Name: collection, expansion, and differentiation of primary human nasal epithelial cell models for quantification of cilia beat frequency
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency at JoVE.com

אנו מודים למשתתפי המחקר ולמשפחותיהם על תרומתם. אנו מעריכים את הסיוע של בתי החולים לילדים בסידני (SCH) מחלקת הנשימה של רנדוויק בארגון ואיסוף של ביופסימנים של חולים - תודה מיוחדת לד"ר ג'ון וידג'ר, ד"ר איבון בלסיס, ליאן פלוס, אמנדה תומפסון ורונדה בל. אנו מודים על עזרתם של איווטה סלפסטובה ורנה וון ממתקן המיקרוסקופיה הקלה של קתרינה גאוס במרכז האנליטי ע"ש מארק ויינרייט ב- UNSW Sydney. עבודה זו נתמכת על ידי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (NHMRC) אוסטרליה (GNT1188987), קרן CF אוסטרליה וקרן בית החולים לילדים בסידני. המחברים רוצים להודות לברית Luminesce - חדשנות לבריאות ילדים על תרומתה ותמיכתה. Luminesce Alliance - חדשנות לבריאות ילדים הוא מיזם משותף ללא מטרות רווח בין רשת בתי החולים לילדים בסידני, מכון המחקר הרפואי לילדים והמכון לסרטן ילדים. הוא הוקם בתמיכת ממשלת NSW כדי לתאם ולשלב מחקר ילדים. Luminesce Alliance מסונפת גם לאוניברסיטת סידני ולאוניברסיטת ניו סאות' ויילס סידני. KMA נתמך על ידי מלגת תוכנית הכשרה למחקר של ממשלת אוסטרליה. LKF נתמך על ידי מועדון רוטרי של קרן בית החולים לילדים סידני קוב / סידני ומלגות לתואר שני של אוניברסיטת UNSW.

אישור המחקר התקבל מהוועדה לבדיקת אתיקה של רשת בתי החולים לילדים בסידני (HREC/16/SCHN/120). הסכמה בכתב התקבלה מכל המשתתפים (או האפוטרופוס של המשתתפים) לפני איסוף הביופסימנים.
1. תכשירים להקמת מודלים של תאי אפיתל בדרכי הנשימה
<ol><li>הכינו את מדיית איסוף תאי האף על ידי שילוב של 8...

