Name: live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

We willen Dr. Silvia Soddu en Dr. Giulia Federici (Unit of Cellular Networks and Molecular Therapeutic Targets, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rome, Italië) bedanken voor de toegang tot het IncuCyte S3 Live Cell Imaging System in de voorlopige opzet van het beeldvormingsprotocol. Bovendien danken we Bernadett Kolozsvari voor het technische advies. De studie werd ondersteund door de Children with Cancer UK-beurs (16-234) en het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid Ricerca Corrente. M Vinci is een Children with Cancer UK Fellow. R Ferretti is een ontvanger van de Fondazione Veronesi Fellowship (2018 en 2019). De auteurs erkennen Fondazione Heal voor hun steun en de Children's Hospital Foundation voor het financieren van de Queensland Children's Tumor Bank.

Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissies voor menselijk onderzoek van de instellingen.
OPMERKING: Deze studie werd uitgevoerd met behulp van Incucyte S3 en/of SX5 Live-Cell Analysis Instrument (aangeduid als live cell analysis instrument).
1. Generatie van reproduceerbare tumorsferoïden
OPMERKING: Het protocol (sectie 1) beschreven door Vinci et al. 2015 7,12, werd geb...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).</li><li>Magr&#236;, A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+early+metastatic+seeding+occur+in+colorectal+cancer.">Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Caretti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+spread+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).</li><li>Pericoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+multiple+platforms+for+the+analysis+of+multifluorescent+marking+technology+applied+to+pediatric+GBM+and+DIPG.">Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+and+cooperativity+between+subclonal+populations+of+pediatric+glioblastoma+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+cells.">Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).</li><li>Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lentiviral-inducible+transgene+expression+systems+and+versatile+single-plasmid+reporters+for+in+vitro+and+in+vivo+cancer+biology+studies.">Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).</li><li>Huang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-regulated+ROS+from+xanthine+oxidase+acts+as+an+early+effector+for+triggering+late+mitochondria-dependent+apoptosis+in+cathepsin+s-targeted+tumor+cells.">Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells.</a> PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).</li><li>Prudner, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+starvation+and+docetaxel+induce+c-Myc-driven+hENT1+surface+expression+to+overcome+gemcitabine+resistance+in+ASS1-negative+tumors.">Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).</li><li>Ferretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+invasion+into+Matrigel:+optimized+protocol+for+RNA+extraction.">Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction.</a> Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+role+of+CD44+in+cancer+progression:+therapeutic+implications.">The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 11 (1), 64 (2018).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).</li><li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).</li><li>Mount, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+antitumor+efficacy+of+anti-GD2+CAR+T+cells+in+H3-K27M.">Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M.</a> Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).</li><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+classification+of+tumors+of+the+central+nervous+system:+A+summary.">The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Czabanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+adhesion+molecule-C+mediates+the+recruitment+of+embryonic-endothelial+progenitor+cells+to+the+perivascular+niche+during+tumor+angiogenesis.">Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).</li><li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy.">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li><li>Pankov&#225;, K., R&#246;sel, D., Novotn&#253;, M., Br&#225;bek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+of+transition+between+mesenchymal+and+amoeboid+invasiveness+in+tumor+cells.">The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li></ol>

De live-3D-cel immunocytochemie die we hier hebben aangenomen voor pediatrische DMG-invasie en migratie kan gemakkelijk worden aangepast, ook voor andere zeer invasieve tumorceltypen, waaronder borst- en darmkankercellijnen. 
Anders dan eerder uitgevoerde live-2D-cel immunocytochemie assays10, wordt bij het werken in 3D voorgesteld om aandacht te besteden aan enkele kritieke stappen. In het bijzonder wordt voor de invasietest die we beschrijven, geadviseerd om de ALR / ...

