Name: live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

نود أن نشكر الدكتورة سيلفيا سودو والدكتورة جوليا فيديريتشي (وحدة الشبكات الخلوية والأهداف العلاجية الجزيئية ، معهد IRCCS-Regina Elena الوطني للسرطان ، روما ، إيطاليا) للوصول إلى نظام تصوير الخلايا الحية IncuCyte S3 في الإعداد الأولي لبروتوكول التصوير. علاوة على ذلك ، نشكر برناديت كولوزفاري على المشورة الفنية. تم دعم الدراسة من قبل منحة الأطفال المصابين بالسرطان في المملكة المتحدة (16-234) ووزارة الصحة الإيطالية Ricerca Corrente. إم فينشي هو زميل الأطفال المصابين بالسرطان في المملكة المتحدة. حصل R Ferretti على زمالة Fondazione Veronesi (2018 و 2019). يعترف المؤلفون بمؤسسة الشفاء لدعمها ومؤسسة مستشفى الأطفال لتمويل بنك أورام الأطفال في كوينزلاند.

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجان أخلاقيات البحوث البشرية في المؤسسات.
ملاحظة: تم إجراء هذه الدراسة باستخدام أداة تحليل الخلايا الحية Incucyte S3 و / أو SX5 (المشار إليها كأداة تحليل الخلايا الحية).
1. توليد كرويات الورم ذات الحجم المستنسخ
<p class="jo...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).</li><li>Magr&#236;, A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+early+metastatic+seeding+occur+in+colorectal+cancer.">Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Caretti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+spread+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).</li><li>Pericoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+multiple+platforms+for+the+analysis+of+multifluorescent+marking+technology+applied+to+pediatric+GBM+and+DIPG.">Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+and+cooperativity+between+subclonal+populations+of+pediatric+glioblastoma+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+cells.">Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).</li><li>Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lentiviral-inducible+transgene+expression+systems+and+versatile+single-plasmid+reporters+for+in+vitro+and+in+vivo+cancer+biology+studies.">Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).</li><li>Huang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-regulated+ROS+from+xanthine+oxidase+acts+as+an+early+effector+for+triggering+late+mitochondria-dependent+apoptosis+in+cathepsin+s-targeted+tumor+cells.">Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells.</a> PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).</li><li>Prudner, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+starvation+and+docetaxel+induce+c-Myc-driven+hENT1+surface+expression+to+overcome+gemcitabine+resistance+in+ASS1-negative+tumors.">Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).</li><li>Ferretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+invasion+into+Matrigel:+optimized+protocol+for+RNA+extraction.">Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction.</a> Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+role+of+CD44+in+cancer+progression:+therapeutic+implications.">The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 11 (1), 64 (2018).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).</li><li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).</li><li>Mount, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+antitumor+efficacy+of+anti-GD2+CAR+T+cells+in+H3-K27M.">Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M.</a> Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).</li><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+classification+of+tumors+of+the+central+nervous+system:+A+summary.">The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Czabanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+adhesion+molecule-C+mediates+the+recruitment+of+embryonic-endothelial+progenitor+cells+to+the+perivascular+niche+during+tumor+angiogenesis.">Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).</li><li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy.">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li><li>Pankov&#225;, K., R&#246;sel, D., Novotn&#253;, M., Br&#225;bek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+of+transition+between+mesenchymal+and+amoeboid+invasiveness+in+tumor+cells.">The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li></ol>

يمكن تكييف الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D التي اعتمدناها هنا لغزو DMG للأطفال والهجرة بسهولة أيضا لأنواع الخلايا السرطانية الأخرى شديدة التوغل ، بما في ذلك خطوط خلايا سرطان الثدي والقولون. 
تختلف عن فحوصات الكيمياء المناعية للخلايا الحية2D التي تم إجراؤها سابقا...