<ol>
	<li>Barbato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+a+consensus+statement+on+diagnostic+and+treatment+approaches+in+children.">Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children.</a> European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).</li><li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Chioccioli, M., Feriani, L., Kotar, J., Bratcher, P. E., Cicuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+ciliary+dynamics+and+coordination+in+response+to+CFTR-modulators+in+Cystic+Fibrosis+respiratory+epithelial+cells.">Phenotyping ciliary dynamics and coordination in response to CFTR-modulators in Cystic Fibrosis respiratory epithelial cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1763 (2019).</li><li>Hirst, R. A., Rutman, A., Williams, G., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliated+air-liquid+cultures+as+an+aid+to+diagnostic+testing+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Ciliated air-liquid cultures as an aid to diagnostic testing of primary ciliary dyskinesia.</a> Chest. 138 (6), 1441-1447 (2010).</li><li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia.">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).</li><li>Coles, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+culture+of+airway+epithelial+cells+as+a+diagnostic+tool+for+primary+ciliary+dyskinesia.">A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (11), (2020).</li><li>Pifferi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+cell+culture+method+for+the+diagnosis+of+atypical+primary+ciliary+dyskinesia.">Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia.</a> Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).</li><li>Pifferi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+diagnosis+of+primary+ciliary+dyskinesia:+cell+culture+and+soft+computing+analysis.">Rapid diagnosis of primary ciliary dyskinesia: cell culture and soft computing analysis.</a> European Respiratory Journal. 41 (4), 960-965 (2013).</li><li>Lee, D. D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+throughput+drug+screening+for+rare+respiratory+diseases:+Readthrough+therapy+in+primary+ciliary+dyskinesia.">Higher throughput drug screening for rare respiratory diseases: Readthrough therapy in primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 58 (4), 2000455 (2021).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Dabrowski, M., Bukowy-Bieryllo, Z., Jackson, C. L., Zietkiewicz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+non-aminoglycoside+compounds+used+to+stimulate+translational+readthrough+of+PTC+mutations+in+primary+ciliary+dyskinesia.">Properties of non-aminoglycoside compounds used to stimulate translational readthrough of PTC mutations in primary ciliary dyskinesia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), (2021).</li><li>Hirst, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+primary+ciliary+dyskinesia+epithelial+cells+at+air-liquid+interface+can+alter+ciliary+phenotype+but+remains+a+robust+and+informative+diagnostic+aid.">Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid.</a> PloS One. 9 (2), 89675 (2014).</li><li>Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+three-dimensional+explant+spheroids+derived+from+human+nasal+airway+epithelium:+a+simple+methodological+approach+for+ex+vivo+studies+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia.</a> Cilia. 6, 3 (2017).</li><li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging:+comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods.">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li><li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+cilia+and+ciliated+epithelial+ultrastructure+in+healthy+children+and+young+adults.">Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults.</a> Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).</li><li>Castillon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+and+associated+epithelial+proteins+during+the+regeneration+of+human+airway+surface+epithelium+in+three-dimensional+culture.">Polarized expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and associated epithelial proteins during the regeneration of human airway surface epithelium in three-dimensional culture.</a> Laboratory Investigation. 82 (8), 989-998 (2002).</li><li>Jorissen, M., Bessems, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+ciliary+beat+frequency+after+ciliogenesis+in+nasal+epithelial+cells+cultured+sequentially+as+monolayer+and+in+suspension.">Normal ciliary beat frequency after ciliogenesis in nasal epithelial cells cultured sequentially as monolayer and in suspension.</a> Acta Oto-Laryngologica. 115 (1), 66-70 (1995).</li><li>Conger, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+ciliary+beat+frequency+activation+by+the+CFTR+Modulators+Genistein,+VRT-532,+and+UCCF-152+in+primary+sinonasal+epithelial+cultures.">Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures.</a> JAMA Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).</li><li>Pique, N., De Servi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhinosectan((R))+spray+(containing+xyloglucan)+on+the+ciliary+function+of+the+nasal+respiratory+epithelium;+results+of+an+in+vitro+study.">Rhinosectan((R)) spray (containing xyloglucan) on the ciliary function of the nasal respiratory epithelium; results of an in vitro study.</a> Allergy, Asthma &amp; Clinical Immunology. 14, 41 (2018).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+antiviral+response+suppresses+ciliogenesis+and+motile+ciliary+functions+in+the+nasal+epithelium.">Host antiviral response suppresses ciliogenesis and motile ciliary functions in the nasal epithelium.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 581340 (2020).</li><li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells.">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).</li><li>Ballenger, J. J., Orr, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+human+ciliary+activity.">Quantitative measurement of human ciliary activity.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 72, 31-39 (1963).</li><li>Mercke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+varying+air+humidity+on+mucociliary+activity.">The influence of varying air humidity on mucociliary activity.</a> Acta Oto-Laryngologica. 79 (1-2), 133-139 (1975).</li><li>Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+airway+ciliary+beat+frequency+by+intracellular+pH.">Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH.</a> Journal of Physiology. 560, 519-532 (2004).</li><li>Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammalian+ciliary+beating.">Regulation of mammalian ciliary beating.</a> Annual Review of Physiology. 69, 401-422 (2007).</li><li>Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+functional+analysis:+Beating+a+path+towards+standardization.">Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization.</a> Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).</li><li>Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+ciliary+beat+pattern+in+three+different+beating+planes+in+healthy+subjects.">Variation of ciliary beat pattern in three different beating planes in healthy subjects.</a> Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).</li><li>Jackson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+diagnostic+testing+in+primary+ciliary+dyskinesia.">Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).</li><li>Feriani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+collective+dynamics+of+motile+cilia+in+cultures+of+human+airway+cells+by+multiscale+DDM.">Assessing the collective dynamics of motile cilia in cultures of human airway cells by multiscale DDM.</a> Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Martinovich, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+primary+airway+epithelial+cells+maintain+morphology,+lineage+and+disease+specific+functional+characteristics.">Conditionally reprogrammed primary airway epithelial cells maintain morphology, lineage and disease specific functional characteristics.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17971 (2017).</li><li>Wong, J. Y., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+the+ciliated+epithelium+following+acute+bronchiolitis+in+infancy.">Recovery of the ciliated epithelium following acute bronchiolitis in infancy.</a> Thorax. 60 (7), 582-587 (2005).</li><li>Gentzsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+rescue+of+conditionally+reprogrammed+cystic+fibrosis+bronchial+epithelial+cells.">Pharmacological rescue of conditionally reprogrammed cystic fibrosis bronchial epithelial cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (5), 568-574 (2017).</li><li>Sommer, J. U., Gross, S., Hormann, K., Stuck, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+changes+in+nasal+ciliary+beat+frequency.">Time-dependent changes in nasal ciliary beat frequency.</a> European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 267 (9), 1383-1387 (2010).</li><li>Ratjen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis.">Cystic fibrosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1, 15010 (2015).</li><li>Delmotte, P., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+frequency+is+maintained+at+a+maximal+rate+in+the+small+airways+of+mouse+lung+slices.">Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 110-117 (2006).</li><li>Smith, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooling+of+cilia+allows+functional+analysis+of+the+beat+pattern+for+diagnostic+testing.">Cooling of cilia allows functional analysis of the beat pattern for diagnostic testing.</a> Chest. 140 (1), 186-190 (2011).</li><li>Raidt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+pattern+and+frequency+in+genetic+variants+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).</li></ol>

