Name: collection, expansion, and differentiation of primary human nasal epithelial cell models for quantification of cilia beat frequency
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency at JoVE.com

Ringraziamo i partecipanti allo studio e le loro famiglie per i loro contributi. Apprezziamo l'assistenza del dipartimento respiratorio di Randwick del Sydney Children's Hospitals (SCH) nell'organizzazione e nella raccolta di campioni biologici dei pazienti - un ringraziamento speciale al Dr. John Widger, alla dottoressa Yvonne Belessis, Leanne Plush, Amanda Thompson e Rhonda Bell. Riconosciamo l'assistenza di Iveta Slapetova e Renee Whan della Katharina Gaus Light Microscopy Facility all'interno del Mark Wainwright Analytical Centre presso UNSW Sydney. Questo lavoro è supportato dal National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), CF Foundation Australia e Sydney Children's Hospital Foundation. Gli autori desiderano riconoscere Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health per il suo contributo e supporto. Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health è una joint venture cooperativa senza scopo di lucro tra il Sydney Children's Hospitals Network, il Children's Medical Research Institute e il Children's Cancer Institute. È stato istituito con il supporto del governo del NSW per coordinare e integrare la ricerca pediatrica. Luminesce Alliance è anche affiliata con l'Università di Sydney e l'Università del New South Wales Sydney. KMA è supportata da una borsa di studio del programma di formazione per la ricerca del governo australiano. LKF è sostenuta dal Rotary Club di Sydney Cove/Sydney Children's Hospital Foundation e dalle borse di studio post-laurea dell'UNSW University.

L'approvazione dello studio è stata ricevuta dal Sydney Children's Hospital Network Ethics Review Board (HREC/16/SCHN/120). Il consenso scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti (o dal tutore dei partecipanti) prima della raccolta dei campioni biologici.
1. Preparativi per stabilire modelli di cellule epiteliali delle vie aeree
<ol><li>Preparare i mezzi di raccolta delle cellule nasali combinando l'80% di Modified Eagle Medium di Dulbecco e il 20% di siero bovino fe...

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	<li>Barbato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+a+consensus+statement+on+diagnostic+and+treatment+approaches+in+children.">Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children.</a> European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).</li><li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Chioccioli, M., Feriani, L., Kotar, J., Bratcher, P. 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Ci sono molteplici fattori che potrebbero oscurare la quantificazione del CBF nei fogli epiteliali nasali. I fogli epiteliali devono essere visualizzati entro 3-9 ore dalla raccolta del campione poiché la funzione ciliare è più stabile durante questo periodo37. Meno globuli rossi e detriti sono più ottimali per l'imaging poiché interferiscono con l'acquisizione dei dati. Quando si seleziona un ROI per l'imaging, è importante selezionare un foglio epiteliale che non sia stato danneggiato o in...