تعد قدرة الخلايا السرطانية على التهرب والانتشار عبر الأنسجة المحيطة سمة مميزة للسرطان1. على وجه الخصوص ، تعد حركة الخلايا السرطانية سمة مميزة للأورام الخبيثة ، سواء كانت نوعا من الورم النقيلي مثل الثدي2 أو سرطان القولون والمستقيم3 أو نوعا غازيا محليا مثل الورم الدبقيالمنتشر 4,5.
التصوير له دور مركزي في التحقيق في العديد من جوانب الأنماط الظاهرية للخلايا السرطانية. ومع ذلك ، يفضل بالتأكيد تصوير الخلايا الحية عند دراسة العمليات الخلوية الديناميكية مثل الهجرة والغزو ، عندما تحدث تغييرات في التشكل والتفاعل بين الخليةوالخلية 6,7 ويمكن فحصها بسهولة أكبر بمرور الوقت. بالنسبة لتصوير الخلايا الحية ، يمكن استخدام أنظمة مجهرية ضوئية مختلفة ، من تباين الطور إلى المجاهر الفلورية متحدة البؤر ، والحصول على الصور على مدى فترة زمنية قصيرة أو طويلة على مجهر مقلوب مجهز بغرفة للتحكم في درجة الحرارة و CO2 ، أو في أنظمة تحليل الصور عالية المحتوى التي تحتوي على غرف مدمجة ، أو بدلا من ذلك في أنظمة الصور التي يمكن أن تجلس في الحاضنة دون الحاجة إلى إزعاج الخلايا طوال المدة من التجربة. غالبا ما يتم تحديد اختيار النظام المستخدم من خلال عدد من العوامل مثل الدقة المطلوبة ، وطول وقت الاستحواذ الإجمالي والفترات الزمنية ، ونوع الوعاء المستخدم وإنتاجية الفحص (غرفة واحدة أو لوحة متعددة الآبار) ، وحساسية الخلايا المستخدمة (الخلايا الثمينة و / أو النادرة) والسمية الضوئية للخلايا في حالة وجود الفلوروفورات.
فيما يتعلق بالتصوير الفلوري في الوضع المباشر ، يمكن تحقيق ذلك عن طريق تحويل الخلايا للتعبير عن البروتينات الفلورية إما للتعبير المستقر أو كنظام محفز8 ، عن طريق نقل الخلايا العابرة ، أو باستخدام أصباغ الخلايا المتاحة الآن لوضع العلامات على الخلاياالحية 7 ، لتتبع الخلايا الحية وكذلك لوضع العلامات على العضيات تحت الخلوية9.
تم تطوير نهج مفيد مؤخرا للكيمياء المناعية للخلايا الحية ، حيث يمكن ربط الجسم المضاد الذي يتعرف على علامة السطح المفضلة بكاشف وضع العلامات ، وعند إضافة وسائط الثقافة ، يمكن تصوير الخلايا التي تعبر عن العلامة المحددة بسهولة في الوقت الفعلي عن طريق تصوير الخلايا الحية. يمكن تحقيق التصور والقياس الكمي لتعبير العلامة باستخدام مثل هذا النظام بسهولة عندما تنمو الخلايا في ظروف ثقافة ثنائية الأبعاد (2D)10.
في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين بروتوكولات غزو الكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد وهجرة الخلايا المشتقة من المريض للورم الدبقي المنتشر في خط الوسط (DMG)لدى الأطفال 11,12. DMG هي أورام دماغية شديدة العدوانية تؤثر على الأطفال ، بالنسبة للغالبية العظمى المرتبطة بطفرة المحرك K27M في متغيرات هيستون H3. تنشأ DMG في جذع الدماغ ومناطق خط الوسط في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتتميز بطبيعة تسلل للغاية. وقد ثبت أن هذه القدرة الغازية تتوسط جزئيا على الأقل عدم التجانس داخل الورم والسمات الشبيهة بجذع السرطان لخلايا DMG7.
لتوضيح مقايساتنا ، تم استخدام كاشف وضع العلامات على الأجسام المضادة (ALR) مع جسم مضاد ل CD44. CD44 هو بروتين سكري عبر الغشاء وجزيء الالتصاق يتم التعبير عنه على الخلايا الجذعية وأنواع الخلايا الأخرى ، المرتبطة بالنمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية وهجرة الخلايا السرطانية وغزوها13. تشمل البروتوكولات إعداد العينة ، والحصول على الصور في وضع برايت فيلد وفلورسنت ، والتحليل على أداة تحليل الخلايا الحية التي سمحت بالقياس الكمي في الوقت الفعلي للتعبير الكلي CD44 على غشاء خلية DMG أثناء الغزو والهجرة ثلاثية الأبعاد. سمحت المقايسات أيضا بإمكانية تصور إشارة الفلورسنت المتقطعة ل CD44 على الخلايا الفردية أثناء الهجرة والغزو. ومن المثير للاهتمام أنه لوحظ أيضا تأثير الجسم المضاد ل CD44 ، والذي يحتمل أن يكون بمثابة جسم مضاد مانع ، ويبدو أيضا أنه يقلل من هجرة الخلايا وغزوها بالإضافة إلى إحداث تحول في نمط الغزو من نمط ظاهري جماعي يشبه اللحمة المتوسطة إلى نمط ظاهري شبيه بالأميبويد أحادي الخلية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3056D</td>
			<td>solution for neurosphere dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Mv medical</td>
			<td>FFL16034</td>
			<td>cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-44 (156-3C11)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3570</td>
			<td>Mouse mAb IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>4743</td>
			<td>Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>-</td>
			<td>The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>any inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Green Background Suppressor Reagent</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>6500-0045</td>
			<td>Backgroung suppressor reagent (BSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor stem cell (TSM) medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>growth cell medium (see reference in the text for details)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>7007</td>
			<td>size 96 well, round bottom clear</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma

تعد هجرة الخلايا وغزوها من السمات المميزة للأورام الطافرة للورم الدبقي المنتشر في خط الوسط (DMG) H3K27M. لقد قمنا بالفعل بنمذجة هذه الميزات باستخدام فحوصات الغزو والهجرة ثلاثية الأبعاد (3D). في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين هذه المقايسات 3D للكيمياء المناعية للخلايا الحية. تم استخدام كاشف وضع العلامات على الأجسام المضادة للكشف في الوقت الفعلي عن تعبير جزيء الالتصاق CD44 ، على غشاء البلازما للخلايا المهاجرة والغازية لخط الخلايا الأساسي المشتق من المريض DMG H3K27M. يرتبط CD44 بالنمط الظاهري للخلايا الجذعية السرطانية وهجرة الخلايا السرطانية وغزوها ويشارك في التفاعلات المباشرة مع مصفوفة الجهاز العصبي المركزي (CNS) خارج الخلية. تم تضمين المجالات العصبية (NS) من خط خلية DMG H3K27M في مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM) أو وضعها على طبقة طلاء رقيقة من BMM ، في وجود جسم مضاد ل CD44 بالتزامن مع كاشف وسم الأجسام المضادة (ALR). تم إجراء تحليل صورة الكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد على أداة تحليل الخلايا الحية لقياس تعبير CD44 الكلي كميا ، وتحديدا على الخلايا المهاجرة والغازية. تسمح الطريقة أيضا بتصور التعبير المتقطع ل CD44 في الوقت الفعلي على غشاء البلازما للخلايا المهاجرة والغازية. علاوة على ذلك ، قدم الفحص أيضا رؤى جديدة حول الدور المحتمل ل CD44 في انتقال اللحمة المتوسطة إلى الأميبات في خلايا DMG H3K27M.

يتم تلخيص بروتوكول الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D للغزو والهجرة في سير عمل مباشر وقابل للتكرار في الشكل 1. من خلال زرع خلايا DMG في ألواح ULA 96-well ذات القاع المستدير ، يتم الحصول على NS ذات الحجم القابل للتكرار واستخدامها في الخطوات المعروضة. عندما تصل NS إلى الحجم المثالي ~ 300 ...

Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا للكيمياء المناعية للخلايا الحية ثلاثية الأبعاد المطبقة على خط خلايا الورم الدبقي المنتشر في خط الوسط للأطفال ، وهو مفيد لدراسة التعبير عن البروتينات على غشاء البلازما في الوقت الفعلي أثناء العمليات الديناميكية مثل غزو الخلايا ثلاثية الأبعاد والهجرة.

مقايسات الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D للورم الدبقي في خط الوسط المنتشر لدى الأطفال