ישנם גורמים רבים שיכולים לטשטש את הכימות של CBF ביריעות אפיתל האף. יש לדמות יריעות אפיתל תוך 3-9 שעות מאיסוף הדגימה מכיוון שהפונקציה הציליארית יציבה ביותר בתקופה זו37. פחות תאי דם אדומים ופסולת הם האופטימליים ביותר להדמיה, שכן אלה מפריעים לאיסוף הנתונים. בעת בחירת ROI להדמיה, חשוב ?...

מדידות של תדירות פעימת ריסונים (CBF) ודפוס נקבעו ככלי אבחון למחלות בדרכי הנשימה כגון דיסקינזיה ריסיאלית ראשונית (PCD)1. בסיסטיק פיברוזיס (CF), תפקוד לקוי של תעלת הכלוריד של מווסת מוליכות טרנסממברנה CF (CFTR) גורם להתייבשות של נוזל פני השטח של דרכי הנשימה ולפגיעה בפינוי ליחה2. פונקציה ציליארית נחקרה במבחנה במודלים ראשוניים של תאי דרכי הנשימה כאינדיקטור לפעילות ערוץ CFTR3. עם זאת, קיימת שונות ניכרת בין חולה לחולה ב-CBF בתגובה לתרופות המווסתות CFTR, אפילו עבור חולים עם אותן מוטציות CFTR 3. יתר על כן, ההשפעה של הפרשת כלוריד מווסתת CFTR לא מתפקדת על תפקוד הריסיון אינה מובנת כהלכה. אין כיום פרוטוקול מקיף המדגים הכנת דגימות של מודלים של נתיבי אוויר במבחנה , רכישת תמונות וניתוח של CBF.
יריעות אפיתל לאף המבודדות ממברשות רירית האף משמשות ישירות למדידות של תפקוד ציליארי לאבחון PCD4. עם זאת, בעוד שאין שליטה על הגודל או האיכות של יריעות אפיתל האף המתקבלות, CBF משתנה בהתאם לשאלה אם הוא נמדד על תאים בודדים או יריעות תאים ועל קצוות יריעות אפיתל משובשות או ללא הפרעה5. ככזה, דיסקינזיות משניות הנגרמות על ידי נזק לתאים במהלך איסוף של מברשות רירית האף עשויות להשפיע על CBF. תרבית תאים ראשונית של תאי אפיתל באף והתמיינותם בממשק אוויר-נוזל (ALI) או במטריצת קרום מרתף תלת-ממדית לאורגנואידים אפיתליאליים של דרכי הנשימה יוצרים ריסונים נקיים מדיסקינזיות משניות 4,6,7,8. תאי אפיתל של דרכי הנשימה המתמיינים ב- ALI (המכונים מעתה מודלים ALI) נחשבו לכלי אבחון משני חשוב המשכפל את דפוסי הפעימה והתדירות של צחצוח רירית האף ex vivo 6 ומאפשר ניתוח של אולטרה-מבנה ציליארי, תבנית פעימה ותדירות פעימה תוך שמירה על פגמים ספציפיים למטופל9 . עם זאת, קיימים פערים במתודולוגיות המשמשות ליצירת מודלים של תאים ממוינים מדומים, ליחה. פרוטוקולי הרחבה או הבחנה שונים של תרביות יכולים לגרום לפנוטיפים אפיתליאליים מובחנים (ciliated או secretory)10 ולגרום להבדלים משמעותיים ב-CBF11. CBF כומתה במברשות אפיתל לאף 4,6,12,13,14,15,16, אורגנואידים אפיתל של דרכי הנשימה 14,17,18 ודגמי ALI 3,4,6,13,19,20, 21. עם זאת, בין פרוטוקולים אלה, יש שונות גדולה, ולעתים קרובות פרמטרים רבים אינם מבוקרים. לדוגמה, במחקרים מסוימים, CBF מצולם באתרו בעוד שהתאים של מודל ALI נשארים על תוספת התמיכה החדירה 3,19,20,21, אך אחרים מגרדים את התאים מתוספת התמיכה החדירה ומדמיינים אותם תלויים במדיה 4,6,13.
יתר על כן, היישום הרחב יותר של טכניקות המודדות את הפונקציה הציליארית מוגבל על ידי הרגישות הקיצונית של הפונקציה הציליארית לשינויים בגורמים סביבתיים. גורמים סביבתיים כגון טמפרטורה22, לחות 23,24 ו- pH 25,26 משפיעים על תפקוד הציליארי ויש לווסת אותם כדי לכמת CBF במדויק. הפרמטרים הפיזיולוגיים השונים המשמשים במעבדות שונות וכיצד הם משפיעים על CBF נבדקו בעבר27.
בספרות מדווחות טכנולוגיות הדמיה וגישות שונות למדידות CBF. עבור אבחון PCD, מיקרוסקופיית וידאו משמשת למדידת תפקוד ציליארי28,29. לאחרונה, נעשה שימוש באלגוריתם ניתוח וידאו המבוסס על מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית כדי לכמת הן CBF והן תיאום ריסונים במודלים של תאי אפיתל ALI של דרכי הנשימה 3,30. שיטה זו מאפשרת אפיון של הכאה ציליארית בתאי אפיתל דרכי הנשימה באופן מהיר ואוטומטי לחלוטין, ללא צורך בפילוח או בחירת אזורים. שיטות שונות להדמיה וכימות של CBF עשויות להוסיף להבדלים המדווחים ב-CBF בספרות (קובץ משלים 1).
פרוטוקול מתרבות לכימות לייעול השיטות הקיימות, סטנדרטיזציה של תנאי התרבות ורכישת תמונות, המבוצעות בתנאים קפדניים מבוקרים סביבתית, יאפשרו כימות עקבי וניתן לשחזור של CBF בתוך ובין פרטים.
פרוטוקול זה מספק תיאור מלא של אוסף תאי אפיתל, תנאי תרבית התפשטות והתמיינות, וכימות של CBF בשלוש מערכות מודל שונות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה ממקור האף: 1) יריעות אפיתל מקוריות, 2) מודלים של ALI המצולמים על תוספות תמיכה חדירות ו-3) אורגנואידים תלת-ממדיים מוטמעים על-ידי מטריצה חוץ-תאית (ECM) (איור 1) ). תאי אפיתל באף המתקבלים ממברשות טורבינאט נחותות באף משמשים כנציגים של אפיתל דרכי הנשימה מכיוון שהם פונדקאית יעילה לתאי אפיתל הסימפונות31 תוך התגברות על ההליך הפולשני הקשור לאיסוף מברשות הסימפונות. שיטת תא התכנות מחדש המותנה (CRC) משמשת להרחבת תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה ליצירת מודלים של ALI ואורגנואידים תלת-ממדיים. תכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל דרכי הנשימה למצב דמוי תאי גזע מושרה על ידי תרבית משותפת עם מערכת תאי הזנה פיברובלסטים שנעצרה בגדילה ומעכב קינאז הקשור ל-Rho (ROCK)32. חשוב לציין ששיטת CRC מגדילה את הכפלת האוכלוסייה בתאי אפיתל בדרכי הנשימה תוך שמירה על פוטנציאל ההתמיינות הספציפי לרקמות שלהם33,34. בכל דגמי תאי האפיתל של דרכי הנשימה, הפונקציה הציליארית נלכדת בתא מבוקר טמפרטורה באמצעות מצלמת וידאו במהירות גבוהה עם הגדרות סטנדרטיות לקליטת תמונה. סקריפטים שנבנו בהתאמה אישית משמשים לכימות של CBF.