Name: collection, expansion, and differentiation of primary human nasal epithelial cell models for quantification of cilia beat frequency
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency at JoVE.com

Wir danken den Studienteilnehmern und ihren Familien für ihre Beiträge. Wir schätzen die Unterstützung der Randwick Atemwegsabteilung des Sydney Children's Hospitals (SCH) bei der Organisation und Sammlung von Patientenbioproben - besonderer Dank gilt Dr. John Widger, Dr. Yvonne Belessis, Leanne Plüsch, Amanda Thompson und Rhonda Bell. Wir danken Iveta Slapetova und Renee Whan von der Katharina Gaus Light Microscopy Facility innerhalb des Mark Wainwright Analytical Centre an der UNSW Sydney für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wird vom National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), der CF Foundation Australia und der Sydney Children's Hospital Foundation unterstützt. Die Autoren möchten Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health für ihren Beitrag und ihre Unterstützung danken. Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health ist ein gemeinnütziges Kooperationsunternehmen zwischen dem Sydney Children's Hospitals Network, dem Children's Medical Research Institute und dem Children's Cancer Institute. Es wurde mit Unterstützung der Regierung von NSW gegründet, um die pädiatrische Forschung zu koordinieren und zu integrieren. Luminesce Alliance ist auch mit der University of Sydney und der University of New South Wales Sydney verbunden. KMA wird durch ein Stipendium des Australian Government Research Training Program unterstützt. LKF wird vom Rotary Club Sydney Cove/Sydney Children's Hospital Foundation und Postgraduate Award Stipendien der UNSW University unterstützt.

Die Genehmigung für die Studie wurde vom Sydney Children's Hospital Network Ethics Review Board (HREC/16/SCHN/120) erteilt. Vor der Entnahme von Bioproben wurde die schriftliche Zustimmung aller Teilnehmer (oder des Vormunds der Teilnehmer) eingeholt.
1. Vorbereitungen zur Erstellung von Atemwegepithelzellmodellen
<ol><li>Bereiten Sie Nasenzellentnahmemedien vor, indem Sie 80% Dulbeccos modifiziertes Adlermedium und 20% fötales Rinderserum kombinieren. Ergänzung mit 1 μL...

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	<li>Barbato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+a+consensus+statement+on+diagnostic+and+treatment+approaches+in+children.">Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children.</a> European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).</li><li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Chioccioli, M., Feriani, L., Kotar, J., Bratcher, P. 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Es gibt mehrere Faktoren, die die Quantifizierung von CBF in Nasepithelblättern verschleiern könnten. Epithelblätter sollten innerhalb von 3-9 Stunden nach der Probenentnahme abgebildet werden, da die Ziliarfunktion während dieser Zeit am stabilsten ist37. Weniger rote Blutkörperchen und Ablagerungen sind am besten für die Bildgebung geeignet, da diese die Datenerfassung stören. Bei der Auswahl eines ROI für die Bildgebung ist es wichtig, eine Epithelschicht auszuwählen, deren Kante währ...