Le misurazioni della frequenza e del pattern del battito delle ciglia (CBF) sono state stabilite come strumenti diagnostici per malattie respiratorie come la discinesia ciliare primaria (PCD)1. Nella fibrosi cistica (FC), la disfunzione del canale del cloruro CFTR (Transmembrane Conductance Regulator) CFTR causa disidratazione del liquido superficiale delle vie aeree e compromissione della clearance mucociliare2. La funzione ciliare è stata studiata in vitro in modelli cellulari primari delle vie aeree come indicatore dell'attività del canale CFTR3. Tuttavia, esiste una notevole variabilità da paziente a paziente nel CBF in risposta ai farmaci modulanti CFTR, anche per i pazienti con le stesse mutazioni CFTR 3. Inoltre, l'impatto della secrezione disfunzionale di cloruro regolata da CFTR sulla funzione ciliare è poco compreso. Attualmente non esiste un protocollo completo che dimostri la preparazione del campione di modelli in vitro delle vie aeree, l'acquisizione di immagini e l'analisi del CBF.
I fogli epiteliali nasali isolati dalle spazzolature della mucosa nasale sono utilizzati direttamente per le misurazioni della funzione ciliare per la diagnosi di PCD4. Tuttavia, mentre non vi è alcun controllo sulle dimensioni o sulla qualità dei fogli epiteliali nasali ottenuti, il CBF varia a seconda che venga misurato su singole cellule o fogli cellulari e su bordi ciliati del foglio epiteliale che sono interrotti o ininterrotti5. Pertanto, le discinesie secondarie causate da danni alle cellule durante la raccolta delle spazzolature della mucosa nasale possono influenzare il CBF. La coltura cellulare primaria di cellule epiteliali nasali e la loro differenziazione all'interfaccia aria-liquido (ALI) o nella matrice tridimensionale della membrana basale in organoidi epiteliali delle vie aeree ciliate danno origine a ciglia esenti da discinesie secondarie 4,6,7,8. Le cellule epiteliali delle vie aeree differenziate all'ALI (d'ora in poi denominate modelli ALI) sono state considerate un importante aiuto diagnostico secondario che replica i pattern del battito ciliare e la frequenza delle spazzolature ex vivo della mucosa nasale6 e consente l'analisi dell'ultrastruttura ciliare, del pattern del battito e della frequenza del battito mantenendo i difetti specifici del paziente9 . Tuttavia, esistono discrepanze nelle metodologie utilizzate per creare questi modelli cellulari differenziati pseudostratificati e mucociliari. Diversi protocolli di espansione o differenziazione della coltura potrebbero indurre fenotipi epiteliali distinti (ciliati o secretori)10 e determinare differenze significative nel CBF11. La CBF è stata quantificata in spazzolature epiteliali nasali 4,6,12,13,14,15,16, organoidi epiteliali delle vie aeree 14,17,18 e modelli ALI 3,4,6,13,19,20, 21. Tuttavia, tra questi protocolli, ci sono grandi variabilità e spesso molti parametri non sono controllati. Ad esempio, in alcuni studi, il CBF viene ripreso in situ mentre le cellule del modello ALI rimangono sull'inserto di supporto permeabile 3,19,20,21, altre ancora raschiano le cellule dall'inserto di supporto permeabile e le visualizzano sospese nei media 4,6,13.
Inoltre, la più ampia applicazione di tecniche che misurano la funzione ciliare è limitata dall'estrema suscettibilità della funzione ciliare ai cambiamenti dei fattori ambientali. Fattori ambientali come la temperatura22, l'umidità 23,24 e il pH 25,26 influenzano la funzione ciliare e devono essere regolati per quantificare accuratamente il CBF. I vari parametri fisiologici utilizzati in diversi laboratori e il modo in cui influenzano il CBF sono stati rivisti in precedenza27.
In letteratura sono riportate varie tecnologie di imaging e approcci alle misurazioni CBF. Per la diagnostica PCD, la microscopia video viene utilizzata per misurare la funzione ciliare28,29. Recentemente, un algoritmo di analisi video basato sulla microscopia dinamica differenziale è stato utilizzato per quantificare sia il CBF che la coordinazione delle ciglianei modelli ALI 3,30 delle cellule epiteliali delle vie aeree. Questo metodo consente la caratterizzazione del battito ciliare nelle cellule epiteliali delle vie aeree in modo rapido e completamente automatizzato, senza la necessità di segmentare o selezionare regioni. Vari metodi per l'imaging e la quantificazione del CBF possono aggiungere alle differenze riportate in CBF in letteratura (Supplementary File 1).
Un protocollo dalla coltura alla quantificazione per semplificare i metodi esistenti, la standardizzazione delle condizioni di coltura e l'acquisizione di immagini, eseguite in rigorose condizioni di controllo ambientale, consentirebbero una quantificazione coerente e riproducibile del CBF all'interno e tra gli individui.