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63090/63090fig01.jpg"> איור 1: סכימה של זרימת עבודה. לאחר צחצוח הטורבינציה הנחותה באף של המשתתפים, תאי אפיתל דרכי הנשימה מנוצלים באחת משתי דרכים. או יריעות אפיתל של דרכי הנשימה מבודדות, ותדר פעימות הריסונים מצולם מיד, או שתאי אפיתל של דרכי הנשימה מורחבים באמצעות שיטת התכנות מחדש המותנית של התא. תאי אפיתל של דרכי הנשימה המורחבים על-ידי CRC מתמיינים כדי ליצור תאי אפיתל של דרכי הנשימה בממשק אוויר-נוזל או בתרביות אפיתל אורגנואידיות של דרכי הנשימה. הדמיה של תדר פעימה ציליארית נרכשת באמצעות מיקרוסקופ הדמיה של תאים חיים עם תא סביבתי של חימום ולחות ומצלמה מדעית בקצב פריימים מהיר (>100 הרץ). ניתוח הנתונים מתבצע באמצעות סקריפטים שנבנו בהתאמה אישית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63090/63090fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2786</td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanyl-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8541</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Zyla 4.2 sCMOS</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Fast frame rate (&#62;100 Hz) scientific camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6987</td>
			<td>50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI S Plan Fluor ELWD 20XC</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>MRH08230</td>
			<td>Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Gel Strainer 40 UM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431750</td>
			<td>Pore size 40 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470</td>
			<td>Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 &#956;m pore polyester membrane insert.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytology brushes</td>
			<td>McFarlane Medical</td>
			<td>33009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-Ham</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-Ham</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell imaging microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>250 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Scientific analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cryo.s vials</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3135</td>
			<td>Cryogenic vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI-FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>3.6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator NL Ti2 BLACK 2000</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td>2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>74220 706</td>
			<td>Bead bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1254302</td>
			<td>Thermal beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Computing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microscoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10&#160;mg streptomycin/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult Airway Organoid Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5060</td>
			<td>Airway Organoid Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-Ex Plus Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol-S</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5015</td>
			<td>Type I Collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReagentPack Subculture Reagents</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhEGF (Epidermal Growth Factor, human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td>25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Stage Top Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection, expansion, and differentiation of primary human nasal epithelial cell models for quantification of cilia beat frequency

