Name: collection, expansion, and differentiation of primary human nasal epithelial cell models for quantification of cilia beat frequency
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency at JoVE.com

연구 참가자와 그 가족의 기여에 감사드립니다. 환자 생체 표본의 조직 및 수집에 대한 시드니 아동 병원 (SCH) 랜드 윅 호흡기 부서의 도움에 감사드립니다 - 존 위저 박사, 이본 벨레시스 박사, 리앤 플러시, 아만다 톰슨, 론다 벨에게 특별한 감사를드립니다. 우리는 UNSW 시드니의 Mark Wainwright Analytical Centre 내의 Katharina Gaus Light Microscopy Facility의 Iveta Slapetova와 Renee Wan의 도움을 인정합니다. 이 작업은 NHMRC(National Health and Medical Research Council) Australia(GNT1188987), CF Foundation Australia 및 Sydney Children's Hospital Foundation의 지원을 받습니다. 저자는 Luminesce Alliance - 어린이 건강을위한 혁신의 기여와 지원에 대해 인정하고 싶습니다. Luminesce Alliance - 어린이 건강을위한 혁신은 시드니 어린이 병원 네트워크, 어린이 의학 연구소 및 어린이 암 연구소 간의 비영리 협력 합작 투자입니다. 소아과 연구를 조정하고 통합하기 위해 NSW 정부의 지원으로 설립되었습니다. Luminesce Alliance는 University of Sydney 및 University of New South Wales Sydney와도 제휴하고 있습니다. KMA는 호주 정부 연구 교육 프로그램 장학금의 지원을 받습니다. LKF는 시드니 코브 로타리클럽/시드니 아동 병원 재단과 UNSW 대학교 대학원 장학금의 지원을 받는다.

연구 승인은 Sydney Children's Hospital Network Ethics Review Board (HREC/16/SCHN/120)로부터 받았다. 생체 표본을 수집하기 전에 모든 참가자(또는 참가자의 보호자)로부터 서면 동의를 받았습니다.
1. 기도 상피세포 모델 구축을 위한 준비
<ol><li>80% Dulbecco의 변형 독수리 배지와 20% 태아 소 혈청을 결합하여 비강 세포 수집 배지를 준비합니다. 1 μL/mL의 페니실린/스트렙토마이신을...

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	<li>Barbato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+a+consensus+statement+on+diagnostic+and+treatment+approaches+in+children.">Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children.</a> European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).</li><li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Chioccioli, M., Feriani, L., Kotar, J., Bratcher, P. 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비강 상피 시트에서 CBF의 정량화를 모호하게 할 수있는 여러 요인이 있습니다. 상피 시트는 이 시간 동안 섬모 기능이 가장 안정적이기 때문에 샘플 수집 후 3-9시간 이내에 이미지화되어야 합니다(37). 적혈구와 파편이 적을수록 데이터 수집을 방해하기 때문에 이미징에 가장 적합합니다. 이미징을 위한 ROI를 선택할 때, 이러한 변수가 CBF5에 영향을 미치는 것으?...

