Name: collection, expansion, and differentiation of primary human nasal epithelial cell models for quantification of cilia beat frequency
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency at JoVE.com

Vi takker studiedeltakerne og deres familier for deres bidrag. Vi setter pris på hjelpen fra Sydney Children's Hospitals (SCH) Randwick respiratorisk avdeling i organisering og innsamling av pasientbiospecimens - spesiell takk til Dr. John Widger, Dr. Yvonne Belessis, Leanne Plush, Amanda Thompson og Rhonda Bell. Vi anerkjenner assistansen fra Iveta Slapetova og Renee Whan fra Katharina Gaus Light Microscopy Facility i Wainwright Analytical Centre ved UNSW Sydney. Dette arbeidet støttes av National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), CF Foundation Australia og Sydney Children's Hospital Foundation. Forfatterne ønsker å anerkjenne Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health for sitt bidrag og støtte. Luminesce Alliance - Innovation for Children's Health er et non-profit samarbeidsprosjekt mellom Sydney Children's Hospitals Network, Children's Medical Research Institute og Children's Cancer Institute. Det er etablert med støtte fra NSW-regjeringen for å koordinere og integrere pediatrisk forskning. Luminesce Alliance er også tilknyttet University of Sydney og University of New South Wales Sydney. KMA støttes av et australsk regjeringsforskningsprogramstipend. LKF støttes av Rotary Club of Sydney Cove / Sydney Children's Hospital Foundation og UNSW University postgraduate award stipend.

Studiegodkjenning ble mottatt fra Sydney Children's Hospital Network Ethics Review Board (HREC/16/SCHN/120). Det ble innhentet skriftlig samtykke fra alle deltakere (eller deltakernes verge) før innsamling av biospecimens.
1. Forberedelser for etablering av luftveisepitelcellemodeller
<ol><li>Forbered nasal celle samling media ved å kombinere 80% Dulbecco's Modified Eagle Medium og 20% Fetal Bovine Serum. Supplement med 1 μL / ml Penicillin / Streptomycin. Oppbevares ved ...

