Name: live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Silvia Soddu og Dr. Giulia Federici (Unit of Cellular Networks and Molecular Therapeutic Targets, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rom, Italien) for adgang til IncuCyte S3 Live Cell Imaging System i den foreløbige opsætning af billeddannelsesprotokollen. Desuden takker vi Bernadett Kolozsvari for den tekniske rådgivning. Undersøgelsen blev støttet af Children with Cancer UK-tilskuddet (16-234) og det italienske sundhedsministerium Ricerca Corrente. M Vinci er en Børn med Cancer UK Fellow. R Ferretti er modtager af Fondazione Veronesi Fellowship (2018 og 2019). Forfatterne anerkender Fondazione Heal for deres støtte og Children's Hospital Foundation for finansiering af Queensland Children's Tumor Bank.

Denne protokol følger retningslinjerne fra institutionernes etiske komitéer for humant forskning.
BEMÆRK: Denne undersøgelse blev udført ved hjælp af Incucyte S3 og/eller SX5 Live-Cell Analysis Instrument (refereret som levende celleanalyseinstrument).
1. Generering af tumorsfæroider af reproducerbar størrelse
BEMÆRK: Protokollen (afsnit 1) beskrevet af Vinci et al. 2015 7,12<sup ...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).</li><li>Magr&#236;, A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+early+metastatic+seeding+occur+in+colorectal+cancer.">Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Caretti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+spread+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).</li><li>Pericoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+multiple+platforms+for+the+analysis+of+multifluorescent+marking+technology+applied+to+pediatric+GBM+and+DIPG.">Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+and+cooperativity+between+subclonal+populations+of+pediatric+glioblastoma+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+cells.">Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).</li><li>Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lentiviral-inducible+transgene+expression+systems+and+versatile+single-plasmid+reporters+for+in+vitro+and+in+vivo+cancer+biology+studies.">Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).</li><li>Huang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-regulated+ROS+from+xanthine+oxidase+acts+as+an+early+effector+for+triggering+late+mitochondria-dependent+apoptosis+in+cathepsin+s-targeted+tumor+cells.">Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells.</a> PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).</li><li>Prudner, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+starvation+and+docetaxel+induce+c-Myc-driven+hENT1+surface+expression+to+overcome+gemcitabine+resistance+in+ASS1-negative+tumors.">Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).</li><li>Ferretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+invasion+into+Matrigel:+optimized+protocol+for+RNA+extraction.">Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction.</a> Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+role+of+CD44+in+cancer+progression:+therapeutic+implications.">The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 11 (1), 64 (2018).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).</li><li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).</li><li>Mount, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+antitumor+efficacy+of+anti-GD2+CAR+T+cells+in+H3-K27M.">Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M.</a> Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).</li><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+classification+of+tumors+of+the+central+nervous+system:+A+summary.">The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Czabanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+adhesion+molecule-C+mediates+the+recruitment+of+embryonic-endothelial+progenitor+cells+to+the+perivascular+niche+during+tumor+angiogenesis.">Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).</li><li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy.">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li><li>Pankov&#225;, K., R&#246;sel, D., Novotn&#253;, M., Br&#225;bek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+of+transition+between+mesenchymal+and+amoeboid+invasiveness+in+tumor+cells.">The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li></ol>

Den levende 3D-celle immuncytokemi, vi har vedtaget her til pædiatrisk DMG invasion og migration, kunne let tilpasses også til andre meget invasive tumorcelletyper, herunder bryst- og tyktarmskræftcellelinjer. 
Forskellig fra tidligere udførte live-2D-celle immunocytokemiske assays10, når man arbejder i 3D, foreslås det at være opmærksom på nogle kritiske trin. Især til den invasionsanalyse, vi beskriver, anbefales det at tilføje ALR / antistofblandingen dire...