Messungen der Zilienschlagfrequenz (CBF) und des Fasermusters haben sich als diagnostische Instrumente für Atemwegserkrankungen wie die primäre Ziliardyskinesie (PCD)1 etabliert. Bei Mukoviszidose (CF) führt eine Dysfunktion des CF-Transmembran-Leitfähigkeitsreglers (CFTR) zu einer Dehydratisierung der Atemwegsoberflächenflüssigkeit und einer gestörten mukoziliären Clearance2. Die Ziliarfunktion wurde in vitro in primären Atemwegszellmodellen als Indikator für die CFTR-Kanalaktivitätuntersucht 3. Allerdings besteht bei CBF eine beträchtliche Variabilität von Patient zu Patient als Reaktion auf CFTR-modulierende Medikamente, selbst bei Patienten mit den gleichen CFTR-Mutationen 3. Darüber hinaus ist der Einfluss einer dysfunktionalen CFTR-regulierten Chloridsekretion auf die Ziliarfunktion kaum verstanden. Derzeit gibt es kein umfassendes Protokoll, das die Probenvorbereitung von In-vitro-Atemwegsmodellen, die Bildaufnahme und die Analyse von CBF demonstriert.
Nasenepithelblätter, die aus Nasenschleimhautbürsten isoliert wurden, werden direkt für Messungen der Ziliarfunktion für die PKD-Diagnoseverwendet 4. Obwohl es keine Kontrolle über die Größe oder Qualität der erhaltenen Nasensepithelblätter gibt, variiert CBF je nachdem, ob es an einzelnen Zellen oder Zellblättern und an epithelialen Blattflanelländern gemessen wird, die gestört oder ungestört sind5. Daher können sekundäre Dyskinesien, die durch Zellschäden während der Entnahme von Nasenschleimhautbürsten verursacht werden, die CBF beeinflussen. Die primäre Zellkultur von Nasensepithelzellen und ihre Differenzierung an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) oder in dreidimensionaler Basalmembranmatrix in Flimmereitelepithelorganoide führen zu Zilien, die frei von sekundären Dyskinesiensind 4,6,7,8. Atemwegepithelzellen, die bei ALI differenziert wurden (im Folgenden als ALI-Modelle bezeichnet), gelten als wichtiges sekundäres diagnostisches Hilfsmittel, das die Ziliarschlagmuster und die Häufigkeit von Ex-vivo-Nasenschleimhautbürsten repliziert6 und die Analyse der Ziliarultrastruktur, des Schlagmusters und der Schlagfrequenz unter Beibehaltung patientenspezifischer Defekte ermöglicht 9 . Es gibt jedoch Diskrepanzen in den Methoden, die zur Erstellung dieser pseudogeschichteten, mukoziliären differenzierten Zellmodelle verwendet werden. Unterschiedliche Kulturexpansions- oder Differenzierungsprotokolle könnten unterschiedliche epitheliale Phänotypen (flimmerig oder sekretorisch)10 induzieren und zu signifikanten Unterschieden in CBF11 führen. CBF wurde quantifiziert in Nasepithelbürsten 4,6,12,13,14,15,16, Atemwegsepithelorganoiden 14,17,18 und ALI-Modellen 3,4,6,13,19,20, 21. Unter diesen Protokollen gibt es jedoch große Variabilitäten, und oft werden viele Parameter nicht kontrolliert. Zum Beispiel wird in einigen Studien CBF in situ abgebildet, während die Zellen des ALI-Modells auf dem durchlässigen Stützeinsatz 3,19,20,21 verbleiben, wieder andere kratzen die Zellen aus dem durchlässigen Stützeinsatz und bilden sie in den Medien 4,6,13 ab.
Darüber hinaus ist die breitere Anwendung von Techniken zur Messung der Ziliarfunktion durch die extreme Anfälligkeit der Ziliarfunktion gegenüber Veränderungen der Umweltfaktoren begrenzt. Umweltfaktoren wie Temperatur 22, Luftfeuchtigkeit23,24 und pH25,26 beeinflussen die Ziliarfunktion und müssen reguliert werden, um CBF genau zu quantifizieren. Die verschiedenen physiologischen Parameter, die in verschiedenen Laboratorien verwendet werden, und wie sie die CBF beeinflussen, wurden bereitsüberprüft 27.
Verschiedene Bildgebungstechnologien und Ansätze zur CBF-Messung werden in der Literatur beschrieben. Für die PCD-Diagnostik wird die Videomikroskopie zur Messung der Ziliarfunktion28,29 eingesetzt. Vor kurzem wurde ein Videoanalysealgorithmus, der auf differentieller dynamischer Mikroskopie basiert, verwendet, um sowohl die CBF- als auch die Zilienkoordination in den ALI-Modellen für Atemwegepithelzellenzu quantifizieren 3,30. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Ziliarschlägen in Atemwegsepithelzellen schnell und vollautomatisch, ohne dass Regionen segmentiert oder ausgewählt werden müssen. Verschiedene Methoden zur Bildgebung und Quantifizierung von CBF können zu den Unterschieden beitragen, die in der Literatur in CBF berichtet werden (Supplementary File 1).
Ein Protokoll von der Kultur bis zur Quantifizierung zur Rationalisierung bestehender Methoden, zur Standardisierung der Kulturbedingungen und zur Bildaufnahme, die unter streng umweltkontrollierten Bedingungen durchgeführt werden, würde eine konsistente, reproduzierbare Quantifizierung von CBF innerhalb und zwischen Individuen ermöglichen.