Questo protocollo fornisce una descrizione completa della raccolta di cellule epiteliali, delle condizioni di crescita di espansione e differenziazione e della quantificazione del CBF in tre diversi sistemi modello di cellule epiteliali delle vie aeree di origine nasale: 1) fogli epiteliali nativi, 2) modelli ALI ripresi su inserti di supporto permeabili e 3) organoidi tridimensionali incorporati nella matrice extracellulare (ECM) (Figura 1 ). Le cellule epiteliali nasali ottenute da spazzolature dei turbinati inferiori nasali sono utilizzate come rappresentanti dell'epitelio delle vie aeree poiché sono un surrogato efficace per le cellule epiteliali bronchiali31 superando la procedura invasiva associata alla raccolta di spazzolature bronchiali. Il metodo Conditional Reprogramming Cell (CRC) viene utilizzato per espandere le cellule epiteliali primarie delle vie aeree per la creazione di modelli ALI e organoidi tridimensionali. La riprogrammazione condizionale delle cellule epiteliali delle vie aeree in uno stato simile alle cellule staminali è indotta dalla co-coltura con il sistema cellulare alimentatore di fibroblasti arrestato dalla crescita e l'inibitore della chinasi Rho-associata (ROCK)32. È importante sottolineare che il metodo CRC aumenta il raddoppio della popolazione nelle cellule epiteliali delle vie aeree mantenendo il loro potenziale di differenziazione tessuto-specifico33,34. In tutti i modelli di cellule epiteliali delle vie aeree, la funzione ciliare viene catturata in una camera a temperatura controllata utilizzando una videocamera ad alta velocità con impostazioni di acquisizione delle immagini standardizzate. Per la quantificazione del CBF vengono utilizzati script personalizzati.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63090/63090fig01.jpg"> Figura 1: Schema del flusso di lavoro. Dopo aver spazzolato il turbinato inferiore nasale dei partecipanti, le cellule epiteliali delle vie aeree vengono utilizzate in uno dei due modi. I fogli epiteliali delle vie aeree sono isolati e la frequenza del battito delle ciglia viene immediatamente visualizzata, oppure le cellule epiteliali delle vie aeree vengono espanse tramite il metodo della cellula di riprogrammazione condizionale. Le cellule epiteliali delle vie aeree espanse con CRC sono differenziate per stabilire cellule epiteliali delle vie aeree in un'interfaccia aria-liquido o colture organoidi epiteliali delle vie aeree. L'imaging della frequenza del battito ciliare viene acquisito utilizzando un microscopio di imaging a cellule vive con una camera ambientale di riscaldamento e umidità e una fotocamera scientifica ad alta frequenza di fotogrammi (>100Hz). L'analisi dei dati viene eseguita utilizzando script personalizzati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63090/63090fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2786</td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanyl-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8541</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Zyla 4.2 sCMOS</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Fast frame rate (&#62;100 Hz) scientific camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6987</td>
			<td>50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI S Plan Fluor ELWD 20XC</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>MRH08230</td>
			<td>Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Gel Strainer 40 UM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431750</td>
			<td>Pore size 40 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470</td>
			<td>Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 &#956;m pore polyester membrane insert.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytology brushes</td>
			<td>McFarlane Medical</td>
			<td>33009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-Ham</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-Ham</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell imaging microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>250 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Scientific analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cryo.s vials</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3135</td>
			<td>Cryogenic vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI-FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>3.6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator NL Ti2 BLACK 2000</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td>2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>74220 706</td>
			<td>Bead bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1254302</td>
			<td>Thermal beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Computing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microscoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10&#160;mg streptomycin/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult Airway Organoid Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5060</td>
			<td>Airway Organoid Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-Ex Plus Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol-S</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5015</td>
			<td>Type I Collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReagentPack Subculture Reagents</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhEGF (Epidermal Growth Factor, human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td>25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Stage Top Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection, expansion, and differentiation of primary human nasal epithelial cell models for quantification of cilia beat frequency