섬모 박동 빈도(CBF) 및 패턴의 측정은 원발성 섬모 운동 이상증(PCD)1과 같은 호흡기 질환의 진단 도구로 확립되었습니다. 낭포 성 섬유증 (CF)에서 CF 막 횡단 전도도 조절기 (CFTR) 염화물 채널의 기능 장애는기도 표면 액체의 탈수 및 점액 섬모 클리어런스 손상2을 유발합니다. 섬모 기능은 CFTR 채널 활성의 지표로서 일차 기도 세포 모델에서 시험관내에서 조사되었다3. 그러나, 동일한 CFTR 돌연변이를 가진 환자의 경우에도, CFTR 조절 약물에 대한 반응으로 CBF에 상당한 환자 대 환자 가변성이 존재한다3. 또한, 기능 장애 CFTR 조절 염화물 분비가 섬모 기능에 미치는 영향은 잘 이해되지 않았습니다. 현재 체 외 기도 모델의 샘플 준비, 이미지 획득 및 CBF 분석을 입증하는 포괄적 인 프로토콜은 없습니다.
비강 점막 칫솔질로부터 분리 된 비강 상피 시트는 PCD 진단4을위한 섬 모체 기능의 측정에 직접 사용된다. 그러나, 수득된 비강 상피 시트의 크기 또는 품질에 대한 제어는 없지만, CBF는 단일 세포 또는 세포 시트 및 파쇄되거나 중단되지 않은 상피 시트 섬모 가장자리에서 측정되는지 여부에 따라달라집니다5. 따라서 비강 점막 칫솔질을 수집하는 동안 세포 손상으로 인한 이차성 운동 이상증은 CBF에 영향을 미칠 수 있습니다. 비강 상피 세포의 1 차 세포 배양 및 공기-액체 계면 (ALI) 또는 3 차원 기저막 매트릭스에서 섬모기도 상피 오가노이드로의 분화는 2 차 운동 이상증 4,6,7,8이없는 섬모를 생성합니다. ALI에서 분화된 기도 상피 세포(이하 ALI 모델이라고 함)는 생체 외 코 점막 칫솔질의 섬모 박동 패턴과 빈도를 복제하고6 환자 특이적 결함을 유지하면서 섬모 미세 구조, 박동 패턴 및 박동 빈도를 분석할 수 있는 중요한 2차 진단 보조제로 간주되었습니다.9 . 그러나 이러한 유사층화되고 점액섬모로 분화된 세포 모델을 만드는 데 사용되는 방법론에는 불일치가 존재합니다. 상이한 배양 확장 또는 분화 프로토콜은 뚜렷한 상피 표현형(섬모 또는 분비)10을 유도하고 CBF11에 상당한 차이를 초래할 수 있습니다. CBF 는 비강 상피 브러싱 4,6,12,13,14,15,16,기도 상피 오가노이드14,17,18 및 ALI 모델 3,4,6,13,19,20 에서 정량화되었으며, 21. 그러나 이러한 프로토콜 중에는 큰 변동성이 있으며 종종 많은 매개 변수가 제어되지 않습니다. 예를 들어, 일부 연구에서, CBF는 ALI 모델의 세포가 투과성 지지체 삽입물 3,19,20,21 상에 남아있는 동안 현장에서 이미징되지만, 다른 것들은 투과성 지지체 삽입물로부터 세포를 긁어내고 이들을 배지 4,6,13에 부유시키는 것을 이미지화한다.
또한, 섬모 기능을 측정하는 기술의 광범위한 적용은 환경 요인의 변화에 대한 섬모 기능의 극단적 인 민감성에 의해 제한됩니다. 온도 22, 습도 23,24 및 pH 25,26과 같은 환경 요인은 섬모 기능에 영향을 미치며 CBF를 정확하게 정량화하기 위해 조절되어야 합니다. 다양한 실험실에서 사용되는 다양한 생리적 매개 변수와 CBF에 미치는 영향은 이전에 검토되었습니다27.
CBF 측정에 대한 다양한 이미징 기술 및 접근법이 문헌에보고되어 있습니다. PCD 진단의 경우 비디오 현미경을 사용하여 섬모 기능28,29를 측정합니다. 최근에, 차동 동적 현미경에 기초한 비디오 분석 알고리즘이 기도 상피 세포 ALI 모델 3,30에서 CBF 및 섬모 협응을 정량화하는 데 사용되었다. 이 방법은 영역을 분할하거나 선택할 필요 없이 빠르고 완전히 자동화된 방식으로 기도 상피 세포에서 섬모 박동의 특성을 분석할 수 있습니다. CBF의 이미징 및 정량화를 위한 다양한 방법은 문헌에서 CBF에 보고된 차이점을 추가할 수 있습니다(보충 파일 1).
배양에서 정량화에 이르는 프로토콜은 기존 방법을 간소화하고, 배양 조건의 표준화 및 엄격한 환경 통제 조건에서 수행되는 이미지 획득을 통해 개인 내 및 개인 간에 CBF의 일관되고 재현 가능한 정량화를 가능하게 합니다.
이 프로토콜은 비강 기원의 세 가지 다른 기도 상피 세포 모델 시스템에서 상피 세포 수집, 확장 및 분화 배양 조건, CBF의 정량화에 대한 완전한 설명을 제공합니다: 1) 네이티브 상피 시트, 2) 투과성 지지 삽입물에서 이미징된 ALI 모델 및 3) 세포외 기질(ECM) 내장 3차원 오가노이드(그림 1 ). 비강 하비갑개 칫솔질로부터 수득된 비강 상피 세포는 기관지 칫솔질 수집과 관련된 침습적 절차를 극복하면서 기관지 상피 세포(31)에 대한 효과적인 대용물이기 때문에 기도 상피의 대표자로서 사용된다. 조건부 재프로그래밍 세포(CRC) 방법은 ALI 모델 및 3차원 오가노이드 생성을 위해 일차 기도 상피 세포를 확장하는 데 사용됩니다. 줄기 세포와 유사한 상태로의 기도 상피 세포의 조건부 재프로그래밍은 성장-정지된 섬유아세포 영양세포 시스템 및 Rho-관련 키나아제 (ROCK) 억제제32와의 공동 배양에 의해 유도된다. 중요하게도, CRC 방법은 조직 특이적 분화 잠재력을 유지하면서 기도 상피 세포의 집단 배가를 증가시킵니다(33,34). 모든 기도 상피 세포 모델에서 섬모 기능은 표준화된 이미지 획득 설정을 갖춘 고속 비디오 카메라를 사용하여 온도 제어 챔버에서 캡처됩니다. 맞춤형 스크립트는 CBF의 정량화를 위해 사용됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63090/63090fig01.jpg"> 그림 1: 워크플로의 개략도. 참가자의 비강 하비갑개를 닦은 후 기도 상피 세포는 두 가지 방법 중 하나로 활용됩니다. 기도 상피 시트가 분리되고 섬모 박동 빈도가 즉시 이미지화되거나 기도 상피 세포가 조건부 재프로그래밍 세포 방법을 통해 확장됩니다. CRC-확장 기도 상피 세포는 공기-액체 계면 또는 기도 상피 오가노이드 배양에서 기도 상피 세포를 확립하기 위해 분화됩니다. 섬모 박동 주파수의 이미징은 가열 및 습도 환경 챔버와 빠른 프레임 속도(>100Hz) 과학 카메라가 있는 라이브 셀 이미징 현미경을 사용하여 획득됩니다. 