Dieses Protokoll bietet eine vollständige Beschreibung der Sammlung von Epithelzellen, der Expansions- und Differenzierungskulturbedingungen und der Quantifizierung von CBF in drei verschiedenen Atemwegepithelzellmodellsystemen nasalen Ursprungs: 1) native Epithelblätter, 2) ALI-Modelle, die auf permeablen Stützeinsätzen abgebildet wurden, und 3) extrazelluläre Matrix (ECM)-eingebettete dreidimensionale Organoide (Abbildung 1 ). Nasenepithelzellen, die aus Nasenbürsten der unteren Nasenmuscheln gewonnen werden, werden als Vertreter des Atemwegsepithels verwendet, da sie ein wirksamer Ersatz für Bronchialepithelzellen31 sind, während sie das invasive Verfahren überwinden, das mit dem Sammeln von Bronchialbürsten verbunden ist. Die Conditional Reprogramming Cell (CRC) Methode wird verwendet, um primäre Atemwegsepithelzellen für die Erstellung von ALI-Modellen und dreidimensionalen Organoiden zu erweitern. Die bedingte Reprogrammierung von Atemwegepithelzellen in einen stammzellähnlichen Zustand wird durch Kokultur mit wachstumshemmendem Fibroblasten-Feederzellsystem und Rho-assoziierter Kinase (ROCK)-Inhibitor32 induziert. Wichtig ist, dass die CRC-Methode die Verdopplung der Population in Atemwegepithelzellen erhöht und gleichzeitig ihr gewebespezifisches Differenzierungspotenzial beibehält33,34. In allen Epithelzellmodellen der Atemwege wird die Ziliarfunktion in einer temperaturgesteuerten Kammer mit einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera mit standardisierten Bildaufnahmeeinstellungen erfasst. Für die Quantifizierung von CBF werden maßgeschneiderte Skripte verwendet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63090/63090fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Workflows. Nach dem Bürsten des Nasenmuschels werden die Atemwegsepithelzellen auf zwei Arten verwendet. Entweder werden Atemwegsepithelschichten isoliert und die Zilienschlagfrequenz wird sofort abgebildet, oder Atemwegsepithelzellen werden über die bedingte Reprogrammierungszellmethode erweitert. CRC-expandierte Atemwegsepithelzellen werden differenziert, um Atemwegepithelzellen an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche oder Atemwegepithel-Organoidkulturen zu etablieren. Die Bildgebung der Ziliarschlagfrequenz wird mit einem Lebendzell-Bildgebungsmikroskop mit einer Heiz- und Feuchtigkeits-Umgebungskammer und einer wissenschaftlichen Kamera mit schneller Bildrate (>100 Hz) aufgenommen. Die Datenanalyse wird mit benutzerdefinierten Skripten durchgeführt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63090/63090fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2786</td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanyl-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8541</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Zyla 4.2 sCMOS</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Fast frame rate (&#62;100 Hz) scientific camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6987</td>
			<td>50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI S Plan Fluor ELWD 20XC</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>MRH08230</td>
			<td>Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Gel Strainer 40 UM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431750</td>
			<td>Pore size 40 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470</td>
			<td>Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 &#956;m pore polyester membrane insert.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytology brushes</td>
			<td>McFarlane Medical</td>
			<td>33009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-Ham</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-Ham</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell imaging microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>250 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Scientific analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cryo.s vials</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3135</td>
			<td>Cryogenic vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI-FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>3.6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator NL Ti2 BLACK 2000</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td>2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>74220 706</td>
			<td>Bead bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1254302</td>
			<td>Thermal beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Computing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microscoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10&#160;mg streptomycin/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult Airway Organoid Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5060</td>
			<td>Airway Organoid Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-Ex Plus Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol-S</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5015</td>
			<td>Type I Collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReagentPack Subculture Reagents</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhEGF (Epidermal Growth Factor, human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td>25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Stage Top Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection, expansion, and differentiation of primary human nasal epithelial cell models for quantification of cilia beat frequency