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

الورم الدبقي في خط الوسط المنتشر هو ورم دماغي شديد التوغل. تساعد هذه الطريقة على دراسة كيفية هجرة خلايا DMG وغزوها في سياق 3D في الوقت الفعلي مع رؤى محددة حول الدور المحتمل لجزيء الالتصاق الرئيسي. باستخدام كاشف وضع العلامات وجسم مضاد محدد مضاد CD44 ، يمكننا أن ندرس عن طريق تصوير الخلايا الحية تعبير CD44 على غشاء البلازما على خلايا DMG أيضا في الهجرة والغزو ثلاثي الأبعاد.سلط تطبيق هذه التقنية الضوء على الدور المحتمل ل CD44 في حركة هذه الخلايا ، مما يشير إلى أنه يمكن أن يمثل هدفا جزيئيا قيما وغازيا. للبدء ، أعد ترطيب ALR بإضافة 100 ميكرولتر من الماء المعقم واخلط المحلول عن طريق الماصة. امزج الجسم المضاد مع ALR في وسط TSM في صفيحة مستديرة القاع متعددة الآبار أو في أنبوب كهرماني وقم بحمايته من الضوء.تحضير كمية كافية من الوسط لتوزيع 25 ميكرولتر لكل بئر بتركيز الفحص النهائي ثلاث مرات ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. تمييع BSR في وسط TSM بتركيز 1.5 مليمولار للحصول على تركيز نهائي قدره 0.5 مليمولار في نهاية الفحص. ثم قم بإزالة 75 ميكرولترا من الوسط برفق وببطء من كل بئر ، وتجنب لمس قاع البئر حيث يجلس NS والتحقق من وجود NS بصريا.أضف برفق 25 ميكرولترا من مركب الأجسام المضادة BSR و ALR إلى كل بئر واترك مركب الأجسام المضادة ALR يختلط مع الوسط لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. باستخدام مجهر مقلوب ، تأكد من أن كل NS يقع في موقع مركزي في قاع البئر. تجنب تشكيل الفقاعات عن طريق إزالتها باستخدام إبرة.ضع الطبق على الثلج لمدة خمس دقائق حتى يصبح قاع الطبق باردا. قم بتوزيع 75 ميكرولترا من BMM لكل بئر عن طريق وضع طرف P200 مبرد مسبقا على الجدار الداخلي للبئر ، وتجنب تكوين الفقاعات ولمس قاع البئر. اترك الطبق على الثلج لمدة خمس دقائق للسماح ل BMM بالاختلاط مع الوسط.باستخدام المجهر المقلوب ، تحقق من موقع NS. وإذا لم تكن موجودة مركزيا ، فإن جهاز الطرد المركزي للوحة عند أربع درجات مئوية عند 180 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم انقل اللوحة في أداة تحليل الخلايا الحية الموضوعة داخل الحاضنة المحددة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة. بمجرد طلاء الآبار ب BMM ، اقطع طرف P200.خذ 50 ميكرولترا من وسط الخلية و NS من كل بئر محدد وانقله إلى بئر قاع مسطح مطلي. تحقق من وجود وموضع NS في كل بئر بصريا. أضف برفق 50 ميكرولترا من الجسم المضاد BSR و ALR المخفف إلى كل بئر ، وانتظر لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق للسماح للكواشف بالاختلاط.وباستخدام مجهر مقلوب ، تأكد من أن معظم NS المكررة تقع في موقع مركزي في البئر. بعد التأكد من عدم وجود أي فقاعة ، انقل اللوحة برفق في أداة تحليل الخلايا الحية كما هو موضح سابقا. في برنامج أداة تحليل الخلايا الحية ، حدد جدول الخيار للحصول عليه ، ثم انقر فوق علامة التبويب علامة الجمع وحدد المسح الضوئي في الموعد المحدد لمسح اللوحات بفواصل زمنية كما هو مذكور في المخطوطة النصية.في نافذة البرنامج ، قم بإنشاء أو استعادة السفينة ثم انقر فوق الخيار جديد. حدد نوع المسح الكروي ، والمرحلة بالإضافة إلى الحقل الساطع ، وقنوات الصورة الخضراء لمقايسة الغزو ، وهدف 4X. حدد فحص استنساخ التخفيف ، واكتب هدف 4X ، والطور والأخضر لفحص الترحيل.حدد نوع اللوحة وحدد الآبار المراد مسحها ضوئيا عن طريق تمييزها على خريطة اللوحة ، ثم قم بإعداد تردد المسح. انقر فوق إضافة إلى الجدول الزمني وابدأ الفحص. حدد علامة التبويب إنشاء تعريف تحليل جديد.ثم حدد غزو كروي أو تطبيق محلل أساسي للغزو والترحيل على التوالي في علامة التبويب. حدد القنوات المناسبة للغزو والترحيل في قناة الصورة. حدد بعض الصور التمثيلية من ثلاثة إلى أربعة آبار لمعاينة إعداد التحليل وتحسينه.بالنسبة لفحص الغزو ، في علامة تبويب تعريف التحليل ، اضبط إعدادات التطبيق في القنوات الساطعة والخضراء مع الإعدادات المذكورة في مخطوطة النص لإنشاء تجزئة دقيقة بين الخلايا الكروية والغازية. لفحص الترحيل ، اضبط إعدادات التطبيق كما هو مذكور في مخطوطة النص في المرحلة والقنوات الخضراء لإنشاء تجزئة دقيقة بين التقاء الخلايا الخضراء. تحقق من صحة إعدادات التحليل ل NS بالنقر بشكل عشوائي على عدة آبار.حدد الآبار والنقاط الزمنية لتحليلها. احفظ تعريف التحليل وانقر فوق إنهاء. أظهرت الصور البؤرية الفلورية المناعية التمثيلية لتعبير CD44 في الخلايا الأولية المشتقة من المريض DMG دور CD44 في هجرة الخلايا وغزوها.تسمح الكيمياء المناعية للخلايا الحية 3D بتصور تعبير CD44. تظهر الإطارات التمثيلية للفاصل الزمني لكل من الهجرة والغزو وجود وغياب إشارة الفلورسنت الخضراء على نفس الخلية التي لوحظت بمرور الوقت ، مما يشير إلى أن تعبير CD44 يتم تشغيله وإيقافه أثناء هجرة الخلايا وغزوها. تتم متابعة عمليات الترحيل والغزو على مدار 96 ساعة ، وتظهر خلايا QCTB-R059 بمستوى عال من CD44.تم قياس القياس الكمي لتعبير CD44 وزيادته بمرور الوقت بواسطة إشارة التألق الخضراء الشاملة المرتبطة ب ALR لكل من الهجرة والغزو. عندما يتم استخدام الجسم المضاد ل CD44 على الخلايا الحية ، فإنه يؤثر على مورفولوجيا الخلية ، مما يؤدي إلى الانتقال من غزو يشبه اللحمة المتوسطة إلى غزو يشبه الأميبودية وتقليل القدرة الغازية والمهاجرة لهذه الخلايا. الخطوة الأكثر أهمية في هذه الطريقة هي خلط كاشف وضع العلامات مع جسم مضاد ، وإضافة المزيج إلى Matrigel والوسط ، والوصول إلى أداة تصوير الخلايا الحية.يمكن تنفيذ هذه الطريقة بشكل أكبر عن طريق استخدام اثنين أو أكثر من كواشف الملصقات المميزة والأجسام المضادة للتحقيق في تفاعل خلايا DMG بوساطة الخلايا المباشرة والاتصال. تقدم طريقتنا أدوات جديدة للتحقيق في 3D الآليات الخلوية والجزيئية للهجرة والغزو DMG ، مما يوفر اتجاهات جديدة لتثبيط النمط الظاهري التسلل.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