מדידות של תפקוד הריסונים (תדירות פעימה, דפוס) נקבעו ככלי אבחון למחלות בדרכי הנשימה כגון דיסקינזיה ציליארית ראשונית. עם זאת, היישום הרחב יותר של טכניקות אלה מוגבל על ידי הרגישות הקיצונית של תפקוד ציליארי לשינויים בגורמים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות ו- pH. בדרכי הנשימה של חולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF), הצטברות ריר מעכבת את הכאת הריסונים. פונקציית הריסונים נחקרה במודלים ראשוניים של תאי דרכי הנשימה כאינדיקטור לפעילות ערוץ מווסת מוליכות טרנסממברנה CF (CFTR). עם זאת, נמצאה שונות ניכרת בין מטופל לחולה בתדירות הכאת הריסונים בתגובה לתרופות המווסתות CFTR, אפילו עבור חולים עם אותן מוטציות של CFTR . יתר על כן, ההשפעה של הפרשת כלוריד מווסתת CFTR לא מתפקדת על תפקוד הריסיון אינה מובנת כהלכה. אין כיום פרוטוקול מקיף המדגים הכנת דגימות של מודלים של נתיבי אוויר במבחנה , רכישת תמונות וניתוח של Cilia Beat Frequency (CBF). תנאי תרבית סטנדרטיים ורכישת תמונות המבוצעים במצב מבוקר סביבתית יאפשרו כימות עקבי וניתן לשחזור של CBF בין אנשים ובתגובה לתרופות המווסתות CFTR. פרוטוקול זה מתאר את הכימות של CBF בשלוש מערכות מודל שונות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה: 1) יריעות אפיתל מקוריות, 2) מודלים של ממשק אוויר-נוזל המצולמים על תוספות תמיכה חדירות, ו-3) אורגנואידים תלת-ממדיים מוטמעים במטריצה חוץ-תאית. שני האחרונים משכפלים את הפיזיולוגיה של הריאות in vivo , עם ריסונים מכים וייצור של ריר. הפונקציה הציליארית נלכדת באמצעות מצלמת וידאו במהירות גבוהה בתא הנשלט על ידי הסביבה. סקריפטים שנבנו בהתאמה אישית משמשים לניתוח CBF. תרגום מדידות CBF למרפאה צפוי להיות כלי קליני חשוב לניבוי תגובה לתרופות מווסתות CFTR על בסיס פר מטופל.

כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול זה בכימות CBF, מוצגות התוצאות של CBF שנמדדו במודלים של תאי אפיתל ALI של דרכי הנשימה שמקורם בשלושה משתתפים עם CF ושלושה משתתפי בקרה בריאים. ביום ה-14 של ההבחנה התרבית, הריסונים המנצחים היו נוכחים (איור 6). מיום 14 עד 21 של בידול תרביות, נצפתה עלייה מובה?...

Watch this Scientific Journal Video about Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency at JoVE.com

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

פרוטוקול זה מתאר איסוף, הרחבה והתמיינות של תאי אפיתל באף למודלים של תאי אפיתל אורגנוטיפיים של דרכי הנשימה וכימות של תדירות פעימות הריסונים באמצעות הדמיה של תאים חיים וסקריפטים שנבנו בהתאמה אישית.

איסוף, הרחבה והתמיינות של מודלים ראשוניים של תאי אפיתל באף אנושי לכימות תדירות פעימות הריסונים

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

אנו מתארים את איסוף תאי הגזע של דרכי הנשימה מרירית האף. תאים אלה מורחבים ומתמיינים לאפיתל פסאודו-שכבתי במעבדה. זוהי התרחבות והתמיינות במבחנה, הדומה לדרכי הנשימה שלנו in vivo, מה שאומר שישנם תאים מתמחים, כגון תאים ciliated, נוכחים שיכולים לשמש לכימות תדירות פעימות הריסונים.כדי לאפשר כימות עקבי וניתן לשחזור של תדירות פעימות הריסונים בין אנשים שונים ובתגובה לתרופות שונות, אנו יוצרים סטנדרטיזציה של תנאי תרבית ורכישת תמונה. מדידות תדר פעימות ריסונים משמשות ככלים קליניים במחלות כגון דיסקינזיה ראשונית. אנו מקווים לבסס זאת כסמן קליני לסיסטיק פיברוזיס.המדגימות את ההליך הן קייטלין אלן ולורה פוסט, דוקטורנטיות מהמעבדה שלי, וד"ר שרון וונג, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. התחילו בכך שתבקשו מהמשתתפים לנשום דרך הפה. לאחר מכן לוקחים מברשת ציטולוגיה ביד הדומיננטית ומניחים את הספרה החמישית על הסנטר של המשתתף כדי לעגן את היד, מכניסים את המברשת הציטולוגיה למעבר האף של המשתתף בזווית של 45 מעלות לפנים של המשתתף, ומעבירים אותה דרך בשר האף.לאחר סיבוב המברשת זקופה, כך שתהיה בניצב לפנים של המשתתף, מקדמים את המברשת בעדינות, אך בחוזקה, כנגד הדופן הצדדית של האף מתחת לטורבינציה התחתונה עד שהיא נמצאת בחלק האמצעי עד האחורי של הטורבינציה הנחותה. סובבו את המברשת ב-360 מעלות עד שלוש פעמים. לאחר מכן להסיר אותו בעדינות, היפוך תמרון החדרה, כך התאים לא נעקרו מן המברשת.הכניסו את המברשת לתוך צינור האיסוף המוכן עם מדיה לאיסוף תאי האף, והניחו את צינור האיסוף על קרח. לאחר מערבולת עדינה כדי לעקור תאים מהמברשת, העבירו את צינור האיסוף שעל הקרח בחזרה לארון הבטיחות הביולוגית. באמצעות פיפטה סרולוגית, מעבירים את המדיה מצינור האיסוף לצינור חדש, ומשאירים מאחור את המברשות הציטולוגיות.ואז צנטריפוגה את הדגימה. לאחר צנטריפוגה, השהה מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיית תא תכנות מחדש מותנית. לאחר מכן באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, מעבירים את התאים דרך מסננת תאים המונחת על גבי צינור 50 מיליליטר בתנועה מעגלית.