Messungen der Zilienfunktion (Schlagfrequenz, Muster) haben sich als diagnostische Instrumente für Atemwegserkrankungen wie primäre Ziliardyskinesie etabliert. Die breitere Anwendung dieser Techniken ist jedoch durch die extreme Anfälligkeit der Ziliarfunktion gegenüber Änderungen der Umweltfaktoren wie Temperatur, Feuchtigkeit und pH-Wert begrenzt. In den Atemwegen von Patienten mit Mukoviszidose (CF) behindert die Schleimansammlung das Schlagen von Zilien. Die Zilienfunktion wurde in primären Atemwegszellmodellen als Indikator für die Kanalaktivität des CF Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) untersucht. Es wurde jedoch eine beträchtliche Variabilität der Zilienschlagfrequenz als Reaktion auf CFTR-modulierende Medikamente festgestellt, selbst bei Patienten mit den gleichen CFTR-Mutationen . Darüber hinaus ist der Einfluss einer dysfunktionalen CFTR-regulierten Chloridsekretion auf die Ziliarfunktion kaum verstanden. Derzeit gibt es kein umfassendes Protokoll, das die Probenvorbereitung von In-vitro-Atemwegsmodellen, die Bildaufnahme und die Analyse der Zilienschlagfrequenz (CBF) demonstriert. Standardisierte Kulturbedingungen und Bildaufnahmen, die unter einem umweltkontrollierten Zustand durchgeführt werden, würden eine konsistente, reproduzierbare Quantifizierung von CBF zwischen Individuen und als Reaktion auf CFTR-modulierende Medikamente ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung von CBF in drei verschiedenen Atemwegsepithelzellmodellsystemen: 1) native Epithelschichten, 2) Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenmodelle, die auf permeablen Stützeinsätzen abgebildet sind, und 3) extrazelluläre, in Matrix eingebettete dreidimensionale Organoide. Die beiden letzteren replizieren in vivo die Lungenphysiologie, mit schlagenden Zilien und Schleimproduktion. Die Ziliarfunktion wird mit einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera in einer umgebungskontrollierten Kammer erfasst. Für die Analyse von CBF werden benutzerdefinierte Skripte verwendet. Die Übertragung von CBF-Messungen in die Klinik soll ein wichtiges klinisches Instrument zur Vorhersage des Ansprechens auf CFTR-modulierende Medikamente pro Patient sein.