بروتوكول للثقافة السريع بعد الوفاة خلية من منتشر الجوهرية جسري بالورم الدبقي (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

زرع أورام الدماغ الزرد للأطفال في المضيفين ذوي الكفاءة المناعية لدراسة طويلة الأمد لسلوك الخلايا السرطانية واستجابة الأدوية

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

الجسم كله الحيوانات الأليفة/التصوير بالرنين المغناطيسي للأطفال المرضى: تفاصيل هذه المسألة

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

تحديد مستوى التعبير البروتين في الخلايا المستزرعة إيمونوسيتوتشيميستري في كتل الخلايا جزءا لا يتجزأ من البارافين

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

تقييم المؤشرات الحيوية في الدبقي التي Immunohistochemistry على الثقافات نيوروسفيري جزءا لا يتجزأ من البارافين الدبقي 3D

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

التصوير التحيئي الطولي لسلوك خلايا أورام الدماغ استجابة لخزعة جراحية غازية

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

في الوقت الحقيقي رصد الهجرة الخلية البشرية الورم علي العقدة الجذر الظهرية اكسون-اوليغوداندورونسيتي الثقافات المشتركة

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

مقايسات للتحقق من صحة مثبطات هيستون أسيتيل ترانسفيراز

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

سير عمل الفحص السريع لتحديد العلاج المركب المحتمل ل GBM باستخدام الخلايا الجذعية الدبقي المشتقة من المريض

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...