כדי לקבל השעיה של תא בודד, לאסוף את המתלה מתחתית הצינור, ולהעביר אותו דרך המסננת מספר פעמים. לאחר מכן יש להשליך את מסננת התא. כדי לזרוע את תאי האפיתל של דרכי הנשימה על תוספות התמיכה החדירות שהוכנו, ערבבו היטב את התאים מבלי ליצור בועות, כדי להבטיח שהם הומוגניים ובתרחיף.לאחר מכן להוסיף 150 microliters של ההשעיה התא לצד apical של מוסיף תמיכה חדיר מוכן. כדי להתמיין בין תאי אפיתל דרכי הנשימה בממשק האוויר-נוזל, תרבית אותם בהתמיינות, או במדיה ALI במשך יומיים. לאחר מכן שאפו את המדיה, והוסיפו 750 מיקרוליטרים של מדיית ALI רק לתא הבסיסי כדי ליצור ממשק אוויר-נוזל.כדי לזרוע את תאי אפיתל דרכי הנשימה בכיפות ECM, יש לתלות תאי אפיתל מנותקים של דרכי הנשימה בנפח המתאים של 90% ECM. לאחר מכן מחזיק את הפיפטה אנכית בזווית של 90 מעלות קרוב ככל האפשר לתחתית הבאר, מחלקים 50 מיקרוליטרים של השעיית תא ECM למרכז הבאר. לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות עד ECM מתמצק.בזמן שה-ECM מתמצק, יש לחמם את מדיית הזריעה האורגנואידית של דרכי הנשימה, או AOSM, לטמפרטורת החדר כדי למנוע ממנה לגרום לנזילה חוזרת, והתפוררות כיפת ה-ECM עם ההספה. לאחר הדגירה, הוסף 500 מיקרוליטרים של AOSM מחומם לכל באר על ידי חלוקה לאורך קיר הבאר. אין להקפיץ את המדיה ישירות על כיפת ה-ECM.שנה את המדיה כל יומיים במשך ארבעה עד שבעה ימים. כדי לשאוף את התקשורת, הטה את הלוח בזווית של 45 מעלות ושאף מהקצה התחתון של הבאר הרחק מכיפת ה- ECM. לאחר ארבעה עד שבעה ימים, התחל הבחנה אורגנואידית על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של מדיית הבחנה אורגנואידית מחוממת של דרכי הנשימה, או AODM, לכל באר, ושנה מדיה כל יומיים במשך שבעה ימים.מניחים את לוחית התרבית המכילה את דגמי תאי האפיתל של דרכי הנשימה לתוך צלחת המיקרוסקופ, וסוגרים את התא הסביבתי של המיקרוסקופ. אפשרו לדגימה להתאזן בתא המיקרוסקופ המחומם מראש, ששטחו 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני, למשך 30 דקות. בעינית המיקרוסקופ, התמקדו במודל התא.לאחר מכן באמצעות תוכנת הרכישה, לחץ על L100 כדי להחליף את נתיב האור ליציאה שבה המצלמה מותקנת. לחץ על כפתור Play הירוק כדי לדמיין את שדה הראייה של המיקרוסקופ באמצעות התוכנה. בדקו שהריסונים ממוקדים, והתאימו במידת הצורך.כדי להשיג תמונות קיטועי זמן מהתפריט, לחץ על רכוש ולאחר מכן על קיטועי זמן מהירים. בחלון המוקפץ, בחר מיקום שמירה, שם קובץ, לרכוש 1, 000 מסגרות. כדי להציג תצוגה מקדימה של הריסונים בשדה הראייה של המיקרוסקופ, לחץ על החל, ולאחר מכן על כפתור Play הירוק.התאם את מוקד Z במידת הצורך. לאחר מכן לחץ על הפעל עכשיו כדי ללכוד את קיטועי הזמן המהירים. לאחר התקנת התוכנה וארגז הכלים הדרושים, העתק את סקריפטי הניתוח המותאמים אישית ואת תיקיית סקריפטי התמיכה לכונן המקומי של המחשב.