<ol>
	<li>Barbato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ciliary+dyskinesia:+a+consensus+statement+on+diagnostic+and+treatment+approaches+in+children.">Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children.</a> European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).</li><li>Cutting, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+genetics:+from+molecular+understanding+to+clinical+application.">Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical application.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (1), 45-56 (2015).</li><li>Chioccioli, M., Feriani, L., Kotar, J., Bratcher, P. E., Cicuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotyping+ciliary+dynamics+and+coordination+in+response+to+CFTR-modulators+in+Cystic+Fibrosis+respiratory+epithelial+cells.">Phenotyping ciliary dynamics and coordination in response to CFTR-modulators in Cystic Fibrosis respiratory epithelial cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1763 (2019).</li><li>Hirst, R. A., Rutman, A., Williams, G., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliated+air-liquid+cultures+as+an+aid+to+diagnostic+testing+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Ciliated air-liquid cultures as an aid to diagnostic testing of primary ciliary dyskinesia.</a> Chest. 138 (6), 1441-1447 (2010).</li><li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia.">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).</li><li>Coles, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+culture+of+airway+epithelial+cells+as+a+diagnostic+tool+for+primary+ciliary+dyskinesia.">A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia.</a> Journal of Clinical Medicine. 9 (11), (2020).</li><li>Pifferi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+cell+culture+method+for+the+diagnosis+of+atypical+primary+ciliary+dyskinesia.">Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia.</a> Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).</li><li>Pifferi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+diagnosis+of+primary+ciliary+dyskinesia:+cell+culture+and+soft+computing+analysis.">Rapid diagnosis of primary ciliary dyskinesia: cell culture and soft computing analysis.</a> European Respiratory Journal. 41 (4), 960-965 (2013).</li><li>Lee, D. D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+throughput+drug+screening+for+rare+respiratory+diseases:+Readthrough+therapy+in+primary+ciliary+dyskinesia.">Higher throughput drug screening for rare respiratory diseases: Readthrough therapy in primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 58 (4), 2000455 (2021).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Dabrowski, M., Bukowy-Bieryllo, Z., Jackson, C. L., Zietkiewicz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+non-aminoglycoside+compounds+used+to+stimulate+translational+readthrough+of+PTC+mutations+in+primary+ciliary+dyskinesia.">Properties of non-aminoglycoside compounds used to stimulate translational readthrough of PTC mutations in primary ciliary dyskinesia.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), (2021).</li><li>Hirst, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+primary+ciliary+dyskinesia+epithelial+cells+at+air-liquid+interface+can+alter+ciliary+phenotype+but+remains+a+robust+and+informative+diagnostic+aid.">Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid.</a> PloS One. 9 (2), 89675 (2014).</li><li>Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+three-dimensional+explant+spheroids+derived+from+human+nasal+airway+epithelium:+a+simple+methodological+approach+for+ex+vivo+studies+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia.</a> Cilia. 6, 3 (2017).</li><li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging:+comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods.">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li><li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+cilia+and+ciliated+epithelial+ultrastructure+in+healthy+children+and+young+adults.">Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults.</a> Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).</li><li>Castillon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+and+associated+epithelial+proteins+during+the+regeneration+of+human+airway+surface+epithelium+in+three-dimensional+culture.">Polarized expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and associated epithelial proteins during the regeneration of human airway surface epithelium in three-dimensional culture.</a> Laboratory Investigation. 82 (8), 989-998 (2002).</li><li>Jorissen, M., Bessems, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+ciliary+beat+frequency+after+ciliogenesis+in+nasal+epithelial+cells+cultured+sequentially+as+monolayer+and+in+suspension.">Normal ciliary beat frequency after ciliogenesis in nasal epithelial cells cultured sequentially as monolayer and in suspension.</a> Acta Oto-Laryngologica. 115 (1), 66-70 (1995).</li><li>Conger, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+and+ciliary+beat+frequency+activation+by+the+CFTR+Modulators+Genistein,+VRT-532,+and+UCCF-152+in+primary+sinonasal+epithelial+cultures.">Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures.</a> JAMA Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).</li><li>Pique, N., De Servi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhinosectan((R))+spray+(containing+xyloglucan)+on+the+ciliary+function+of+the+nasal+respiratory+epithelium;+results+of+an+in+vitro+study.">Rhinosectan((R)) spray (containing xyloglucan) on the ciliary function of the nasal respiratory epithelium; results of an in vitro study.</a> Allergy, Asthma &amp; Clinical Immunology. 14, 41 (2018).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+antiviral+response+suppresses+ciliogenesis+and+motile+ciliary+functions+in+the+nasal+epithelium.">Host antiviral response suppresses ciliogenesis and motile ciliary functions in the nasal epithelium.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 581340 (2020).</li><li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells.">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).</li><li>Ballenger, J. J., Orr, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+human+ciliary+activity.">Quantitative measurement of human ciliary activity.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 72, 31-39 (1963).</li><li>Mercke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+varying+air+humidity+on+mucociliary+activity.">The influence of varying air humidity on mucociliary activity.</a> Acta Oto-Laryngologica. 79 (1-2), 133-139 (1975).</li><li>Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+airway+ciliary+beat+frequency+by+intracellular+pH.">Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH.</a> Journal of Physiology. 560, 519-532 (2004).</li><li>Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammalian+ciliary+beating.">Regulation of mammalian ciliary beating.</a> Annual Review of Physiology. 69, 401-422 (2007).</li><li>Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+functional+analysis:+Beating+a+path+towards+standardization.">Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization.</a> Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).</li><li>Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+ciliary+beat+pattern+in+three+different+beating+planes+in+healthy+subjects.">Variation of ciliary beat pattern in three different beating planes in healthy subjects.</a> Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).</li><li>Jackson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+of+diagnostic+testing+in+primary+ciliary+dyskinesia.">Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).</li><li>Feriani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+collective+dynamics+of+motile+cilia+in+cultures+of+human+airway+cells+by+multiscale+DDM.">Assessing the collective dynamics of motile cilia in cultures of human airway cells by multiscale DDM.</a> Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells.">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Martinovich, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+primary+airway+epithelial+cells+maintain+morphology,+lineage+and+disease+specific+functional+characteristics.">Conditionally reprogrammed primary airway epithelial cells maintain morphology, lineage and disease specific functional characteristics.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17971 (2017).</li><li>Wong, J. Y., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+the+ciliated+epithelium+following+acute+bronchiolitis+in+infancy.">Recovery of the ciliated epithelium following acute bronchiolitis in infancy.</a> Thorax. 60 (7), 582-587 (2005).</li><li>Gentzsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+rescue+of+conditionally+reprogrammed+cystic+fibrosis+bronchial+epithelial+cells.">Pharmacological rescue of conditionally reprogrammed cystic fibrosis bronchial epithelial cells.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (5), 568-574 (2017).</li><li>Sommer, J. U., Gross, S., Hormann, K., Stuck, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+changes+in+nasal+ciliary+beat+frequency.">Time-dependent changes in nasal ciliary beat frequency.</a> European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 267 (9), 1383-1387 (2010).</li><li>Ratjen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis.">Cystic fibrosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1, 15010 (2015).</li><li>Delmotte, P., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+frequency+is+maintained+at+a+maximal+rate+in+the+small+airways+of+mouse+lung+slices.">Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 110-117 (2006).</li><li>Smith, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooling+of+cilia+allows+functional+analysis+of+the+beat+pattern+for+diagnostic+testing.">Cooling of cilia allows functional analysis of the beat pattern for diagnostic testing.</a> Chest. 140 (1), 186-190 (2011).</li><li>Raidt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+beat+pattern+and+frequency+in+genetic+variants+of+primary+ciliary+dyskinesia.">Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia.</a> European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).</li></ol>