Het vermogen van tumorcellen om te ontwijken en zich te verspreiden door het omliggende weefsel is een kenmerk van kanker1. In het bijzonder is tumorcelmotiliteit een kenmerkend kenmerk van kwaadaardige tumoren, of het nu gaat om een gemetastaseerd tumortype zoals borst2 of colorectale kanker3 of een lokaal invasief type zoals diffuus glioom 4,5.
Beeldvorming speelt een centrale rol in het onderzoek naar vele aspecten van tumorcelfenotypen; Live-cell imaging heeft echter zeker de voorkeur bij het bestuderen van dynamische cellulaire processen zoals migratie en invasie, wanneer veranderingen in morfologie en cel-celinteractie 6,7 optreden en in de loop van de tijd gemakkelijker kunnen worden onderzocht. Voor live-cell imaging kunnen verschillende optische microscopiesystemen worden gebruikt, van fasecontrast tot confocale fluorescerende microscopen, en beeldacquisitie uitgevoerd over een korte of lange periode op een omgekeerde microscoop uitgerust met een kamer voor temperatuur- en CO2-regeling, of in high-content beeldanalysesystemen met ingebouwde kamers, of als alternatief in beeldsystemen die in de incubator kunnen zitten zonder de cellen gedurende de hele duur te hoeven verstoren van het experiment. De keuze van het gebruikte systeem wordt vaak bepaald door een aantal factoren, zoals de benodigde resolutie, de lengte van de totale acquisitietijd en tijdsintervallen, het gebruikte vattype en de doorvoer van de test (enkele kamer of multi-well plaat), de gevoeligheid van de gebruikte cellen (kostbare en / of zeldzame cellen) en fototoxiciteit van de cellen als fluoroforen aanwezig zijn.
Met betrekking tot fluorescerende beeldvorming in live-modus kan dit worden bereikt door cellen te transduceren voor de expressie van fluorescerende eiwitten, hetzij voor stabiele expressie of als een induceerbaar systeem8, door transiënte celtransfectie, of door celkleurstoffen te gebruiken die nu beschikbaar zijn voor live-cell labeling7, voor live-cell tracking en voor het labelen van subcellulaire organellen9.
Een nuttige benadering is onlangs ontwikkeld voor live-cell immunocytochemie, waarbij een antilichaam dat een oppervlaktemarker naar keuze herkent, kan worden gebonden aan een etiketteringsreagens, en na toevoeging aan de kweekmedia kunnen cellen die de specifieke marker tot expressie brengen gemakkelijk in realtime worden afgebeeld door live-cell imaging. De visualisatie en kwantificering van markerexpressie met behulp van een dergelijk systeem kan gemakkelijk worden bereikt wanneer cellen worden gekweekt in tweedimensionale (2D) cultuuromstandigheden10.
In deze studie hebben we protocollen geoptimaliseerd voor live-3D-cel immunocytochemische invasie en migratie van pediatrische diffuse midline glioma (DMG) patiënt-afgeleide cellen11,12. DMG zijn zeer agressieve hersentumoren die kinderen treffen, voor de overgrote meerderheid geassocieerd met de drivermutatie K27M in histon H3-varianten. DMG ontstaat in de hersenstam en de middellijngebieden van het centrale zenuwstelsel (CZS) en wordt gekenmerkt door een zeer infiltratief karakter. Van deze invasieve capaciteit is aangetoond dat deze ten minste gedeeltelijk wordt gemedieerd door de intratumor heterogeniteit en de kankerstamachtige kenmerken van DMG-cellen7.
Om onze testen te illustreren, werd een antilichaamlabelreagens (ALR) gebruikt in combinatie met een antilichaam voor CD44. CD44 is een transmembraan glycoproteïne en adhesiemolecuul uitgedrukt op stamcel- en andere celtypen, geassocieerd met kankerstamcelfenotype en tumorcelmigratie en invasie13. De protocollen omvatten de monstervoorbereiding, de beeldacquisitie in brightfield- en fluorescerende modus en de analyse op een live-cell analyse-instrument dat het mogelijk maakte om kwantitatief in realtime de algehele CD44-expressie op het DMG-celmembraan te meten tijdens 3D-invasie en migratie. De testen maakten het ook mogelijk om het intermitterende fluorescerende signaal van CD44 op individuele cellen te visualiseren tijdens het migreren en binnendringen. Interessant is dat ook een effect van het anti-CD44-antilichaam werd waargenomen, dat mogelijk als een blokkerend antilichaam fungeerde, ook de celmigratie en invasie leek te verminderen en een omschakeling van het invasiepatroon van een collectief mesenchymaal-achtig naar een meer eencellig amoeboïde-achtig fenotype induceerde.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3056D</td>
			<td>solution for neurosphere dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Mv medical</td>
			<td>FFL16034</td>
			<td>cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-44 (156-3C11)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3570</td>
			<td>Mouse mAb IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>4743</td>
			<td>Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>-</td>
			<td>The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>any inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Green Background Suppressor Reagent</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>6500-0045</td>
			<td>Backgroung suppressor reagent (BSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor stem cell (TSM) medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>growth cell medium (see reference in the text for details)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>7007</td>
			<td>size 96 well, round bottom clear</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma

Celmigratie en invasie zijn specifieke kenmerken van Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutante tumoren. We hebben deze functies al gemodelleerd met behulp van driedimensionale (3D) celgebaseerde invasie- en migratietests. In deze studie hebben we deze 3D-assays geoptimaliseerd voor live-cell immunocytochemie. Een antilichaamlabelreagens werd gebruikt om in realtime de expressie van het adhesiemolecuul CD44 te detecteren, op het plasmamembraan van migrerende en binnendringende cellen van een DMG H3K27M primaire patiënt-afgeleide cellijn. CD44 is geassocieerd met kankerstamcelfenotype en tumorcelmigratie en -invasie en is betrokken bij de directe interacties met de extracellulaire matrix van het centrale zenuwstelsel (CZS). Neurosferen (NS) uit de DMG H3K27M-cellijn werden ingebed in de basale membraanmatrix (BMM) of geplaatst op een dunne coatinglaag van BMM, in aanwezigheid van een anti-CD44-antilichaam in combinatie met het antilichaametiketteringsreagens (ALR). De live-3D-cell immunocytochemische beeldanalyse werd uitgevoerd op een live-cell analyse-instrument om de totale CD44-expressie kwantitatief te meten, specifiek op de migrerende en binnendringende cellen. De methode maakt het ook mogelijk om in real-time de intermitterende expressie van CD44 op het plasmamembraan van migrerende en binnendringende cellen te visualiseren. Bovendien leverde de test ook nieuwe inzichten op in de potentiële rol van CD44 in de mesenchymale naar amoeboïde overgang in DMG H3K27M-cellen.

Live-3D-Cell Immunocytochemistry protocol voor invasie en migratie is samengevat in een eenvoudige en reproduceerbare workflow in figuur 1. Door de DMG-cellen in ULA 96-well rondebodemplaten te zaaien, worden reproduceerbare NS-groottes verkregen en gebruikt in de weergegeven stappen. Wanneer de NS de ideale grootte van ~300 μm hebben bereikt (ongeveer 4 dagen na het zaaien) worden de invasie12 en migratie14 testen gestart. De toevoeging van h...

Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Deze studie presenteert een protocol van live-3D-cel immunocytochemie toegepast op een pediatrische diffuse midline glioom cellijnlijn, nuttig om in real-time de expressie van eiwitten op het plasmamembraan te bestuderen tijdens dynamische processen zoals 3D-celinvasie en migratie.

