics and coordination in response to CFTR-modulators in Cystic Fibrosis respiratory epithelial cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1763 (2019).</li><li>Hirst, R. A., Rutman, A., Williams, G., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliated+air-liquid+cultures+as+an+aid+to+diagnostic+testing+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Ciliated air-liquid cultures as an aid to diagnostic testing of primary ciliary dyskinesia.</a> Chest. 138 (6), 1441-1447 (2010).</li><li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia.">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).</li><li>Coles, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+culture+of+airway+epithelial+cells+as+a+diagnostic+tool+for+primary+ciliary+dyskinesia.">A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (11), (2020).</li><li>Pifferi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+cell+culture+method+for+the+diagnosis+of+atypical+primary+ciliary+dyskinesia.">Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia.</a> Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).</li><li>Pifferi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+diagnosis+of+primary+ciliary+dyskinesia:+cell+culture+and+soft+computing+analysis.">Rapid diagnosis of primary ciliary dyskinesia: cell culture and soft computing analysis.</a> European Respiratory Journal. 41 (4), 960-965 (2013).</li><li>Lee, D. D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+throughput+drug+screening+for+rare+respiratory+diseases:+Readthrough+therapy+in+primary+ciliary+dyskinesia.">Higher throughput drug screening for rare respiratory diseases: Readthrough therapy in primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 58 (4), 2000455 (2021).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Dabrowski, M., Bukowy-Bieryllo, Z., Jackson, C. L., Zietkiewicz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+non-aminoglycoside+compounds+used+to+stimulate+translational+readthrough+of+PTC+mutations+in+primary+ciliary+dyskinesia.">Properties of non-aminoglycoside compounds used to stimulate translational readthrough of PTC mutations in primary ciliary dyskinesia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), (2021).</li><li>Hirst, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+primary+ciliary+dyskinesia+epithelial+cells+at+air-liquid+interface+can+alter+ciliary+phenotype+but+remains+a+robust+and+informative+diagnostic+aid.">Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid.</a> PloS One. 9 (2), 89675 (2014).</li><li>Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+three-dimensional+explant+spheroids+derived+from+human+nasal+airway+epithelium:+a+simple+methodological+approach+for+ex+vivo+studies+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia.</a> Cilia. 6, 3 (2017).</li><li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging:+comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods.">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li><li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+cilia+and+ciliated+epithelial+ultrastructure+in+healthy+children+and+young+adults.">Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults.</a> Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).</li><li>Castillon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+and+associated+epithelial+proteins+during+the+regeneration+of+human+airway+surface+epithelium+in+three-dimensional+culture.">Polarized expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and associated epithelial proteins during the regeneration of human airway surface epithelium in three-dimensional culture.</a> Laboratory Investigation. 82 (8), 989-998 (2002).</li><li>Jorissen, M., Bessems, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+ciliary+beat+frequency+after+ciliogenesis+in+nasal+epithelial+cells+cultured+sequentially+as+monolayer+and+in+suspension.">Normal ciliary beat frequency after ciliogenesis in nasal epithelial cells cultured sequentially as monolayer and in suspension.</a> Acta Oto-Laryngologica. 115 (1), 66-70 (1995).</li><li>Conger, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+ciliary+beat+frequency+activation+by+the+CFTR+Modulators+Genistein,+VRT-532,+and+UCCF-152+in+primary+sinonasal+epithelial+cultures.">Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures.</a> JAMA Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).</li><li>Pique, N., De Servi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhinosectan((R))+spray+(containing+xyloglucan)+on+the+ciliary+function+of+the+nasal+respiratory+epithelium;+results+of+an+in+vitro+study.">Rhinosectan((R)) spray (containing xyloglucan) on the ciliary function of the nasal respiratory epithelium; results of an in vitro study.