Det er flere faktorer som kan skjule kvantifiseringen av CBF i neseepitelark. Epitelark bør avbildes innen 3-9 timer etter prøvetaking siden ciliærfunksjonen er mest stabil i løpet av denne tiden37. Mindre røde blodlegemer og rusk er mest optimale for avbildning siden disse forstyrrer datainnsamlingen. Når du velger en ROI for avbildning, er det viktig å velge et epitelark som kanten ikke har blitt skadet eller forstyrret under innsamlingen av prøven, og ikke en eneste ufestet epitelcelle,...

Målinger av Cilia Beat Frequency (CBF) og mønster er etablert som diagnostiske verktøy for luftveissykdommer som primær ciliær dyskinesi (PCD)1. Ved cystisk fibrose (CF) forårsaker dysfunksjon av CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR)-kloridkanalen dehydrering av væsken på luftveisoverflaten og nedsatt slimclearance2. Ciliærfunksjonen er undersøkt in vitro i primære luftveiscellemodeller som en indikator på CFTR-kanalaktivitet3. Imidlertid eksisterer det betydelig pasient-til-pasient-variasjon i CBF som respons på CFTR-modulerende legemidler, selv for pasienter med de samme CFTR-mutasjonene 3. Videre er virkningen av dysfunksjonell CFTR-regulert kloridsekresjon på ciliær funksjon dårlig forstått. Det er for tiden ingen omfattende protokoll som demonstrerer prøvepreparering av in vitro luftveismodeller, bildeinnsamling og analyse av CBF.
Neseepitelark isolert fra neseslimhinnebørsting brukes direkte til målinger av ciliær funksjon for PCD-diagnose4. Likevel, mens det ikke er kontroll over størrelsen eller kvaliteten på neseepitelarkene som er oppnådd, varierer CBF avhengig av om det måles på enkeltceller eller celleark og på epitelark cilierte kanter som er forstyrret eller uforstyrret5. Som sådan kan sekundære dyskinesier forårsaket av skade på celler under samlingen av neseslimhinnebørster påvirke CBF. Primær cellekultur av neseepitelceller og deres differensiering ved luft-væskegrensesnitt (ALI) eller i tredimensjonal kjellermembranmatrise i cilierte luftveisepitelorganoider gir opphav til cilia som er fri for sekundære dyskinesier 4,6,7,8. Luftveisepitelceller differensiert ved ALI (heretter kalt ALI-modeller) har blitt ansett som et viktig sekundært diagnostisk hjelpemiddel som replikerer ciliary beat-mønstrene og frekvensen av ex vivo nasal mucosal brushings6 og muliggjør analyse av ciliær ultrastruktur, beatmønster og beatfrekvens samtidig som pasientspesifikke defekter opprettholdes9 . Likevel eksisterer det uoverensstemmelser i metodene som brukes til å lage disse pseudostratifiserte, mucociliary differensierte cellemodellene. Ulike kulturutvidelses- eller differensieringsprotokoller kan indusere distinkte epitelfenotyper (ciliert eller sekretorisk)10 og resultere i signifikante forskjeller i CBF11. CBF har blitt kvantifisert i neseepitelbørster 4,6,12,13,14,15,16, luftveisepitelorganoider 14,17,18 og ALI-modeller 3,4,6,13,19,20, 21. Likevel, blant disse protokollene, er det store variasjoner, og ofte er mange parametere ikke kontrollert for. For eksempel, i noen studier, er CBF avbildet in situ mens cellene i ALI-modellen forblir på den permeable støtteinnsatsen 3,19,20,21, mens andre skraper cellene fra den permeable støtteinnsatsen og avbilder dem suspendert i media 4,6,13.
Videre er den bredere anvendelsen av teknikker som måler ciliær funksjon begrenset av den ekstreme følsomheten til ciliær funksjon for endringer i miljøfaktorer. Miljøfaktorer som temperatur22, fuktighet 23,24 og pH 25,26 påvirker ciliærfunksjonen og må reguleres for å kvantifisere CBF nøyaktig. De ulike fysiologiske parametrene som brukes på tvers av ulike laboratorier og hvordan de påvirker CBF har blitt gjennomgått tidligere27.
Ulike bildeteknologier og tilnærminger til CBF-målinger er rapportert i litteraturen. For PCD-diagnostikk brukes videomikroskopi til å måle ciliær funksjon28,29. Nylig ble en videoanalysealgoritme basert på differensiell dynamisk mikroskopi brukt til å kvantifisere både CBF og cilia-koordinasjon i luftveisepitelcelle ALI-modeller 3,30. Denne metoden gjør det mulig å karakterisere ciliær juling i luftveisepitelceller på en rask og helautomatisk måte, uten behov for å segmentere eller velge regioner. Ulike metoder for avbildning og kvantifisering av CBF kan bidra til forskjeller rapportert i CBF i litteraturen (tilleggsfil 1).
En protokoll fra kultur til kvantifisering for å effektivisere eksisterende metoder, standardisering av kulturforhold og bildeoppkjøp, utført under strenge miljøkontrollerte forhold, vil muliggjøre konsistent, reproduserbar kvantifisering av CBF innenfor og mellom individer.