Live-3D-cel immunocytochemie Assays van pediatrische diffuse middellijn glioom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Diffuus midline glioom is een zeer invasieve hersentumor. Deze methode helpt om in realtime te bestuderen hoe DMG-cellen migreren en binnendringen in een 3D-context met specifieke inzichten over de potentiële rol van een sleuteladhesiemolecuul. Door gebruik te maken van een etiketteringsreagens en een specifiek antilichaam anti-CD44, kunnen we door middel van live cell imaging de expressie van CD44 op plasmamembraan op de DMG-cellen bestuderen, ook in 3D-migratie en invasie.De toepassing van deze techniek benadrukte de potentiële rol van CD44 in de beweeglijkheid van deze cellen, wat suggereert dat het een waardevol en invasief moleculair doelwit zou kunnen vertegenwoordigen. Om te beginnen, rehydrateer de ALR door 100 microliter steriel water toe te voegen en meng de oplossing door pipetteren. Meng het antilichaam met de ALR in het TSM-medium in een multi-well plaat met ronde bodem of in een amberkleurige buis en bescherm het tegen licht.Bereid voldoende hoeveelheid van het medium voor om 25 microliter per put af te geven bij driemaal de uiteindelijke testconcentratie en incubeer vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verdun BSR in het TSM-medium met een concentratie van 1,5 millimol om aan het einde van de test een eindconcentratie van 0,5 millimol te verkrijgen. Verwijder vervolgens voorzichtig en langzaam 75 microliter van het medium uit elke put, vermijd het aanraken van de bodem van de put waar de NS zit en controleer de aanwezigheid van de NS visueel.Voeg voorzichtig 25 microliter van het BSR- en ALR-antilichaamcomplex toe aan elke put en laat het ALR-antilichaamcomplex gedurende twee tot drie minuten mengen met het medium. Zorg er met een omgekeerde microscoop voor dat elke NS centraal op de bodem van de put staat. Vermijd de vorming van bubbels door ze met een naald te verwijderen.Leg de plaat vijf minuten op ijs om de bodem van de plaat koud te laten worden. Doseer 75 microliter BMM per put door een voorgekoelde P200-punt op de binnenwand van de put te plaatsen, waardoor bubbelvorming wordt vermeden en de bodem van de put wordt aangeraakt. Laat de plaat vijf minuten op het ijs staan om de BMM te laten mengen met het medium.Controleer met een omgekeerde microscoop de locatie van NS. En als het niet centraal aanwezig is, centrifugeer de plaat dan vijf minuten bij vier graden Celsius bij 180 keer G. Breng vervolgens de plaat over in het analyse-instrument voor levende cellen dat in de incubator is geplaatst op 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 95% vochtigheid. Zodra de putten zijn gecoat met BMM, snijdt u een P200-punt.Neem 50 microliter van het celmedium en NS uit elke geselecteerde put en breng deze over naar een gecoate platte bodemput. Controleer de aanwezigheid en de positie van de NS in elke put visueel. Voeg voorzichtig 50 microliter van het verdunde BSR- en ALR-antilichaam toe aan elk putje en wacht twee tot drie minuten om de reagentia te laten mengen.En zorg er met behulp van een omgekeerde microscoop voor dat de meeste replicerende NS centraal in de put staan. Nadat u de afwezigheid van een bel hebt gecontroleerd, brengt u de plaat voorzichtig over in het analyse-instrument voor levende cellen, zoals eerder is aangetoond. Selecteer in de software voor livecelanalyse-instrumenten het optieschema dat u wilt verkrijgen, klik vervolgens op het plustabblad en selecteer scannen op schema om de platen te scannen met intervallen zoals vermeld in het tekstmanuscript.Maak of herstel in het softwarevenster het schip en klik vervolgens op de optie Nieuw. Selecteer het sferoïde scantype, fase plus brightfield, groene beeldkanalen voor de invasietest en 4X-doelstelling. Selecteer verdunningskloonscan, type 4X-doelstelling en fase en groen voor de migratietest.Selecteer het plaattype en definieer de te scannen putten door ze te markeren op de plaatkaart en stel vervolgens de scanfrequentie in. Klik op Toevoegen