</a> Allergy, Asthma &amp; Clinical Immunology. 14, 41 (2018).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+antiviral+response+suppresses+ciliogenesis+and+motile+ciliary+functions+in+the+nasal+epithelium.">Host antiviral response suppresses ciliogenesis and motile ciliary functions in the nasal epithelium.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 581340 (2020).</li><li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells.">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).</li><li>Ballenger, J. J., Orr, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+human+ciliary+activity.">Quantitative measurement of human ciliary activity.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 72, 31-39 (1963).</li><li>Mercke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+varying+air+humidity+on+mucociliary+activity.">The influence of varying air humidity on mucociliary activity.</a> Acta Oto-Laryngologica. 79 (1-2), 133-139 (1975).</li><li>Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+airway+ciliary+beat+frequency+by+intracellular+pH.">Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH.</a> Journal of Physiology. 560, 519-532 (2004).</li><li>Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammalian+ciliary+beating.">Regulation of mammalian ciliary beating.</a> Annual Review of Physiology. 69, 401-422 (2007).</li><li>Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+functional+analysis:+Beating+a+path+towards+standardization.">Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization.</a> Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).</li><li>Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+ciliary+beat+pattern+in+three+different+beating+planes+in+healthy+subjects.">Variation of ciliary beat pattern in three different beating planes in healthy subjects.</a> Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).</li><li>Jackson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+diagnostic+testing+in+primary+ciliary+dyskinesia.">Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).</li><li>Feriani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+collective+dynamics+of+motile+cilia+in+cultures+of+human+airway+cells+by+multiscale+DDM.">Assessing the collective dynamics of motile cilia in cultures of human airway cells by multiscale DDM.</a> Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Martinovich, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+primary+airway+epithelial+cells+maintain+morphology,+lineage+and+disease+specific+functional+characteristics.">Conditionally reprogrammed primary airway epithelial cells maintain morphology, lineage and disease specific functional characteristics.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17971 (2017).</li><li>Wong, J. Y., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+the+ciliated+epithelium+following+acute+bronchiolitis+in+infancy.">Recovery of the ciliated epithelium following acute bronchiolitis in infancy.</a> Thorax. 60 (7), 582-587 (2005).</li><li>Gentzsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+rescue+of+conditionally+reprogrammed+cystic+fibrosis+bronchial+epithelial+cells.">Pharmacological rescue of conditionally reprogrammed cystic fibrosis bronchial epithelial cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (5), 568-574 (2017).</li><li>Sommer, J. U., Gross, S., Hormann, K., Stuck, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+changes+in+nasal+ciliary+beat+frequency.">Time-dependent changes in nasal ciliary beat frequency.</a> European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 267 (9), 1383-1387 (2010).</li><li>Ratjen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis.">Cystic fibrosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1, 15010 (2015).</li><li>Delmotte, P., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+frequency+is+maintained+at+a+maximal+rate+in+the+small+airways+of+mouse+lung+slices.">Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 110-117 (2006).</li><li>Smith, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooling+of+cilia+allows+functional+analysis+of+the+beat+pattern+for+diagnostic+testing.">Cooling of cilia allows functional analysis of the beat pattern for diagnostic testing.</a> Chest. 140 (1), 186-190 (2011).</li><li>Raidt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+pattern+and+frequency+in+genetic+variants+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).</li></ol>