Denne protokollen gir en fullstendig beskrivelse av samlingen av epitelceller, ekspansjons- og differensieringskulturforhold og kvantifisering av CBF i tre forskjellige luftveisepitelcellemodellsystemer av nasal opprinnelse: 1) innfødte epitelark, 2) ALI-modeller avbildet på permeable støtteinnlegg og 3) Ekstracellulær matrise (ECM)-innebygde tredimensjonale organoider (figur 1 ). Neseepitelceller oppnådd fra nasal dårligere turbinatbørster brukes som representanter for luftveisepitelet siden de er et effektivt surrogat for bronkialepitelceller31 mens de overvinner den invasive prosedyren forbundet med å samle bronkial børster. Metoden Conditional Reprogramming Cell (CRC) brukes til å utvide primære luftveisepitelceller for opprettelse av ALI-modeller og tredimensjonale organoider. Betinget omprogrammering av luftveisepitelceller til stamcellelignende tilstand induseres av samkultur med vekstarrestert fibroblastmatercellesystem og Rho-assosiert kinase (ROCK) hemmer32. Det er viktig at CRC-metoden øker populasjonsdoblingen i luftveisepitelceller samtidig som de beholder sitt vevsspesifikke differensieringspotensial33,34. I alle luftveisepitelcellemodeller fanges ciliary-funksjonen i et temperaturkontrollert kammer ved hjelp av et høyhastighets videokamera med standardiserte bildeinnsamlingsinnstillinger. Spesialbygde skript brukes til kvantifisering av CBF.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63090/63090fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk arbeidsflyt. Etter børsting av deltakernes nasale nedre turbinat, brukes luftveisepitelceller på en av to måter. Enten isoleres luftveisepitelark, og cilia beat-frekvensen avbildes umiddelbart, eller luftveienes epitelceller utvides via den betingede omprogrammeringscellemetoden. CRC-ekspanderte luftveisepitelceller differensieres for å etablere luftveisepitelceller ved et luft-væskegrensesnitt eller luftveisepitelorganoidkulturer. Avbildning av ciliær beatfrekvens oppnås ved hjelp av et levende celleavbildningsmikroskop med et varme- og fuktighetsmiljøkammer og et raskt bildefrekvens (>100Hz) vitenskapelig kamera. Dataanalyse utføres ved hjelp av spesialbygde skript. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63090/63090fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2786</td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanyl-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8541</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor Zyla 4.2 sCMOS</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Fast frame rate (&#62;100 Hz) scientific camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceftazidime hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6987</td>
			<td>50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI S Plan Fluor ELWD 20XC</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td>MRH08230</td>
			<td>Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Gel Strainer 40 UM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431750</td>
			<td>Pore size 40 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Extracellular matrix (ECM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filter system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS431098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS432002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3470</td>
			<td>Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 &#956;m pore polyester membrane insert.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytology brushes</td>
			<td>McFarlane Medical</td>
			<td>33009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-Ham</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-Ham</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Live-cell imaging microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone (Amphotericin B)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>250 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Scientific analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Cryo.s vials</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3135</td>
			<td>Cryogenic vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HI-FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>3.6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator NL Ti2 BLACK 2000</td>
			<td>PeCon</td>
			<td></td>
			<td>Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td>2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L</td>
			<td>John Morris Group</td>
			<td>74220 706</td>
			<td>Bead bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Armor Beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1254302</td>
			<td>Thermal beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Computing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microscoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td>Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>10,000 units penicillin and 10&#160;mg streptomycin/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult Airway Organoid Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5060</td>
			<td>Airway Organoid Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-Ex Plus Medium</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureCol-S</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5015</td>
			<td>Type I Collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReagentPack Subculture Reagents</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhEGF (Epidermal Growth Factor, human)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td>25 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobramycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4014</td>
			<td>100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO Stage Top Incubator</td>
			<td>Okolab</td>
			<td></td>
			<td>Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection, expansion, and differentiation of primary human nasal epithelial cell models for quantification of cilia beat frequency