Tumorcellernes evne til at undvige og sprede sig gennem det omgivende væv er et kendetegn ved kræft1. Især tumorcellemotilitet er et karakteristisk træk ved maligne tumorer, uanset om det er en metastatisk tumortype såsom bryst2 eller kolorektal cancer3 eller en lokalt invasiv type såsom diffust gliom 4,5.
Billeddannelse har en central rolle i undersøgelsen af mange aspekter af tumorcellefænotyper; Imidlertid er levende cellebilleddannelse absolut at foretrække, når man studerer dynamiske cellulære processer som migration og invasion, når ændringer i morfologi og celle-celle-interaktion 6,7 forekommer og lettere kan undersøges over tid. Til levende cellebilleddannelse kan forskellige optiske mikroskopisystemer anvendes, fra fasekontrast til konfokale fluorescerende mikroskoper, og billedoptagelse udføres over en kort eller lang periode på et omvendt mikroskop udstyret med et kammer til temperatur og CO2 -kontrol eller i billedanalysesystemer med højt indhold, der har indbyggede kamre, eller alternativt i billedsystemer, der kan sidde i inkubatoren uden behov for at forstyrre cellerne under hele varigheden af eksperimentet. Valget af det anvendte system dikteres ofte af en række faktorer såsom nødvendig opløsning, længden af den samlede anskaffelsestid og tidsintervaller, anvendt beholdertype og analysens gennemstrømning (enkeltkammer eller multibrøndplade), følsomheden af de anvendte celler (ædle og/eller sjældne celler) og cellernes fototoksicitet, hvis fluoroforer er til stede.
Med hensyn til fluorescerende billeddannelse i levende tilstand kan dette opnås ved transducering af celler til ekspression af fluorescerende proteiner enten til stabil ekspression eller som et inducerbart system8, ved forbigående celletransfektion eller ved at bruge cellefarvestoffer, som nu er tilgængelige til mærkning af levende celler7, til sporing af levende celler samt til mærkning af subcellulære organeller9.
En nyttig tilgang er for nylig blevet udviklet til levende celleimmuncytokemi, hvor et antistof, der genkender en overflademarkør efter eget valg, kan bindes til et mærkningsreagens, og ud over kulturmediet kan celler, der udtrykker den specifikke markør, let afbildes i realtid ved levende cellebilleddannelse. Visualisering og kvantificering af markørekspression ved hjælp af et sådant system kan let opnås, når celler dyrkes i todimensionelle (2D) kulturbetingelser10.
I denne undersøgelse optimerede vi protokoller for live-3D-celle immuncytokemi invasion og migration af pædiatrisk diffust midline gliom (DMG) patientafledte celler11,12. DMG er meget aggressive hjernetumorer, der påvirker børn, for langt de fleste forbundet med drivermutationen K27M i histon H3-varianter. DMG opstår i hjernestammen og midterlinjeregionerne i centralnervesystemet (CNS) og er kendetegnet ved en meget infiltrativ karakter. Denne invasive kapacitet har vist sig at være i det mindste delvist medieret af intratumorheterogeniteten og de kræftstammelignende træk ved DMG-celler7.
For at eksemplificere vores analyser blev der anvendt et antistofmærkningsreagens (ALR) i kombination med et antistof mod CD44. CD44 er et transmembranglycoprotein og adhæsionsmolekyle udtrykt på stamceller og andre celletyper, forbundet med kræftstamcellefænotype og tumorcellemigration og invasion13. Protokollerne omfatter prøveforberedelsen, billedoptagelsen i brightfield og fluorescerende tilstand og analysen på et live-celleanalyseinstrument, der gjorde det muligt kvantitativt at måle i realtid det samlede CD44-udtryk på DMG-cellemembranen under 3D-invasion og migration. Assays tillod også muligheden for at visualisere det intermitterende fluorescerende signal fra CD44 på individuelle celler under migrering og invasion. Interessant nok blev der også observeret en effekt af anti-CD44-antistoffet, som potentielt fungerede som et blokerende antistof, også syntes at reducere cellemigration og invasion samt at fremkalde et skift af invasionsmønsteret fra en kollektiv mesenkymallignende til en mere enkeltcelle amoeboidlignende fænotype.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3056D</td>
			<td>solution for neurosphere dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Mv medical</td>
			<td>FFL16034</td>
			<td>cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-44 (156-3C11)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3570</td>
			<td>Mouse mAb IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>4743</td>
			<td>Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>-</td>
			<td>The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>any inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Green Background Suppressor Reagent</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>6500-0045</td>
			<td>Backgroung suppressor reagent (BSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor stem cell (TSM) medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>growth cell medium (see reference in the text for details)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>7007</td>
			<td>size 96 well, round bottom clear</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma

Cellemigration og invasion er specifikke kendetegn ved diffus midterliniegliom (DMG) H3K27M-mutante tumorer. Vi har allerede modelleret disse funktioner ved hjælp af tredimensionelle (3D) cellebaserede invasions- og migrationsanalyser. I denne undersøgelse har vi optimeret disse 3D-assays til levende celleimmuncytokemi. Et antistofmærkningsreagens blev brugt til i realtid at detektere ekspressionen af adhæsionsmolekylet CD44 på plasmamembranen i migrerende og invaderende celler i en DMG H3K27M primær patientafledt cellelinje. CD44 er forbundet med kræft stamcelle fænotype og tumorcelle migration og invasion og er involveret i de direkte interaktioner med centralnervesystemet (CNS) ekstracellulære matrix. Neurosfærer (NS) fra DMG H3K27M-cellelinjen blev indlejret i basalmembranmatrixen (BMM) eller anbragt på et tyndt belægningslag af BMM i nærvær af et anti-CD44-antistof i forbindelse med antistofmærkningsreagenset (ALR). Live-3D-celle immuncytokemi billedanalysen blev udført på et levende celleanalyseinstrument for kvantitativt at måle den samlede CD44-ekspression, specifikt på de migrerende og invaderende celler. Metoden tillader også visualisering i realtid af den intermitterende ekspression af CD44 på plasmamembranen i migrerende og invaderende celler. Desuden gav analysen også ny indsigt i CD44's potentielle rolle i den mesenkymale til amoeboide overgang i DMG H3K27M-celler.