Der er flere faktorer, der kan skjule kvantificeringen af CBF i næseepitelark. Epitelark skal afbildes inden for 3-9 timer efter prøveindsamling, da ciliaryfunktionen er mest stabil i løbet af denne tid37. Mindre røde blodlegemer og snavs er mest optimale til billeddannelse, da disse forstyrrer dataindsamlingen. Når du vælger et investeringsafkast til billeddannelse, er det vigtigt at vælge et epitelark, der ikke er blevet beskadiget eller forstyrret under indsamlingen af prøven, og ikke e...

Målinger af Cilia Beat Frequency (CBF) og mønster er blevet etableret som diagnostiske værktøjer til luftvejssygdomme såsom Primary Ciliary Dyskinesia (PCD)1. I cystisk fibrose (CF) forårsager dysfunktion af CF Transmembrane konduktansregulatoren (CFTR) chloridkanal dehydrering af luftvejsoverfladevæsken og nedsat mucociliær clearance2. Ciliaryfunktion er blevet undersøgt in vitro i primære luftvejscellemodeller som en indikator for CFTR-kanalaktivitet3. Der er imidlertid betydelig variation mellem patienter i CBF som reaktion på CFTR-modulerende lægemidler, selv for patienter med de samme CFTR-mutationer 3. Desuden er virkningen af dysfunktionel CFTR-reguleret chloridsekretion på ciliær funktion dårligt forstået. Der findes i øjeblikket ingen omfattende protokol, der viser prøveforberedelse af in vitro-luftvejsmodeller , billedoptagelse og analyse af CBF.
Næseepitelplader isoleret fra næseslimhindebørstninger anvendes direkte til målinger af ciliær funktion til PCD-diagnose4. Men selvom der ikke er nogen kontrol over størrelsen eller kvaliteten af de opnåede næseepitelark, varierer CBF afhængigt af, om det måles på enkeltceller eller celleark og på epitelark cilierede kanter, der er forstyrret eller uforstyrret5. Som sådan kan sekundære dyskinesier forårsaget af skader på celler under indsamling af næseslimhindebørstninger påvirke CBF. Primær cellekultur af nasale epitelceller og deres differentiering ved Air-Liquid Interface (ALI) eller i tredimensionel kældermembranmatrix i cilierede luftvejsepitelorganoider giver anledning til cilier, der er fri for sekundære dyskinesier 4,6,7,8. Luftvejsepitelceller differentieret ved ALI (fremover kaldet ALI-modeller) er blevet betragtet som et vigtigt sekundært diagnostisk hjælpemiddel, der replikerer ciliary beat-mønstre og hyppighed af ex vivo nasal slimhindebørstning6 og muliggør analyse af ciliær ultrastruktur, taktmønster og slagfrekvens, samtidig med at patientspecifikke defekter bevares9 . Alligevel findes der uoverensstemmelser i de metoder, der bruges til at skabe disse pseudostratificerede, mucociliære differentierede cellemodeller. Forskellige kulturudvidelses- eller differentieringsprotokoller kan inducere forskellige epitelfænotyper (cilierede eller sekretoriske)10 og resultere i signifikante forskelle i CBF11. CBF er blevet kvantificeret i næseepitelbørster 4,6,12,13,14,15,16, luftvejsepitelorganoider 14,17,18 og ALI modeller 3,4,6,13,19,20, 21. Men blandt disse protokoller er der store variationer, og ofte er der mange parametre, der ikke kontrolleres for. For eksempel er CBF i nogle undersøgelser afbildet in situ, mens cellerne i ALI-modellen forbliver på den permeable støtteindsats 3,19,20,21, mens andre skraber cellerne fra den permeable støtteindsats og afbilder dem suspenderet i medier 4,6,13.
Desuden er den bredere anvendelse af teknikker, der måler ciliær funktion, begrænset af ciliaryfunktionens ekstreme modtagelighed for ændringer i miljøfaktorer. Miljøfaktorer som temperatur22, fugtighed 23,24 og pH 25,26 påvirker ciliaryfunktionen og skal reguleres for at kvantificere CBF nøjagtigt. De forskellige fysiologiske parametre, der anvendes på tværs af forskellige laboratorier, og hvordan de påvirker CBF, er blevet gennemgået tidligere27.
Forskellige billeddannelsesteknologier og tilgange til CBF-målinger er rapporteret i litteraturen. Til PCD-diagnostik bruges videomikroskopi til at måle ciliær funktion28,29. For nylig blev en videoanalysealgoritme baseret på differentiel dynamisk mikroskopi brugt til at kvantificere både CBF- og cilia-koordinering i luftvejsepitelcelle ALI-modeller 3,30. Denne metode muliggør karakterisering af ciliary beating i luftvejsepitelceller på en hurtig og fuldautomatisk måde uden behov for at segmentere eller vælge regioner. Forskellige metoder til billeddannelse og kvantificering af CBF kan øge de forskelle, der er rapporteret i CBF i litteraturen (supplerende fil 1).
En protokol fra kultur til kvantificering for at strømline eksisterende metoder, standardisering af kulturforhold og billedoptagelse, udført under strenge miljøkontrollerede forhold, ville muliggøre konsekvent, reproducerbar kvantificering af CBF inden for og mellem individer.