데이터 분석은 사용자 지정 스크립트를 사용하여 수행됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63090/63090fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2786</td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanyl-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8541</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Zyla 4.2 sCMOS</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Fast frame rate (&#62;100 Hz) scientific camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6987</td>
			<td>50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI S Plan Fluor ELWD 20XC</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>MRH08230</td>
			<td>Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Gel Strainer 40 UM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431750</td>
			<td>Pore size 40 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470</td>
			<td>Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 &#956;m pore polyester membrane insert.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytology brushes</td>
			<td>McFarlane Medical</td>
			<td>33009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-Ham</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-Ham</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell imaging microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>250 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Scientific analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cryo.s vials</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3135</td>
			<td>Cryogenic vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI-FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>3.6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator NL Ti2 BLACK 2000</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td>2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>74220 706</td>
			<td>Bead bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1254302</td>
			<td>Thermal beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Computing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microscoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10&#160;mg streptomycin/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult Airway Organoid Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5060</td>
			<td>Airway Organoid Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-Ex Plus Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol-S</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5015</td>
			<td>Type I Collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReagentPack Subculture Reagents</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhEGF (Epidermal Growth Factor, human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td>25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Stage Top Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection, expansion, and differentiation of primary human nasal epithelial cell models for quantification of cilia beat frequency