Live-3D-celle immuncytokemi protokol for invasion og migration er opsummeret i en ligetil og reproducerbar arbejdsgang i figur 1. Ved såning af DMG-cellerne i ULA 96-brønds rundbundsplader opnås og anvendes NS i reproducerbar størrelse i de viste trin. Når NS har nået den ideelle størrelse på ~ 300 μm (ca. 4 dage efter såning), indledes invasionen12 og migration14 assays. Tilføjelsen af ALR / antistofkomplekset sammen med baggrundssu...

Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Denne undersøgelse præsenterer en protokol for live-3D-celleimmunocytokemi anvendt på en pædiatrisk diffus midterliniegliomcellelinje, nyttig til i realtid at studere ekspressionen af proteiner på plasmamembranen under dynamiske processer som 3D-celleinvasion og migration.

Live-3D-celle immuncytokemiske assays af pædiatrisk diffust midterliniegliom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Diffus midline gliom er en meget invasiv hjernetumor. Denne metode hjælper med at studere i realtid, hvordan DMG-celler migrerer og invaderer i en 3D-kontekst med specifik indsigt i den potentielle rolle af et nøglevedhæftningsmolekyle. Ved hjælp af et mærkningsreagens og et specifikt antistofanti-CD44 kan vi ved levende cellebilleddannelse studere ekspressionen af CD44 på plasmamembranen på DMG-cellerne også i 3D-migration og invasion.Anvendelsen af denne teknik som fremhævet den potentielle rolle CD44 i motiliteten af disse celler, hvilket tyder på, at det kunne repræsentere et værdifuldt og invasivt molekylært mål. Til at begynde med rehydreres ALR ved at tilsætte 100 mikroliter sterilt vand og blandes opløsningen ved pipettering. Bland antistoffet med ALR i TSM-mediet i en rundbundet multibrøndplade eller i et gult rør og beskyt det mod lys.Forbered tilstrækkelig mængde af mediet til at dispensere 25 mikroliter pr. Brønd ved tre gange den endelige analysekoncentration og inkuber derefter ved stuetemperatur i 15 minutter. Fortynd BSR i TSM-mediet ved 1,5 millimolær koncentration for at opnå en slutkoncentration på 0,5 millimolar ved afslutningen af assayet. Fjern derefter forsigtigt og langsomt 75 mikroliter af mediet fra hver brønd, undgå at røre bunden af brønden, hvor NS sidder, og kontroller tilstedeværelsen af NS visuelt.Tilsæt forsigtigt 25 mikroliter BSR- og ALR-antistofkomplekset til hver brønd, og lad ALR-antistofkomplekset blandes med mediet i to til tre minutter. Brug et omvendt mikroskop til at sikre, at hver NS er centralt placeret i bunden af brønden. Undgå dannelse af bobler ved at fjerne dem med en nål.Læg pladen på is i fem minutter for at lade bunden af pladen blive kold. Dispenser 75 mikroliter BMM pr. brønd ved at placere en forkølet P200-spids på brøndens indre væg, undgå bobledannelse og røre bunden af brønden. Lad pladen ligge på is i fem minutter for at lade BMM blande sig med mediet.Brug et omvendt mikroskop til at kontrollere placeringen af NS. Og hvis den ikke er til stede centralt, centrifugeres pladen ved fire grader Celsius ved 180 gange G i fem minutter. Overfør derefter pladen i det levende celleanalyseinstrument, der er placeret i inkubatoren, indstillet til 37 grader Celsius, 5% kuldioxid og 95% fugtighed. Når brøndene er belagt med BMM, skæres en P200-spids.Tag 50 mikroliter af cellemediet og NS fra hver valgt brønd og overfør den til en belagt fladbundet brønd. Kontroller tilstedeværelsen og placeringen af NS i hver brønd visuelt. Tilsæt forsigtigt 50 mikroliter af det fortyndede BSR- og ALR-antistof til hvert hul, og vent i to til tre minutter for at lade reagenserne blandes.Og ved hjælp af et omvendt mikroskop skal du sikre dig, at det meste af den replikerede NS er centralt placeret i brønden. Når du har sikret dig, at der ikke er nogen boble, overføres pladen forsigtigt i det levende celleanalyseinstrument som vist tidligere. På live-celleanalyseinstrumentsoftwaren skal du vælge den tidsplan, der skal anskaffes, derefter klikke på plusfanen og vælge scan efter planen for at scanne pladerne med intervaller som nævnt i tekstmanuskriptet.I softwarevinduet skal du oprette eller gendanne fartøj og derefter klikke på indstillingen Ny. Vælg sfærisk scanningstype, fase plus brightfield, grønne billedkanaler til invasionsanalysen og 4X målsætning. Vælg fortyndingskloningsscanning, type 4X-målsætning