Le misurazioni della funzione delle ciglia (frequenza del battito, pattern) sono state stabilite come strumenti diagnostici per le malattie respiratorie come la discinesia ciliare primaria. Tuttavia, l'applicazione più ampia di queste tecniche è limitata dall'estrema suscettibilità della funzione ciliare ai cambiamenti dei fattori ambientali, ad esempio temperatura, umidità e pH. Nelle vie aeree dei pazienti con fibrosi cistica (FC), l'accumulo di muco impedisce il battito delle ciglia. La funzione delle ciglia è stata studiata in modelli cellulari primari delle vie aeree come indicatore dell'attività del canale CFTR (Transmembrane Conductance Regulator). Tuttavia, una notevole variabilità da paziente a paziente nella frequenza di battitura delle ciglia è stata riscontrata in risposta ai farmaci modulanti CFTR, anche per i pazienti con le stesse mutazioni CFTR . Inoltre, l'impatto della secrezione disfunzionale di cloruro regolata da CFTR sulla funzione ciliare è poco compreso. Attualmente non esiste un protocollo completo che dimostri la preparazione del campione di modelli in vitro delle vie aeree, l'acquisizione di immagini e l'analisi della frequenza del battito delle ciglia (CBF). Le condizioni di coltura standardizzate e l'acquisizione di immagini eseguite in una condizione controllata dal punto di vista ambientale consentirebbero una quantificazione coerente e riproducibile del CBF tra individui e in risposta ai farmaci modulanti CFTR. Questo protocollo descrive la quantificazione del CBF in tre diversi sistemi modello di cellule epiteliali delle vie aeree: 1) fogli epiteliali nativi, 2) modelli di interfaccia aria-liquido ripresi su inserti di supporto permeabili e 3) organoidi tridimensionali incorporati in matrice extracellulare. Questi ultimi due replicano la fisiologia polmonare in vivo , con ciglia battenti e produzione di muco. La funzione ciliare viene catturata utilizzando una videocamera ad alta velocità in una camera controllata dall'ambiente. Per l'analisi di CBF vengono utilizzati script personalizzati. La traduzione delle misurazioni CBF in clinica è considerata un importante strumento clinico per prevedere la risposta ai farmaci modulanti CFTR su base paziente.