Målinger av flimmerhårfunksjon (slagfrekvens, mønster) er etablert som diagnostiske verktøy for luftveissykdommer som primær ciliær dyskinesi. Imidlertid er den bredere anvendelsen av disse teknikkene begrenset av den ekstreme følsomheten til ciliærfunksjonen for endringer i miljøfaktorer, for eksempel temperatur, fuktighet og pH. I luftveiene hos pasienter med cystisk fibrose (CF) hindrer slimakkumulering cilia-juling. Flimmerfunksjonen har blitt undersøkt i primære luftveiscellemodeller som en indikator på CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) kanalaktivitet. Imidlertid er det funnet betydelig pasient-til-pasient-variasjon i cilia-slagfrekvens som respons på CFTR-modulerende legemidler, selv for pasienter med de samme CFTR-mutasjonene . Videre er virkningen av dysfunksjonell CFTR-regulert kloridsekresjon på ciliær funksjon dårlig forstått. Det er for tiden ingen omfattende protokoll som demonstrerer prøvepreparering av in vitro luftveismodeller, bildeinnsamling og analyse av Cilia Beat Frequency (CBF). Standardiserte kulturforhold og bildeoppkjøp utført i en miljøkontrollert tilstand vil muliggjøre konsistent, reproduserbar kvantifisering av CBF mellom individer og som svar på CFTR-modulerende legemidler. Denne protokollen beskriver kvantifiseringen av CBF i tre forskjellige luftveisepitelcellemodellsystemer: 1) innfødte epitelark, 2) luft-væske-grensesnittmodeller avbildet på permeable støtteinnlegg, og 3) ekstracellulære matrise-innebygde tredimensjonale organoider. De to sistnevnte replikerer in vivo lungefysiologi, med slagcilia og produksjon av slim. Ciliary-funksjonen er fanget ved hjelp av et høyhastighets videokamera i et miljøstyrt kammer. Spesialbygde skript brukes til analyse av CBF. Oversettelse av CBF-målinger til klinikken er tenkt å være et viktig klinisk verktøy for å forutsi respons på CFTR-modulerende legemidler per pasient.