Um die Effizienz dieses Protokolls bei der Quantifizierung von CBF zu demonstrieren, werden die Ergebnisse von CBF vorgestellt, die in Atemwegsepithelzell-ALI-Modellen von drei Teilnehmern mit CF und drei gesunden Kontrollteilnehmern abgeleitet wurden. An Tag 14 der Kulturdifferenzierung waren schlagende Zilien vorhanden (Abbildung 6). Vom Tag 14 bis 21 der Kulturdifferenzierung wurde innerhalb beider Kohorten ein statistisch signifikanter (P < 0,0345) Anstieg der CBF beobachtet. Am Tag 21 d...

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Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, Expansion und Differenzierung nasaler Epithelzellen zu organotypischen Atemwegsepithelzellmodellen und die Quantifizierung der Zilienschlagfrequenz mittels Live-Cell-Bildgebung und maßgeschneiderten Skripten.

Sammlung, Expansion und Differenzierung primärer humaner Nasensepithelzellmodelle zur Quantifizierung der Zilienschlagfrequenz

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

Wir beschreiben die Entnahme von Atemwegsstammzellen aus der Nasenschleimhaut. Diese Zellen werden im Labor zu einem pseudogeschichteten Epithel expandiert und differenziert. Dies ist eine In-vitro-Expansion und -Differenzierung, die unseren Atemwegen in vivo ähnelt, was bedeutet, dass spezialisierte Zellen wie Flimmerzellen vorhanden sind, die zur Quantifizierung der Zilienschlagfrequenz verwendet werden können.Um eine konsistente und reproduzierbare Quantifizierung der Zilienschlagfrequenz zwischen verschiedenen Individuen und als Reaktion auf verschiedene Medikamente zu ermöglichen, standardisieren wir Kulturbedingungen und Bildaufnahme. Zilienschlagfrequenzmessungen werden als klinische Werkzeuge bei Erkrankungen wie primärer Ziliardyskinesie eingesetzt. Wir hoffen, dies als klinischen Marker für Mukoviszidose zu etablieren.Katelin Allan und Laura Fawcett, Doktorandinnen aus meinem Labor, und Dr. Sharon Wong, Postdoc aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren. Beginnen Sie damit, den Teilnehmer zu bitten, durch den Mund zu atmen. Nehmen Sie dann einen Zytologiepinsel in die dominante Hand und legen Sie die fünfte Ziffer auf das Kinn des Teilnehmers, um die Hand zu verankern, führen Sie die Zytologiebürste in den Nasengang des Teilnehmers in einem 45-Grad-Winkel zum Gesicht des Teilnehmers ein und führen Sie ihn durch den Nasengang.Nachdem Sie die Bürste aufrecht gedreht haben, so dass sie senkrecht zum Gesicht des Teilnehmers steht, bewegen Sie die Bürste sanft, aber fest gegen die seitliche Wand der Nase unter dem unteren Nasenmuscheln, bis sie sich in der Mitte bis zum hinteren Teil der unteren Nasenmuschel befindet. Drehen Sie die Bürste bis zu dreimal um 360 Grad. Entfernen Sie es dann vorsichtig und kehren Sie das Einführmanöver um, damit sich die Zellen nicht von der Bürste lösen.Legen Sie die Bürste in das vorbereitete Sammelröhrchen mit Nasenzellensammelmedien und legen Sie das Auffangröhrchen auf Eis. Nach einem sanften Wirbeln, um die Zellen von der Bürste zu entfernen, wird das Auffangrohr auf Eis zurück in die Biosicherheitswerkbank überführt. Übertragen Sie die Medien mit einer serologischen Pipette aus dem Sammelröhrchen in ein neues Röhrchen und lassen Sie die Zytologiebürsten zurück.Dann zentrifugieren Sie die Probe. Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter bedingt reprogrammierender Zellmedien. Dann führen Sie die Zellen mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette in kreisförmiger Bewegung durch ein Zellsieb, das auf einem 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist.Um eine einzellige Suspension zu erhalten, sammeln Sie die Suspension vom Boden des Röhrchens und führen Sie sie mehrmals durch das Sieb. Dann das Zellsieb verwerfen. Um die Atemwegsepithelzellen auf die vorbereiteten permeablen Stützeinsätze zu impfen, mischen Sie die Zellen gut, ohne Blasen zu erzeugen, und stellen Sie sicher, dass sie homogen und in Suspension sind.Dann werden 150 Mikroliter der Zellsuspension auf die apikale Seite der vorbereiteten permeablen Stützeinsätze gegeben. Um die Epithelzellen der Atemwege an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu differenzieren, kultivieren Sie sie zwei Tage lang in Differenzierung oder ALI-Medien. Dann saugen Sie das Medium ab und fügen Sie 750 Mikroliter ALI-Medien nur in das Basalfach hinzu, um eine Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle zu erzeugen.Um die Atemwegsepithelzellen in ECM-Kuppeln zu säen, resuspendieren Sie dissoziierte Atemwegsepithelzellen mit dem entsprechenden Volumen von 90% ECM. Halten Sie dann die Pipette vertikal in einem 90-Grad-Winkel so nah wie möglich am Boden des Bohrlochs und geben Sie 50 Mikroliter der ECM-Zellsuspension in die Mitte des Bohrlochs ab. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten, bis die ECM erstarrt.Während sich das ECM verfestigt, erwärmen Sie das Organoid Seeding Media (AOSM) der Atemwege auf Raumtemperatur, um zu verhindern, dass es zu einer erneuten Verflüssigung und zum Zerfall der ECM-Kuppel bei Zugabe kommt. Fügen Sie nach der Inkubation 500 Mikroliter erwärmtes AOSM in jede Vertiefung hinzu, indem Sie die Wand des Bohrlochs abgeben. Pipettieren Sie Medien nicht direkt auf die ECM-Kuppel.Wechseln Sie die Medien alle zwei Tage für vier bis sieben Tage. Um das Medium abzusaugen, neigen Sie die Platte in einem 45-Grad-Winkel und saugen Sie von der Unterkante des Bohrlochs von der ECM-Kuppel weg. Beginnen Sie nach vier bis sieben Tagen die Organoiddifferenzierung, indem Sie 500 Mikroliter erwärmtes Atemwegs-Organoid-Differenzierungsmedium (AODM) zu jeder Vertiefung hinzufügen und sieben Tage lang alle zwei Tage das Medium wechseln.Legen Sie die Kulturplatte mit den Atemwegepithelzellmodellen in den Einsatz der Mikroskopplatte und schließen Sie die Mikroskop-Klimakammer. Lassen Sie die Probe 30 Minuten lang in der vorgewärmten, mit 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid gefüllten Mikroskopkammer bahibieren. Am Mikroskopokular fokussieren Sie sich auf das Zellmodell.Klicken Sie dann mit der Erfassungssoftware auf L100, um den Lichtpfad zu dem Anschluss zu wechseln, an dem die Kamera montiert ist. Klicken Sie auf den grünen Play-Button, um das Sichtfeld des Mikroskops über die Software zu visualisieren. Überprüfen Sie, ob die Zilien scharf sind, und passen Sie sie bei Bedarf an.Um Zeitrafferbilder aus dem Menü zu erfassen, klicken Sie auf Erfassen und dann auf Schneller Zeitraffer. Wählen Sie im Popup-Fenster einen Speicherort und einen Dateinamen aus, um 1.000 Frames zu erfassen. Um eine Vorschau der Zilien im Sichtfeld des Mikroskops anzuzeigen, klicken Sie auf Übernehmen, gefolgt von der grünen Play-Taste.Passen Sie bei Bedarf den Z-Fokus an. Klicken Sie dann auf Jetzt ausführen, um den Fast TimeLapse aufzunehmen. Kopieren Sie nach der Installation der erforderlichen Software und Toolboxes die entsprechenden benutzerdefinierten Analyseskripts und den Ordner für Supportskripts auf das lokale Laufwerk des Computers.Klicken Sie anschließend in der Computersoftware auf die Registerkarte Home und anschließend auf Set Path. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Mit Unterordnern hinzufügen. Wählen Sie unter dem MATLAB-Suchpfad den angezeigten Ordner aus.Klicken Sie dann auf Speichern und schließen. Vergewissern Sie sich, dass die Analyseskripte mit der Computersoftware verknüpft sind, indem Sie überprüfen, ob sie im linken Bereich angezeigt werden. Übertragen Sie als Nächstes die abgerufenen RAW-Image-Beispieldateien auf das lokale Laufwerk des Computers.Klicken Sie dann auf die BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. M-Analyseskriptdatei in der Computersoftware. Um das Skript auszuführen, klicken Sie auf die Registerkarte Editor, gefolgt von der grünen Schaltfläche Play.Wählen Sie im angezeigten Eingabeaufforderungsfenster die zu analysierenden Rohbilddateien aus. Geben Sie die Belichtungszeit für die Aufnahmezeit pro Bild ein. Klicken Sie dann auf OK. Führen Sie GetFirstAmplitude aus.m Skript für den Ordner, der die AveSpectrum-Dateien enthält. Warten Sie, bis das Skript FirstAmplitudeStacked ausgegeben hat. XLSX-Datei, die die höchste Amplitudenfrequenz enthält und sich im physiologischen Bereich der Atemwegepithelzilienschläge befindet.Kopieren Sie die Frequenzwerte aus FirstAmplitudeStacked. xlsx-Datei und plotten Sie sie mit wissenschaftlicher Analysesoftware. Die Ergebnisse der Zilienschlagfrequenz, gemessen in Atemwegsepithelzell-ALI-Modellen, die von drei Teilnehmern mit Mukoviszidose und drei gesunden Kontrollteilnehmern abgeleitet wurden, werden vorgestellt.Am Tag 14 der Kulturdifferenzierung waren schlagende Zilien anwesend. Ab Tag 14, Tag 21 der Kulturdifferenzierung wurde kein statistisch signifikanter Anstieg der Zilienschlagfrequenz zwischen den Kohorten beobachtet. Am Tag 21 der Kulturdifferenzierung war die mittlere Zilienschlagfrequenz für gesunde Kontrollteilnehmer signifikant höher als die von Teilnehmern mit Mukoviszidose.Wenn die Schlagfrequenz der Zilien in den gleichen Zellmodellen nach der Entfernung von Schleim abgebildet wurde, gab es einen statistisch signifikanten Anstieg der Zilienschlagfrequenz, wenn Schleim in ALI-Modellen sowohl von gesunden Personen als auch von Personen mit Mukoviszidose entfernt wurde. Die Bildgebungsumgebung muss streng reguliert werden, da die Zilienfunktion extrem anfällig für Veränderungen der Umweltfaktoren ist. Diese Plattform hat das Potenzial, für ein patientenspezifisches Medikamentenscreening eingerichtet zu werden, um Medikamente identifizieren zu können, die die CFTR-Funktion modulieren.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Sammlung Protokoll zur menschlichen Pankreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Forschung

Medizin

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Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

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