Per dimostrare l'efficienza di questo protocollo nella quantificazione del CBF, vengono presentati i risultati del CBF misurati in modelli ALI di cellule epiteliali delle vie aeree derivati da tre partecipanti con FC e tre partecipanti sani di controllo. Il giorno 14 della differenziazione della cultura, erano presenti ciglia battenti (Figura 6). Dal giorno 14 al 21 della differenziazione della cultura, è stato osservato un aumento statisticamente significativo (P < 0,0345) del CBF all'inte...

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Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Questo protocollo descrive la raccolta, l'espansione e la differenziazione delle cellule epiteliali nasali in modelli organotipici di cellule epiteliali delle vie aeree e la quantificazione della frequenza del battito delle ciglia tramite imaging di cellule vive e script personalizzati.

Raccolta, espansione e differenziazione di modelli primari di cellule epiteliali nasali umane per la quantificazione della frequenza del battito delle ciglia

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

Descriviamo la raccolta di cellule staminali delle vie aeree dalla mucosa nasale. Queste cellule sono espanse e differenziate in un epitelio pseudostratificato in laboratorio. Questa è l'espansione e la differenziazione in vitro, che è simile alle nostre vie aeree in vivo, il che significa che ci sono cellule specializzate, come le cellule ciliate, presenti che possono essere utilizzate per quantificare la frequenza del battito delle ciglia.Per consentire una quantificazione coerente e riproducibile della frequenza dei battiti delle ciglia tra individui diversi e in risposta a diversi farmaci, standardizziamo le condizioni di coltura e l'acquisizione di immagini. Le misurazioni della frequenza del battito delle ciglia sono utilizzate come strumenti clinici in malattie come la discinesia ciliare primaria. Speriamo di stabilire questo come marker clinico per la fibrosi cistica.A dimostrare la procedura sono Katelin Allan e Laura Fawcett, studenti di dottorato del mio laboratorio, e la dottoressa Sharon Wong, postdoc del mio laboratorio. Inizia chiedendo al partecipante di respirare attraverso la bocca. Quindi, prendendo un pennello citologico nella mano dominante e appoggiando la quinta cifra sul mento del partecipante per ancorare la mano, inserire il pennello citologico nel passaggio nasale del partecipante con un angolo di 45 gradi rispetto al viso del partecipante e passarlo attraverso il meato nasale.Dopo aver ruotato il pennello in posizione verticale, in modo che sia perpendicolare al viso del partecipante, far avanzare il pennello delicatamente, ma con fermezza, contro la parete laterale del naso sotto il turbinato inferiore fino a quando non si trova nella parte medio-posteriore del turbinato inferiore. Ruotare il pennello di 360 gradi fino a tre volte. Quindi rimuoverlo delicatamente, invertendo la manovra di inserimento, in modo che le cellule non vengano spostate dal pennello.Posizionare il pennello nel tubo di raccolta preparato con il mezzo di raccolta delle cellule nasali e posizionare il tubo di raccolta sul ghiaccio. Dopo un leggero vortice per rimuovere le cellule dalla spazzola, trasferire il tubo di raccolta sul ghiaccio nell'armadio di biosicurezza. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire il mezzo dalla provetta di raccolta a una nuova provetta, lasciando dietro di sé i pennelli citologici.Quindi centrifugare il campione. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di media cellulare di riprogrammazione condizionale. Quindi, utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, passare le cellule attraverso un setaccio cellulare posto sopra un tubo da 50 millilitri con un movimento circolare.Per ottenere una sospensione a cella singola, raccogliere la sospensione dal fondo del tubo e passarla attraverso il setaccio più volte. Quindi scartare il setaccio cellulare. Per seminare le cellule epiteliali delle vie aeree sugli inserti di supporto permeabili preparati, mescolare bene le cellule senza creare bolle, assicurandosi che siano omogenee e in sospensione.Quindi aggiungere 150 microlitri della sospensione cellulare sul lato apicale degli inserti di supporto permeabili preparati. Per differenziare le cellule epiteliali delle vie aeree all'interfaccia aria-liquido, coltivarle in differenziazione o terreni ALI per due giorni. Quindi aspirare il fluido e aggiungere 750 microlitri di media ALI solo al compartimento basale per creare un'interfaccia aria-liquido.Per seminare le cellule epiteliali delle vie aeree nelle cupole ECM, risospendere le cellule epiteliali delle vie aeree dissociate con il volume appropriato del 90% di ECM. Quindi tenendo la pipetta verticalmente con un angolo di 90 gradi il più vicino possibile al fondo del pozzo, erogare 50 microlitri della sospensione della cella ECM al centro del pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 