섬모 기능 (박동 빈도, 패턴)의 측정은 원발성 섬모 운동 이상증과 같은 호흡기 질환의 진단 도구로 확립되었습니다. 그러나, 이들 기술의 더 넓은 적용은 온도, 습도 및 pH와 같은 환경 인자의 변화에 대한 섬모 기능의 극단적 인 민감성에 의해 제한된다. 낭포 성 섬유증 (CF) 환자의기도에서 점액 축적은 섬모 박동을 방해합니다. 섬모 기능은 CF 막 횡단 전도도 조절기 (CFTR) 채널 활성의 지표로서 1 차기도 세포 모델에서 조사되었습니다. 그러나 동일한 CFTR 돌연변이를 가진 환자의 경우에도 CFTR 조절 약물에 대한 반응으로 섬모 박동 빈도의 상당한 환자 간 변동성이 발견되었습니다. 또한, 기능 장애 CFTR 조절 염화물 분비가 섬모 기능에 미치는 영향은 잘 이해되지 않았습니다. 현재 체외 기도 모델의 샘플 준비, 이미지 획득 및 섬모 박동 주파수 (CBF) 분석을 입증하는 포괄적 인 프로토콜은 없습니다. 환경적으로 통제된 조건에서 수행된 표준화된 배양 조건 및 이미지 획득은 개인 간 및 CFTR 조절 약물에 대한 반응으로 CBF의 일관되고 재현 가능한 정량화를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 세 가지 다른 기도 상피 세포 모델 시스템에서 CBF의 정량화를 설명합니다: 1) 천연 상피 시트, 2) 투과성 지지 삽입물 상에서 이미징된 공기-액체 인터페이스 모델, 및 3) 세포외 기질-포매된 3차원 오가노이드. 후자의 두 가지는 생체 내 폐 생리학을 복제하여 섬모를 뛰고 점액을 생성합니다. 섬모 기능은 환경 제어 챔버에서 고속 비디오 카메라를 사용하여 캡처됩니다. 사용자 정의 스크립트는 CBF 분석에 사용됩니다. CBF 측정을 클리닉으로 번역하는 것은 환자별로 CFTR 조절 약물에 대한 반응을 예측하는 데 중요한 임상 도구로 구상됩니다.