For å demonstrere effektiviteten av denne protokollen ved kvantifisering av CBF, presenteres resultatene av CBF målt i luftveisepitelcelle ALI-modeller avledet fra tre deltakere med CF og tre friske kontrolldeltakere. På dag 14 av kulturdifferensiering var det bankende flimmerhår til stede (figur 6). Fra dag 14 til 21 av kulturdifferensiering ble det observert en statistisk signifikant (P < 0,0345) økning i CBF i begge kohortene. På dag 21 av kulturdifferensiering var gjennomsnittlig C...

Watch this Scientific Journal Video about Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency at JoVE.com

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Denne protokollen beskriver nasal epitelcelleinnsamling, utvidelse og differensiering til organotypiske luftveisepitelcellemodeller og kvantifisering av cilia beat-frekvens via live-celleavbildning og spesialbygde skript.

Innsamling, utvidelse og differensiering av primære humane neseepitelcellemodeller for kvantifisering av cilia beat frekvens

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

Vi beskriver samlingen av luftveisstamceller fra neseslimhinnen. Disse cellene utvides og differensieres til et pseudostratifisert epitel i laboratoriet. Dette er in vitro ekspansjon og differensiering, som ligner på luftveiene våre in vivo, noe som betyr at det er spesialiserte celler, for eksempel cilierte celler, tilstede som kan brukes til å kvantifisere cilia beat frekvens.For å muliggjøre konsistent og reproduserbar kvantifisering av cilia beat-frekvens mellom forskjellige individer og som svar på forskjellige stoffer, standardiserer vi kulturforhold og bildeoppkjøp. Cilia beat frekvensmålinger brukes som kliniske verktøy ved sykdom som primær ciliær dyskinesi. Vi håper å etablere dette som en klinisk markør for cystisk fibrose.Demonstrere prosedyren er Katelin Allan og Laura Fawcett, doktorgradsstudenter fra laboratoriet mitt, og Dr.Sharon Wong, en postdoc fra laboratoriet mitt. Begynn med å be deltakeren om å puste gjennom munnen. Deretter tar du en cytologibørste i den dominerende hånden og hviler det femte sifferet på deltakerens hake for å forankre hånden, setter cytologibørsten inn i deltakerens nesepassasje i en 45-graders vinkel mot deltakerens ansikt, og passerer den gjennom nasal meatus.Etter å ha svingt børsten oppreist, slik at den er vinkelrett på deltakerens ansikt, avanserer børsten forsiktig, men fast, mot neseveggen under det nedre turbinatet til det er på midten til bakre del av det dårligere turbinatet. Roter børsten 360 grader opptil tre ganger. Fjern den deretter forsiktig, snu innsettingsmanøveren, slik at cellene ikke løsnes fra børsten.Plasser børsten i det forberedte oppsamlingsrøret med nasal celleoppsamlingsmedium, og legg oppsamlingsrøret på is. Etter forsiktig vortexing for å løsne celler fra børsten, overfør oppsamlingsrøret på is tilbake til biosikkerhetsskapet. Bruk en serologisk pipette til å overføre mediet fra oppsamlingsrøret til et nytt rør, og etterlate cytologibørstene.Sentrifuger deretter prøven. Etter sentrifugering, resuspender cellepelleten i en milliliter betinget omprogrammering av cellemedier. Deretter bruker du en fem milliliter serologisk pipette, passerer cellene gjennom en cellesikt plassert på toppen av et 50 milliliter rør i en sirkulær bevegelse.For å oppnå en enkeltcellesuspensjon, samle suspensjonen fra bunnen av røret, og pass den gjennom sikten flere ganger. Kast deretter cellesikten. For å frø luftveisepitelcellene på de forberedte permeable støtteinnsatsene, bland cellene godt uten å skape bobler, slik at de er homogene og i suspensjon.Tilsett deretter 150 mikroliter av cellesuspensjonen til den apikale siden av de forberedte permeable støtteinnsatsene. For å skille luftveisepitelceller ved luft-væske-grensesnittet, dyrk dem i differensiering eller ALI-medier i to dager. Deretter aspireres mediet, og tilsett 750 mikroliter ALI-medier bare til basalrommet for å skape et luft-væskegrensesnitt.For å frø luftveisepitelceller i ECM-kupler, resuspendere dissosierte luftveisepitelceller med riktig volum på 90% ECM. Hold deretter pipetten vertikalt i en 90-graders vinkel så nær bunnen av brønnen som mulig, dispenser 50 mikroliter ECM-cellesuspensjonen til midten av brønnen. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i 20 minutter til ECM stivner.Mens ECM stivner, varm luftveiene organoid såmedier, eller AOSM, til romtemperatur for å hindre at det forårsaker re-liquification, og oppløsning av ECM kuppelen ved tillegg. Etter inkubasjonen, tilsett 500 mikroliter oppvarmet AOSM til hver brønn ved å dispensere ned veggen av brønnen. Ikke pipettemedier direkte på ECM-kuppelen.Bytt media annenhver dag i fire til syv dager. For å aspirere mediet, vipp platen i en 45-graders vinkel og aspirer fra den nederste kanten av brønnen vekk fra ECM-kuppelen. Etter fire til syv dager, start organoid differensiering ved å legge til 500 mikroliter oppvarmet luftveisorganoid differensieringsmedium, eller AODM, til hver brønn, og bytt media annenhver dag i syv dager.Plasser kulturplaten som inneholder luftveisepitelcellemodellene i mikroskopplateinnsatsen, og lukk mikroskopets miljøkammer. La prøven balansere i det forvarmede, 37 grader Celsius, 5% karbondioksidfylte mikroskopkammeret i 30 minutter. Ved mikroskopokularet fokuserer du på cellemodellen.Deretter bruker du anskaffelsesprogramvaren, klikker du på L100 for å bytte lysbanen til porten der kameraet er montert. Klikk på den grønne Play-knappen for å visualisere mikroskopets synsfelt via programvaren. Kontroller at flimmerhårene er i fokus, og juster om nødvendig.For å hente time-lapse-bilder fra menyen, klikk på Skaff deg og deretter på Fast TimeLapse. I popup-vinduet velger du et lagringssted og filnavn, skaff deg 1.000 bilder. For å forhåndsvise flimmerhårene i mikroskopfeltet, klikk på Bruk, etterfulgt av den grønne Play-knappen.Juster Z-fokuset om nødvendig. Klikk deretter Kjør nå for å fange Fast TimeLapse. Når du har installert nødvendig programvare og verktøykasser, kopierer du de riktige egendefinerte analyseskriptene og mappen for støtteskript til den lokale stasjonen på datamaskinen.Deretter, på databehandlingsprogramvaren, klikker du på Hjem-fanen, etterfulgt av Angi bane. I popup-vinduet klikker du på Legg til med undermapper. Under MATLAB-søkebanen velger du mappen som vises.Klikk deretter på Lagre og lukk. Bekreft at analyseskriptene er koblet til dataprogramvaren ved å kontrollere at de vises i panelet til venstre. Deretter overfører du eksemplet med råbildefiler som er anskaffet, til datamaskinens lokale stasjon.Klikk deretter på BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. m analyse skriptfil i databehandling programvare. For å kjøre skriptet, klikk på Editor-fanen, etterfulgt av den grønne Play-knappen.I ledetekstvinduet som vises, velger du RAW-bildefilene som skal analyseres. Angi eksponeringstiden for anskaffelsestid per ramme. Klikk deretter på OK. Kjør GetFirstAmplitude.m script på mappen som inneholder AveSpectrum-filene. Vent til skriptet sender ut FirstAmplitudeStacked. XLSX-fil, som inneholder den høyeste amplitudefrekvensen, og er innenfor det fysiologiske området for luftveisepitelial cilia juling.Kopier frekvensverdiene fra FirstAmplitudeStacked. xlsx-fil, og plott dem ved hjelp av vitenskapelig analyseprogramvare. Resultatene av cilia beat frekvens målt i luftveisepitelcelle ALI-modeller avledet fra tre deltakere med cystisk fibrose og tre friske kontrolldeltakere presenteres.På dag 14 av kulturdifferensiering var det å slå flimmerhår. Fra dag 14, dag 21 av kulturdifferensiering, ble det ikke observert en statistisk signifikant økning i cilia beat frekvens mellom kohorter. På dag 21 av kulturdifferensiering var gjennomsnittlig cilia beat-frekvens for friske kontrolldeltakere signifikant høyere enn for deltakere med cystisk fibrose.Videre, når cilia beat frekvens ble avbildet i de samme cellemodellene etter fjerning av slim, var det en statistisk signifikant økning i cilia beat frekvens når slim ble fjernet i ALI-modeller av både friske individer og de med cystisk fibrose. Bildemiljøet må være strengt regulert, siden cilia-funksjonen er ekstremt utsatt for endringer i miljøfaktorer. Denne plattformen har potensial til å bli etablert for pasientspesifikk legemiddelscreening for å kunne identifisere legemidler som modulerer CFTR-funksjonen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Collection Protocol for Human Pancreas

Innsamling Protokoll for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Behandling av primær hjernesvulst Tissue for Stem Cell Assays og Flow Sortere

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolasjon, karakterisering og Comparative Differensiering av Human tannpulpa stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av to ulike metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse Imaging av Primary Preneoplastic mammary epitelceller Avledet fra genmodifisert mus modeller av Breast Cancer

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Primær Culture of Human Vestibulær schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolasjon, Kryopreservering og kultur menneskerettighets amnion Epitelceller for kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Høyfrekvente ultralydavbildning av Muse Cervical lymfeknuter

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolation and Culture Utvidelse av tumor-spesifikke endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Absorpsjon av nese og bronkial væsker: Precision prøvetaking av menneskelig luftveiene Mucosa og laboratoriet behandling av prøver

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Generering av menneskelig nese tarmepitelet Spheroids for individualisert cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator studie

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...