20 minuti fino a quando l'ECM non si solidifica.Mentre l'ECM si sta solidificando, riscaldare il mezzo di semina degli organoidi delle vie aeree, o AOSM, a temperatura ambiente per evitare che causi la ri-liquefazione e la disintegrazione della cupola ECM dopo l'aggiunta. Dopo l'incubazione, aggiungere 500 microlitri di AOSM riscaldato a ciascun pozzetto erogando lungo la parete del pozzo. Non pipettare i fluidi direttamente sulla cupola ECM.Cambiare il supporto ogni due giorni per quattro-sette giorni. Per aspirare il fluido, inclinare la piastra con un angolo di 45 gradi e aspirare dal bordo inferiore del pozzo lontano dalla cupola ECM. Dopo quattro-sette giorni, iniziare la differenziazione degli organoidi aggiungendo 500 microlitri di mezzi di differenziazione organoide delle vie aeree riscaldati, o AODM, a ciascun pozzetto e cambiare i terreni ogni due giorni per sette giorni.Posizionare la piastra di coltura contenente i modelli di cellule epiteliali delle vie aeree nell'inserto della piastra del microscopio e chiudere la camera ambientale del microscopio. Lasciare che il campione si bilanci nella camera del microscopio preriscaldata, riempita di anidride carbonica al 5% per 30 minuti, a 37 gradi Celsius. All'oculare del microscopio, concentrarsi sul modello cellulare.Quindi, utilizzando il software di acquisizione, fare clic su L100 per commutare il percorso della luce sulla porta in cui è montata la telecamera. Fare clic sul pulsante verde Play per visualizzare il campo visivo del microscopio tramite il software. Controllare che le ciglia siano a fuoco e regolare se necessario.Per acquisire immagini time-lapse dal menu, fare clic su Acquisisci, quindi su Fast TimeLapse. Nella finestra pop-up, selezionare una posizione di salvataggio e il nome del file, acquisire 1.000 frame. Per visualizzare in anteprima le ciglia nel campo visivo del microscopio, fare clic su Applica, seguito dal pulsante verde Play.Se necessario, regolare la messa a fuoco Z. Quindi fare clic su Esegui ora per acquisire il TimeLapse veloce. Dopo aver installato il software e le caselle degli strumenti necessari, copiare gli script di analisi personalizzati appropriati e la cartella degli script di supporto nell'unità locale del computer.Successivamente, sul software informatico, fare clic sulla scheda Home, seguita da Imposta percorso. Nella finestra pop-up, fai clic su Aggiungi con sottocartelle. Nel percorso di ricerca MATLAB, seleziona la cartella visualizzata.Quindi fare clic su Salva e chiudi. Verificare che gli script di analisi siano collegati al software di elaborazione controllando che appaiano nel pannello di sinistra. Quindi, trasferire i file di immagine raw di esempio acquisiti sull'unità locale del computer.Quindi fare clic sul BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. m analisi script nel software informatico. Per eseguire lo script, fare clic sulla scheda Editor, seguita dal pulsante verde Riproduci.Nella finestra del prompt visualizzata, selezionare i file di immagine raw da analizzare. Immettere il tempo di esposizione per il tempo di acquisizione per fotogramma. Quindi fare clic su OK. Eseguire GetFirstAmplitude.m nella cartella che contiene i file AveSpectrum. Attendere che lo script restituisca FirstAmplitudeStacked. XLSX, che contiene la frequenza di ampiezza più elevata e rientra nell'intervallo fisiologico del battito delle ciglia epiteliali delle vie aeree.Copiare i valori di frequenza da FirstAmplitudeStacked. XLSX e tracciarli utilizzando un software di analisi scientifica. Vengono presentati i risultati della frequenza del battito delle ciglia misurata nei modelli ALI delle cellule epiteliali delle vie aeree derivati da tre partecipanti con fibrosi cistica e tre partecipanti sani di controllo.Il giorno 14 della differenziazione della cultura, erano presenti ciglia battenti. Dal giorno 14, giorno 21 della differenziazione della coltura, non è stato osservato un aumento statisticamente significativo della frequenza dei battiti delle ciglia tra le coorti. Il giorno 21 della differenziazione della coltura, la frequenza media dei battiti delle ciglia per i partecipanti sani di controllo era significativamente superiore a quella dei partecipanti con fibrosi cistica.Inoltre, quando la frequenza del battito delle ciglia è stata ripresa negli stessi modelli cellulari dopo la rimozione del muco, c'è stato un aumento statisticamente significativo della frequenza del battito delle ciglia quando il muco è stato rimosso nei modelli ALI di individui sani e quelli con fibrosi cistica. L'ambiente di imaging deve essere strettamente regolato, poiché la funzione delle ciglia è estremamente suscettibile ai cambiamenti nei fattori ambientali. Questa piattaforma ha il potenziale per essere stabilita per lo screening farmacologico specifico del paziente per essere in grado di identificare i farmaci che modulano la funzione CFTR.

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