לאחר מכן, על תוכנת המחשוב, לחץ על הכרטיסייה בית, ואחריו הגדר נתיב. בחלון המוקפץ, לחץ על הוסף באמצעות תיקיות משנה. תחת נתיב החיפוש MATLAB, בחר את התיקיה המוצגת.לאחר מכן לחץ על שמור וסגור. ודא שסקריפטי הניתוח מקושרים לתוכנת המחשוב על-ידי בדיקה שהם מופיעים בחלונית השמאלית. לאחר מכן, העבר את קבצי התמונה הגולמיים לדוגמה שנרכשו לכונן המקומי של המחשב.לאחר מכן לחץ על BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. m ניתוח קובץ סקריפט בתוכנת המחשוב. כדי להפעיל את התסריט, לחץ על הכרטיסייה עורך, ואחריו כפתור ההפעלה הירוק.בחלון הבקשה שמופיע, בחר את קובצי התמונה הגולמיים לניתוח. הזן את זמן החשיפה עבור זמן הרכישה לכל מסגרת. לאחר מכן לחץ על אישור. הפעל את GetFirstAmplitude.m script על התיקייה המכילה את קבצי AveSpectrum. המתן עד שהסקריפט יפיק את ה- FirstAmplitudeStacked. קובץ XLSX, המכיל את תדירות המשרעת הגבוהה ביותר, ונמצא בטווח הפיזיולוגי של מכות ריסונים אפיתל בדרכי הנשימה.העתק את ערכי התדירות מ- FirstAmplitudeStacked. קובץ XLSX, ולתכנן אותם באמצעות תוכנת ניתוח מדעי. מוצגות התוצאות של תדירות פעימות הריסונים שנמדדו במודלים של תאי אפיתל בדרכי הנשימה ALI שמקורם בשלושה משתתפים עם סיסטיק פיברוזיס ושלושה משתתפי בקרה בריאים.ביום ה-14 של בידול תרבותי, הכאת ריסים היו נוכחים. מהיום ה-14, היום ה-21 להבחנה בתרבית, לא נצפתה עלייה מובהקת סטטיסטית בתדירות פעימות הריסונים בין קבוצות. ביום ה-21 של התמיינות התרבית, תדירות פעימות הריסונים הממוצעת בקרב משתתפי בקרה בריאים הייתה גבוהה משמעותית מזו של משתתפים עם סיסטיק פיברוזיס.יתר על כן, כאשר תדירות פעימות הריסונים צולמה באותם מודלים של תאים לאחר הסרת ריר, חלה עלייה מובהקת סטטיסטית בתדירות פעימות הריסונים כאשר הוסרה ליחה במודלים של ALI הן של אנשים בריאים והן של אנשים עם סיסטיק פיברוזיס. סביבת ההדמיה חייבת להיות מוסדרת בקפידה, שכן תפקוד cilia הוא רגיש מאוד לשינויים בגורמים סביבתיים. לפלטפורמה זו יש פוטנציאל להתבסס לצורך בדיקת תרופות ספציפיות למטופל כדי להיות מסוגלת לזהות תרופות המווסתות את תפקוד ה-CFTR.

Research

JoVE Journal

Medicine

Collection Protocol for Human Pancreas

אוסף פרוטוקול לבלב אנוש

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

עיבוד של רקמת גידול במוח העיקרית למבחנים בתאי גזע וזרימת מיון

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

העיקרית של תרבות האנושית שיווי המשקל schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

בתדירות גבוהה אולטראסאונד הדמיה של בלוטות לימפה עכבר צוואר הרחם

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

ספיגת נוזלים באף ובסימפונות: דגימה מדויקת של רירית מערכת הנשימה האנושית, מעבדה בעיבוד של דגימות

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

דור של תאי אפיתל באף אדם Spheroids למחקר הרגולטור מוליכות Transmembrane תגובותיהם סיסטיק פיברוזיס

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...