CBF를 정량화하는 데 있어 이 프로토콜의 효율성을 입증하기 위해, CF를 가진 3명의 참가자와 3명의 건강한 대조군 참가자로부터 유래된 기도 상피 세포 ALI 모델에서 측정된 CBF의 결과가 제시된다. 배양 분화 14일째에 박동섬모가 존재했습니다(그림 6). 배양 분화 14일째부터 21일째까지, 두 코호트 모두에서 통계적으로 유의한(P < 0.0345) CBF 증가가 관찰되었다. 배양 분화 21일차에...

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Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

이 프로토콜은 비강 상피 세포 수집, 확장 및 기관형 기도 상피 세포 모델로의 분화와 라이브 셀 이미징 및 맞춤형 스크립트를 통한 섬모 박동 빈도의 정량화를 설명합니다.

섬모 박동 빈도의 정량화를 위한 1차 인간 비강 상피 세포 모델의 수집, 확장 및 분화

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

우리는 코 점막에서기도 줄기 세포의 수집을 설명합니다. 이 세포는 실험실에서 유사층화된 상피로 확장되고 분화됩니다. 이것은 시험관 내 확장 및 분화이며, 이는 생체 내기도와 유사하며, 이는 섬모 박동 빈도를 정량화하는 데 사용할 수있는 섬모 세포와 같은 특수 세포가 있음을 의미합니다.서로 다른 개인과 다른 약물에 대한 반응으로 섬모 박동 빈도의 일관되고 재현 가능한 정량화를 가능하게 하기 위해 당사는 배양 조건과 이미지 획득을 표준화합니다. 섬모 박동 빈도 측정은 원발성 섬모 운동 이상증과 같은 질병의 임상 도구로 사용됩니다. 우리는 이것을 낭포 성 섬유증의 임상 마커로 확립하기를 희망합니다.이 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 박사 과정 학생 인 Katelin Allan과 Laura Fawcett과 내 연구실의 박사후 연구원 인 Sharon Wong 박사입니다. 참가자에게 입으로 숨을 쉬도록 요청하는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 주로 사용하는 손에 세포학 브러시를 잡고 참가자의 턱에 다섯 번째 숫자를 올려 손을 고정하고 세포학 브러시를 참가자의 비강에 참가자의 얼굴과 45도 각도로 삽입하고 비강 미트를 통과시킵니다.브러시를 똑바로 회전시켜 참가자의 얼굴에 수직이되도록 한 후 브러시가 하부 비갑개의 중간에서 뒤쪽 부분이 될 때까지 하비갑개 아래 코의 측면 벽에 대해 브러시를 부드럽지만 단단히 전진시킵니다. 브러시를 360도 최대 3 번 돌립니다. 그런 다음 부드럽게 제거하고 삽입 조작을 반대로 하여 셀이 브러시에서 빠지지 않도록 합니다.브러시를 비강 세포 수집 배지가 있는 준비된 수집 튜브에 넣고 수집 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 브러시에서 세포를 제거하기 위해 부드럽게 소용돌이 한 후 얼음 위의 수집 튜브를 생물 안전 캐비닛으로 다시 옮깁니다. 혈청 피펫을 사용하여 수집 튜브에서 새 튜브로 배지를 옮기고 세포학 브러시를 남깁니다.그런 다음 샘플을 원심 분리하십시오. 원심분리 후, 1밀리리터의 조건부 재프로그래밍 세포 배지에 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 그런 다음 5 밀리리터의 혈청 학적 피펫을 사용하여 50 밀리리터 튜브 위에 놓인 세포 체를 원형 운동으로 통과시킵니다.단일 세포 현탁액을 얻으려면 튜브 바닥에서 현탁액을 수집하고 체를 여러 번 통과시킵니다. 그런 다음 셀 체를 폐기하십시오. 기도 상피 세포를 준비된 투과성 지지체 삽입물에 시드하려면 기포를 생성하지 않고 세포를 잘 혼합하여 균질하고 현탁 상태인지 확인합니다.그런 다음 150 마이크로 리터의 세포 현탁액을 준비된 투과성 지지 삽입물의 정점 측에 추가합니다. 공기-액체 계면에서기도 상피 세포를 분화시키기 위해, 이들을 분화 또는 ALI 배지에서 2 일 동안 배양하십시오. 그런 다음 매체를 흡입하고 750마이크로리터의 ALI 배지를 기저 구획에만 추가하여 공기-액체 인터페이스를 만듭니다.ECM 돔에기도 상피 세포를 시드하려면 해리 된기도 상피 세포를 적절한 부피의 90 % ECM으로 재현탁하십시오. 이어서 피펫을 웰의 바닥에 최대한 가깝게 90도 각도로 수직으로 잡고 50 마이크로리터의 ECM 세포 현탁액을 웰의 중앙에 분배한다. ECM이 굳을 때까지 플레이트를 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.ECM이 응고되는 동안 기도 오가노이드 파종 매체(AOSM)를 실온으로 따뜻하게 하여 재액화 및 추가 시 ECM 돔의 붕괴를 방지합니다. 배양 후, 우물의 벽을 분배하여 500 마이크로 리터의 온난 된 AOSM을 각 웰에 첨가하십시오. 미디어를 ECM 돔에 직접 피펫팅하지 마십시오.4-7 일 동안 2 일마다 미디어를 교체하십시오. 미디어를 흡입하려면 플레이트를 45도 각도로 기울이고 ECM 돔에서 멀리 떨어진 우물의 하단 가장자리에서 흡인합니다. 