Denne protokol giver en komplet beskrivelse af samlingen af epitelceller, ekspansions- og differentieringskulturbetingelser og kvantificering af CBF i tre forskellige luftvejsepitelcellemodelsystemer af nasal oprindelse: 1) native epitelark, 2) ALI-modeller afbildet på permeable støtteindsatser og 3) Extracellular Matrix (ECM) -indlejrede tredimensionelle organoider (figur 1 ). Nasale epitelceller opnået fra nasal inferior turbinat børstninger anvendes som repræsentanter for luftvejsepitellet, da de er en effektiv surrogat for bronchiale epitelceller31, mens de overvinder den invasive procedure forbundet med indsamling af bronchiale børstninger. CRC-metoden (Conditional Reprogramming Cell) bruges til at udvide primære luftvejsepitelceller til oprettelse af ALI-modeller og tredimensionelle organoider. Betinget omprogrammering af luftvejsepitelceller til en stamcellelignende tilstand induceres ved samkultur med væksthæmmet fibroblastfødecellesystem og Rho-associeret kinase (ROCK) hæmmer32. Det er vigtigt, at CRC-metoden øger populationsfordoblingen i luftvejsepitelceller, samtidig med at deres vævsspecifikke differentieringspotentiale bevares33,34. I alle luftvejsepitelcellemodeller fanges ciliaryfunktionen i et temperaturstyret kammer ved hjælp af et højhastighedsvideokamera med standardiserede billedoptagelsesindstillinger. Specialbyggede scripts anvendes til kvantificering af CBF.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63090/63090fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk for arbejdsgang. Efter børstning af deltagernes nasale ringere turbinat, anvendes luftvejsepitelceller på en af to måder. Enten isoleres luftvejsepitelark, og cilia-beatfrekvensen afbildes straks, eller luftvejsepitelceller udvides via den betingede omprogrammeringscellemetode. CRC-ekspanderede luftvejsepitelceller differentieres for at etablere luftvejsepitelceller ved en luft-væske-grænseflade eller luftvejsepitelorganoidkulturer. Billeddannelse af ciliary beatfrekvens erhverves ved hjælp af et levende cellebilledmikroskop med et opvarmnings- og fugtighedsmiljøkammer og et videnskabeligt kamera med hurtig billedhastighed (>100Hz). Dataanalyse udføres ved hjælp af specialbyggede scripts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63090/63090fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2786</td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanyl-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8541</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Zyla 4.2 sCMOS</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Fast frame rate (&#62;100 Hz) scientific camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6987</td>
			<td>50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI S Plan Fluor ELWD 20XC</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>MRH08230</td>
			<td>Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Gel Strainer 40 UM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431750</td>
			<td>Pore size 40 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470</td>
			<td>Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 &#956;m pore polyester membrane insert.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytology brushes</td>
			<td>McFarlane Medical</td>
			<td>33009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-Ham</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-Ham</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell imaging microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>250 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Scientific analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cryo.s vials</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3135</td>
			<td>Cryogenic vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI-FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>3.6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator NL Ti2 BLACK 2000</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td>2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>74220 706</td>
			<td>Bead bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1254302</td>
			<td>Thermal beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Computing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microscoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10&#160;mg streptomycin/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult Airway Organoid Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5060</td>
			<td>Airway Organoid Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-Ex Plus Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol-S</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5015</td>
			<td>Type I Collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReagentPack Subculture Reagents</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhEGF (Epidermal Growth Factor, human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td>25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Stage Top Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection, expansion, and differentiation of primary human nasal epithelial cell models for quantification of cilia beat frequency