aan schema en start de scan. Selecteer het tabblad Nieuwe analysedefinitie maken.Selecteer vervolgens sferoïde invasie of basisanalysatortoepassing voor respectievelijk invasie en migratie op het tabblad. Selecteer de juiste invasie- en migratiekanalen in het afbeeldingskanaal. Selecteer een paar representatieve afbeeldingen van drie tot vier putten om een voorbeeld te bekijken en de analyse-instelling te verfijnen.Voor de invasietest past u op het tabblad analysedefinitie de toepassingsinstellingen in de heldere en groene kanalen aan met de instellingen die in het tekstmanuscript worden vermeld om een nauwkeurige segmentatie tussen de sferoïde en binnendringende cellen te genereren. Voor migratietest past u de toepassingsinstellingen aan zoals vermeld in het tekstmanuscript in de fase- en groene kanalen om een nauwkeurige segmentatie tussen de samenvloeiing en groene cellen te genereren. Controleer of de analyse-instellingen correct zijn voor de NS door willekeurig op meerdere putten te klikken.Selecteer de putten en tijdpunten die u wilt analyseren. Sla de analysedefinitie op en klik op Voltooien. De representatieve immunofluorescente confocale beelden van CD44-expressie in primaire DMG-patiënt-afgeleide cellen toonden de rol van CD44 in celmigratie en invasie.De live 3D-celimmunochemie maakt het mogelijk om CD44-expressie te visualiseren. De representatieve frames van het tijdsverloop voor zowel migratie als invasie tonen de aan- en afwezigheid van het groene fluorescerende signaal op dezelfde cel dat in de loop van de tijd wordt waargenomen, wat suggereert dat de expressie van CD44 aan en uit is terwijl cellen migreren en binnendringen. De migratie- en invasieprocessen worden gedurende 96 uur gevolgd, waarbij QCTB-R059-cellen met een hoog CD44-niveau worden getoond.De kwantificering van CD44-expressie en de toename ervan in de loop van de tijd werd gemeten door het totale groene fluorescentiesignaal geassocieerd met de ALR voor zowel migratie als invasie. Wanneer het anti-CD44-antilichaam op levende cellen wordt gebruikt, beïnvloedt het de celmorfologie, waardoor een overgang van mesenchymale-achtige naar amoeboïde-achtige invasie en een vermindering van de invasieve en migrerende capaciteit van deze cellen wordt geïnduceerd. De meest kritische stap van de methode zijn het mengen van etiketteringsreagens met een antilichaam, de toevoeging van het mengsel aan de Matrigel en van het medium, en toegang tot het instrument voor beeldvorming van levende cellen.Deze methode kan verder worden geïmplementeerd door het gebruik van twee of meer onderscheidende etiketteringsreagentia en antilichamen om de DMG-celinteractie gemedieerd door directe cellen en contact te onderzoeken. Onze methode biedt nieuwe hulpmiddelen om in 3D de cellulaire en moleculaire mechanismen van DMG-migratie en -invasie te onderzoeken en biedt nieuwe richtingen voor het remmen van hun infiltratieve fenotype.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantatie van zebravis-pediatrische hersentumoren in immuungecompetente gastheren voor langdurige studie van tumorcellen gedrag en drugrespons

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

Whole-body PET/MRI van pediatrische patiënten: de Details die er toe

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Bepaling van eiwit expressie niveau in gekweekte cellen door immunocytochemie op cel paraffine-ingebedde blokken

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Evaluatie van Biomarkers in Glioma door Immunohistochemistry op 3D Glioma paraffine-ingebedde Neurosphere culturen

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinale Intravital beeldvorming van hersen tumor Celgedrag in reactie op een invasieve chirurgische biopsie

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Real-time monitoring van menselijke Glioom Celmigratie op Rugwortel ganglion axon-oligodendrocyte co-culturen

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Assays voor het valideren van Histon Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...