og fase og grøn til migreringsanalysen.Vælg pladetypen, og definer de brønde, der skal scannes, ved at fremhæve dem på pladekortet, og indstil derefter scanningsfrekvensen. Klik på Tilføj til tidsplan og start scanningen. Vælg fanen Opret ny analysedefinition.Vælg derefter sfærisk invasion eller grundlæggende analysatorapplikation til henholdsvis invasion og migration på fanen. Vælg de relevante kanaler for invasion og migrering i billedkanalen. Vælg nogle få repræsentative billeder fra tre til fire felter til visning og finjustering af analyseindstillingen.Til invasionsanalysen skal du under fanen Analysedefinition justere programindstillingerne i brightfield- og grønne kanaler med de indstillinger, der er nævnt i tekstmanuskriptet, for at generere en præcis segmentering mellem sfæroid- og invaderende celler. Til migreringsanalyse skal du justere applikationsindstillingerne som nævnt i tekstmanuskriptet i fase- og grønne kanaler for at generere en præcis segmentering mellem sammenløbet og grønne celler. Kontroller, at analyseindstillingerne er korrekte for NS ved at klikke tilfældigt på flere huller.Vælg de brønde og tidspunkter, der skal analyseres. Gem analysedefinitionen, og klik på Udfør. De repræsentative immunofluorescerende konfokale billeder af CD44-ekspression i primære DMG-patientafledte celler demonstrerede CD44's rolle i cellemigration og invasion.Den levende 3D-celleimmunkemi gør det muligt at visualisere CD44-ekspression. De repræsentative rammer for tidsforløbet for både migration og invasion viser tilstedeværelsen og fraværet af det grønne fluorescerende signal på den samme celle observeret over tid, hvilket tyder på, at ekspressionen af CD44 er tændt og slukket, mens celler migrerer og invaderer. Migrations- og invasionsprocesserne følges over 96 timer og viser QCTB-R059-celler med et højt niveau af CD44.Kvantificeringen af CD44-ekspression og dens stigning over tid blev målt ved det samlede grønne fluorescenssignal forbundet med ALR for både migration og invasion. Når anti-CD44-antistoffet anvendes på levende celler, påvirker det cellemorfologi, hvilket inducerer en overgang fra mesenkymallignende til amøbelignende invasion og en reduktion af disse cellers invasive og vandrende kapacitet. Det mest kritiske trin i metoden er blanding af mærkningsreagens med et antistof, tilsætning af blandingen til Matrigel og mediet og adgang til levende cellebilleddannelsesinstrumentet.Denne metode kan yderligere implementeres ved anvendelse af to eller flere karakteristiske mærkningsreagenser og antistoffer til at undersøge DMG-celleinteraktionen medieret af direkte celler og kontakt. Vores metode tilbyder nye værktøjer til i 3D at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer i DMG-migration og invasion, hvilket giver nye retninger til at hæmme deres infiltrative fænotype.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokol til Rapid Post-mortem Cell Culture af Diffus Intrinsic Pontine gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantation af zebrafisk-pædiatriske hjernetumorer til immunkompetente værter til langvarig undersøgelse af tumorcelleradfærd og lægemiddelrespons

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

Hele kroppen PET/MR-scanning af pædiatriske patienter: de oplysninger, der betyder noget

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Bestemmelse af Protein udtryk niveau i kulturperler celler ved immuncytokemi på Paraffin-embedded celle blokke

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Evaluering af biomarkører i gliom af Immunhistokemi på Paraffin-Embedded 3D gliom Neurosphere kulturer

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinel Intravital Imaging af hjerne tumor celle adfærd som reaktion på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Realtidsovervågning af menneskelige Glioma celle migration på dorsale root ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-kulturer

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Analyser til validering af Histone Acetyltransferase hæmmere

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

En hurtig screeningsarbejdsgang til identifikation af potentiel kombinationsbehandling for GBM ved hjælp af patientafledte gliomstamceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...