Målinger af ciliafunktion (slagfrekvens, mønster) er blevet etableret som diagnostiske værktøjer til luftvejssygdomme såsom primær ciliær dyskinesi. Den bredere anvendelse af disse teknikker er imidlertid begrænset af den ekstreme modtagelighed af ciliær funktion for ændringer i miljøfaktorer, f.eks. temperatur, fugtighed og pH. I luftvejene hos patienter med cystisk fibrose (CF) forhindrer slimophobning ciliaslag. Cilian-funktion er blevet undersøgt i primære luftvejscellemodeller som en indikator for CF Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) kanalaktivitet. Imidlertid er der fundet betydelig patient-til-patient-variation i cilia-slagfrekvens som reaktion på CFTR-modulerende lægemidler, selv for patienter med de samme CFTR-mutationer . Desuden er virkningen af dysfunktionel CFTR-reguleret chloridsekretion på ciliær funktion dårligt forstået. Der er i øjeblikket ingen omfattende protokol, der demonstrerer prøveforberedelse af in vitro luftvejsmodeller, billedoptagelse og analyse af Cilia Beat Frequency (CBF). Standardiserede kulturforhold og billedoptagelse udført i en miljøkontrolleret tilstand ville muliggøre konsekvent, reproducerbar kvantificering af CBF mellem individer og som reaktion på CFTR-modulerende lægemidler. Denne protokol beskriver kvantificeringen af CBF i tre forskellige luftvejsepitelcellemodelsystemer: 1) native epitelark, 2) luft-væske-grænseflademodeller afbildet på permeable støtteindsatser og 3) ekstracellulære matrixindlejrede tredimensionelle organoider. De to sidstnævnte replikerer in vivo lungefysiologi, med slå cilia og produktion af slim. Ciliary-funktionen optages ved hjælp af et højhastighedsvideokamera i et miljøstyret kammer. Specialbyggede scripts bruges til analyse af CBF. Oversættelse af CBF-målinger til klinikken er tænkt som et vigtigt klinisk værktøj til at forudsige respons på CFTR-modulerende lægemidler pr. patient.