4-7일 후, 500마이크로리터의 온난화된 기도 오가노이드 분화 배지(AODM)를 각 웰에 추가하여 오가노이드 분화를 시작하고 7일 동안 이틀마다 배지를 교체합니다.기도 상피 세포 모델을 포함하는 배양 플레이트를 현미경 플레이트 삽입물에 넣고, 현미경 환경 챔버를 닫는다. 샘플이 예열된 섭씨 37도, 5%이산화탄소로 채워진 현미경 챔버에서 30분 동안 평형을 이루도록 합니다. 현미경 접안 렌즈에서 세포 모델에 초점을 맞 춥니 다.그런 다음 획득 소프트웨어를 사용하여 L100을 클릭하여 광 경로를 카메라가 장착된 포트로 전환합니다. 녹색 재생 버튼을 클릭하여 소프트웨어를 통해 현미경 시야를 시각화합니다. 섬모에 초점이 맞춰져 있는지 확인하고 필요한 경우 조정하십시오.메뉴에서 타임랩스 이미지를 가져오려면 획득을 클릭한 다음 빠른 타임랩스를 클릭합니다. 팝업 창에서 저장 위치와 파일 이름을 선택하고 1, 000 프레임을 획득하십시오. 현미경 시야에서 섬모를 미리 보려면 적용을 클릭한 다음 녹색 재생 버튼을 클릭합니다.필요한 경우 Z 초점을 조정합니다. 그런 다음 지금 실행을 클릭하여 빠른 타임랩스를 캡처합니다. 필요한 소프트웨어 및 도구 상자를 설치한 후 적절한 사용자 지정 분석 스크립트와 지원 스크립트 폴더를 컴퓨터의 로컬 드라이브에 복사합니다.그런 다음 컴퓨팅 소프트웨어에서 홈 탭을 클릭 한 다음 경로 설정을 클릭하십시오. 팝업 창에서 하위 폴더와 함께 추가를 클릭합니다. MATLAB 검색 경로 아래에 표시된 폴더를 선택합니다.그런 다음 저장 후 닫기를 클릭하십시오. 분석 스크립트가 왼쪽 패널에 나타나는지 확인하여 컴퓨팅 소프트웨어에 연결되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 획득한 예제 원시 이미지 파일을 컴퓨터의 로컬 드라이브로 전송합니다.그런 다음 BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove 클릭하십시오. m 분석 스크립트 파일을 컴퓨팅 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다. 스크립트를 실행하려면 편집기 탭을 클릭한 다음 녹색 재생 버튼을 클릭합니다.표시되는 프롬프트 창에서 분석할 원시 이미지 파일을 선택합니다. 프레임당 획득 시간에 대한 노출 시간을 입력합니다. 그런 다음 확인을 클릭하십시오. GetFirstAmplitude를 실행합니다.m 스크립트를 AveSpectrum 파일이 포함된 폴더에 저장합니다. 스크립트가 FirstAmplitudeStacked를 출력할 때까지 기다립니다. XLSX 파일은 가장 높은 진폭 주파수를 포함하고기도 상피 섬모 박동의 생리적 범위 내에 있습니다.FirstAmplitudeStacked에서 주파수 값을 복사합니다. XLSX 파일을 열고 과학 분석 소프트웨어를 사용하여 플롯합니다. 낭포성 섬유증이 있는 3명의 참가자와 3명의 건강한 대조군 참가자로부터 유래된 기도 상피 세포 ALI 모델에서 측정된 섬모 박동 빈도의 결과가 제시됩니다.문화 분화 14 일째에는 섬모를 때리는 것이 존재했습니다. 배양 분화 21일째인 14일째부터, 섬모 박동 빈도의 통계적으로 유의한 증가는 코호트 간에 관찰되지 않았다. 배양 분화 21일차에 건강한 대조군 참가자의 평균 섬모 박동 빈도는 낭포성 섬유증 참가자의 빈도보다 유의하게 높았습니다.또한, 점액 제거 후 동일한 세포 모델에서 섬모 박동 빈도를 이미지화했을 때 건강한 개인과 낭포성 섬유증 환자 모두의 ALI 모델에서 점액을 제거했을 때 섬모 박동 빈도가 통계적으로 유의하게 증가했습니다. 섬모 기능은 환경 요인의 변화에 매우 민감하기 때문에 이미징 환경을 엄격하게 규제해야합니다. 이 플랫폼은 CFTR 기능을 조절하는 약물을 식별 할 수 있도록 환자 별 약물 스크리닝을 위해 구축 될 가능성이 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Collection Protocol for Human Pancreas

인간의 췌장을위한 컬렉션 프로토콜

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

연구

의학

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

정렬 줄기 세포 Assays 및 흐름에 대한 기본 뇌 종양 조직의 처리

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

인간의 전정 신경초종의 차 문화

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

마우스 경부 림프절의 고주파 초음파 이미징

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

비 강 및 기관지 체액의 흡수: 인간의 호흡기 점 막 및 실험실 처리 샘플의 정밀 샘플링

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

개별된 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 연구에 대 한 인간의 비 강 상피 세포 Spheroids의 생성

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...