For at demonstrere effektiviteten af denne protokol til kvantificering af CBF præsenteres resultaterne af CBF målt i luftvejsepitelcelle-ALI-modeller afledt af tre deltagere med CF og tre raske kontroldeltagere. På dag 14 af kulturdifferentiering var der slagcilier til stede (figur 6). Fra dag 14 til 21 af kulturdifferentiering blev der observeret en statistisk signifikant (P < 0,0345) stigning i CBF inden for begge kohorter. På dag 21 af kulturdifferentiering var den gennemsnitlige CBF ...

Watch this Scientific Journal Video about Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency at JoVE.com

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Denne protokol beskriver nasal epitelcelleindsamling, ekspansion og differentiering til organotypiske luftvejsepitelcellemodeller og kvantificering af cilia-beatfrekvens via levende cellebilleddannelse og specialbyggede scripts.

Indsamling, udvidelse og differentiering af primære humane nasale epitelcellemodeller til kvantificering af cilia beatfrekvens

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

Vi beskriver samlingen af luftvejsstamceller fra næseslimhinden. Disse celler udvides og differentieres til et pseudostratificeret epitel i laboratoriet. Dette er in vitro-ekspansion og differentiering, som ligner vores luftveje in vivo, hvilket betyder, at der er specialiserede celler, såsom cilierede celler, til stede, der kan bruges til kvantificering af cilia beat-frekvens.For at muliggøre konsekvent og reproducerbar kvantificering af cilia beatfrekvens mellem forskellige individer og som reaktion på forskellige lægemidler standardiserer vi kulturforhold og billedoptagelse. Cilia beat frekvens målinger bruges som kliniske værktøjer i sygdom såsom primær ciliary dyskinesi. Vi håber at etablere dette som en klinisk markør for cystisk fibrose.Katelin Allan og Laura Fawcett, ph.d.-studerende fra mit laboratorium, og Dr. Sharon Wong, en postdoc fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren. Begynd med at bede deltageren om at trække vejret gennem munden. Derefter tager du en cytologibørste i den dominerende hånd og hviler det femte ciffer på deltagerens hage for at forankre hånden, indsæt cytologibørsten i deltagerens næsepassage i en 45-graders vinkel til deltagerens ansigt og før den gennem næsekødusen.Efter at have drejet børsten lodret, så den er vinkelret på deltagerens ansigt, skal du skubbe børsten forsigtigt, men fast, mod næsens sidevæg under det ringere turbinat, indtil det er i midten til den bageste del af det ringere turbinat. Drej børsten 360 grader op til tre gange. Fjern det derefter forsigtigt, vend indsættelsesmanøvren, så cellerne ikke løsnes fra børsten.Placer børsten i det forberedte opsamlingsrør med næsecelleopsamlingsmedie, og læg opsamlingsrøret på is. Efter blid hvirvel for at løsne celler fra børsten, overfør opsamlingsrøret på is tilbage til biosikkerhedsskabet. Brug en serologisk pipette til at overføre mediet fra opsamlingsrøret til et nyt rør og efterlade cytologibørsterne.Centrifugerer derefter prøven. Efter centrifugering resuspenderes cellepelleten i en milliliter betinget omprogrammering af cellemedier. Brug derefter en fem-milliliter serologisk pipette til at føre cellerne gennem en cellesigte placeret oven på et 50 milliliter rør i en cirkulær bevægelse.For at opnå en enkeltcellesuspension opsamles suspensionen fra bunden af røret og føres gennem sigten flere gange. Kassér derefter cellesigten. For at så luftvejsepitelcellerne på de forberedte permeable støtteindsatser blandes cellerne godt uden at skabe bobler, hvilket sikrer, at de er homogene og i suspension.Tilsæt derefter 150 mikroliter af cellesuspensionen til den apikale side af de forberedte permeable støtteindsatser. For at differentiere luftvejsepitelcellerne ved luft-væske-grænsefladen skal du dyrke dem i differentiering eller ALI-medier i to dage. Derefter aspireres mediet, og tilsæt kun 750 mikroliter ALI-medier til basalrummet for at skabe en luft-væske-grænseflade.For at så luftvejsepitelcellerne i ECM-kupler skal du resuspendere dissocierede luftvejsepitelceller med det passende volumen på 90% ECM. Hold derefter pipetten lodret i en 90-graders vinkel så tæt på bunden af brønden som muligt, dispenser 50 mikroliter ECM-cellesuspension til midten af brønden. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i 20 minutter, indtil ECM størkner.Mens ECM størkner, opvarmes Airway Organoid Seeding Media eller AOSM til stuetemperatur for at forhindre, at det forårsager re-flydende og opløsning af ECM-kuplen ved tilsætning. Efter inkubationen tilsættes 500 mikroliter opvarmet AOSM til hver brønd ved at dispensere ned ad brøndens væg. Pipettemedier må ikke pipetteres direkte på ECM-kuplen.Skift medier hver anden dag i fire til syv dage. For at opsuge mediet skal du vippe pladen i en 45-graders vinkel og aspirere fra brøndens nederste kant væk fra ECM-kuplen. Efter fire til syv dage skal du starte organoiddifferentiering ved at tilføje 500 mikroliter opvarmet luftvejsorganoiddifferentieringsmedie eller AODM til hver brønd og skifte medie hver anden dag i syv dage.Anbring kulturpladen indeholdende luftvejsepitelcellemodellerne i mikroskopetpladeindsatsen, og luk mikroskopets miljøkammer. Prøven får lov til at balancere i det forvarmede, 37 grader Celsius, 5% kuldioxidfyldte mikroskopkammer i 30 minutter. Ved mikroskopet okularet skal du fokusere på cellemodellen.Brug derefter anskaffelsessoftwaren til at klikke på L100 for at skifte lysstien til porten, hvor kameraet er monteret. Klik på den grønne Play-knap for at visualisere mikroskopets synsfelt via softwaren. Kontroller, at cilia er i fokus, og juster om nødvendigt.For at hente time-lapse-billeder fra menuen skal du klikke på Indløs og derefter på Fast TimeLapse. I pop op-vinduet skal du vælge en gemt placering og filnavn, erhverve 1.000 rammer. For at få vist cilia i mikroskopfeltet skal du klikke på Anvend efterfulgt af den grønne Play-knap.Juster Z-fokus, hvis det er nødvendigt. Klik derefter på Kør nu for at fange Fast TimeLapse. Efter installation af den nødvendige software og værktøjskasser skal du kopiere de relevante brugerdefinerede analysescripts og mappen supportscripts til computerens lokale drev.Klik derefter på fanen Hjem efterfulgt af Indstil sti på computersoftwaren. I pop op-vinduet skal du klikke på Tilføj med undermapper. Under MATLAB-søgestien skal du vælge den viste mappe.Klik derefter på Gem og luk. Bekræft, at analysescripts er knyttet til computersoftwaren ved at kontrollere, at de vises i panelet til venstre. Overfør derefter eksemplet på rå billedfiler, der er erhvervet, til computerens lokale drev.Klik derefter på BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. m analyse script fil i computing software. For at køre scriptet skal du klikke på fanen Editor efterfulgt af den grønne Play-knap.I det promptvindue, der vises, skal du vælge de rå billedfiler, der skal analyseres. Angiv eksponeringstiden for anskaffelsestid pr. ramme. Klik derefter på OK. Kør GetFirstAmplitude.m script på den mappe, der indeholder AveSpectrum-filerne. Vent på, at scriptet udsender FirstAmplitudeStacked. XLSX fil, som indeholder den højeste amplitudefrekvens, og er inden for det fysiologiske område af luftvejsepitel cilia beating.Kopiér frekvensværdierne fra FirstAmplitudeStacked. xlsx fil, og plot dem ved hjælp af videnskabelig analyse software. Resultaterne af cilia beat frekvens målt i luftvejsepitelcelle ALI modeller afledt af tre deltagere med cystisk fibrose og tre raske kontroldeltagere præsenteres.På dag 14 af kulturdifferentiering var der tæsk cilia. Fra dag 14, dag 21 i kulturdifferentiering, blev der ikke observeret en statistisk signifikant stigning i cilia beat-frekvensen mellem kohorter. På dag 21 af kulturdifferentiering var den gennemsnitlige cilia-slagfrekvens for raske kontroldeltagere signifikant højere end for deltagere med cystisk fibrose.Når cilia-beatfrekvensen blev afbildet i de samme cellemodeller efter fjernelse af slim, var der en statistisk signifikant stigning i cilia-beatfrekvensen, når slim blev fjernet i ALI-modeller af både raske individer og dem med cystisk fibrose. Billeddannelsesmiljøet skal være strengt reguleret, da ciliafunktionen er ekstremt modtagelig for ændringer i miljøfaktorer. Denne platform har potentiale til at blive etableret til patientspecifik lægemiddelscreening for at kunne identificere lægemidler, der modulerer CFTR-funktionen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Collection Protocol for Human Pancreas

Indsamling Protokol for human pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Behandling af primær hjernetumor Tissue for stamcelle Analyser og Flow Sortering

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse Imaging af primære præneoplastiske brystepitelceller celler afledt fra gensplejsede musemodeller for brystkræft

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primær Culture of Human vestibulær schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolation, Kryopræservering og dyrkning af humane amnion epitelceller ved kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Højfrekvente Ultrasound Imaging af Mouse Cervikal lymfeknuder

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolering og dyrkning Udvidelse af Tumorspecifikke endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Absorption af Nasal og bronchiale væsker: Precision prøveudtagning af menneskelige respiratoriske slimhinden og laboratorium behandling af prøver

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Generation af menneskers Nasal epitelcelle Spheroids for individualiseret cystisk fibrose Transmembrane ledningsevne Regulator undersøgelse

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...