Name: live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
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Nous tenons à remercier la Dre Silvia Soddu et la Dre Giulia Federici (Unité des réseaux cellulaires et des cibles thérapeutiques moléculaires, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rome, Italie) pour leur accès au système d’imagerie des cellules vivantes IncuCyte S3 dans la mise en place préliminaire du protocole d’imagerie. De plus, nous remercions Bernadett Kolozsvari pour ses conseils techniques. L’étude a été financée par la subvention Children with Cancer UK (16-234) et le ministère italien de la Santé, Ricerca Corrente. M Vinci est membre de Children with Cancer UK. R Ferretti est récipiendaire de la bourse de la Fondazione Veronesi (2018 et 2019). Les auteurs remercient la Fondazione Heal pour son soutien et la Children’s Hospital Foundation pour le financement de la Queensland Children’s Tumor Bank.

Ce protocole suit les lignes directrices des comités d’éthique de la recherche sur des sujets humains des établissements.
REMARQUE : Cette étude a été réalisée à l’aide de l’instrument d’analyse de cellules vivantes Incucyte S3 et/ou SX5 (référencé comme instrument d’analyse de cellules vivantes).
1. Génération de sphéroïdes tumoraux de taille reproductible
NOTE: Le protocole (section 1) décrit pa...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).</li><li>Magr&#236;, A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+early+metastatic+seeding+occur+in+colorectal+cancer.">Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Caretti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+spread+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).</li><li>Pericoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+multiple+platforms+for+the+analysis+of+multifluorescent+marking+technology+applied+to+pediatric+GBM+and+DIPG.">Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+and+cooperativity+between+subclonal+populations+of+pediatric+glioblastoma+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+cells.">Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).</li><li>Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lentiviral-inducible+transgene+expression+systems+and+versatile+single-plasmid+reporters+for+in+vitro+and+in+vivo+cancer+biology+studies.">Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).</li><li>Huang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-regulated+ROS+from+xanthine+oxidase+acts+as+an+early+effector+for+triggering+late+mitochondria-dependent+apoptosis+in+cathepsin+s-targeted+tumor+cells.">Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells.</a> PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).</li><li>Prudner, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+starvation+and+docetaxel+induce+c-Myc-driven+hENT1+surface+expression+to+overcome+gemcitabine+resistance+in+ASS1-negative+tumors.">Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).</li><li>Ferretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+invasion+into+Matrigel:+optimized+protocol+for+RNA+extraction.">Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction.</a> Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+role+of+CD44+in+cancer+progression:+therapeutic+implications.">The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 11 (1), 64 (2018).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).</li><li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).</li><li>Mount, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+antitumor+efficacy+of+anti-GD2+CAR+T+cells+in+H3-K27M.">Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M.</a> Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).</li><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+classification+of+tumors+of+the+central+nervous+system:+A+summary.">The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Czabanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+adhesion+molecule-C+mediates+the+recruitment+of+embryonic-endothelial+progenitor+cells+to+the+perivascular+niche+during+tumor+angiogenesis.">Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).</li><li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy.">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li><li>Pankov&#225;, K., R&#246;sel, D., Novotn&#253;, M., Br&#225;bek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+of+transition+between+mesenchymal+and+amoeboid+invasiveness+in+tumor+cells.">The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li></ol>

L’immunocytochimie des cellules 3D vivantes que nous avons adoptée ici pour l’invasion et la migration pédiatriques de DMG pourrait être facilement adaptée également à d’autres types de cellules tumorales hautement invasives, y compris les lignées cellulaires cancéreuses du sein et du côlon. 
Contrairement aux tests d’immunocytochimie sur cellules 2D vivantes10 précédemment réalisés, lorsque vous travaillez en 3D, il est suggéré de prêter attenti...

La capacité des cellules tumorales à s’échapper et à se disséminer à travers les tissus environnants est une caractéristique du cancer1. En particulier, la motilité des cellules tumorales est une caractéristique des tumeurs malignes, qu’il s’agisse d’un type de tumeur métastatique tel que le cancer du sein2 ou colorectal3 ou d’un type localement invasif tel que le gliome diffus 4,5.
L’imagerie joue un rôle central dans l’étude de nombreux aspects des phénotypes de cellules tumorales; Cependant, l’imagerie de cellules vivantes est certainement à privilégier lors de l’étude de processus cellulaires dynamiques tels que la migration et l’invasion, lorsque des changements de morphologie et d’interaction cellule-cellule 6,7 se produisent et peuvent être examinés plus facilement au fil du temps. Pour l’imagerie de cellules vivantes, différents systèmes de microscopie optique peuvent être utilisés, du contraste de phase aux microscopes confocaux fluorescents, et l’acquisition d’images effectuée sur une courte ou longue période de temps sur un microscope inversé équipé d’une chambre pour le contrôle de la température et du CO2, ou dans des systèmes d’analyse d’images à haut contenu qui ont des chambres intégrées, ou bien dans des systèmes d’image qui peuvent rester dans l’incubateur sans avoir besoin de déranger les cellules pendant toute la durée de l’expérience. Le choix du système utilisé est souvent dicté par un certain nombre de facteurs tels que la résolution nécessaire, la durée du temps global d’acquisition et les intervalles de temps, le type de récipient utilisé et le débit du test (chambre unique ou plaque multipuits), la sensibilité des cellules utilisées (cellules précieuses et/ou rares) et la phototoxicité des cellules en présence de fluorophores.
En ce qui concerne l’imagerie fluorescente en mode vivant, cela peut être réalisé en transduisant des cellules pour l’expression de protéines fluorescentes soit pour une expression stable, soit en tant que système inductible8, par transfection cellulaire transitoire, soit en utilisant des colorants cellulaires qui sont maintenant disponibles pour le marquage des cellules vivantes7, pour le suivi des cellules vivantes ainsi que pour le marquage des organites subcellulaires9.
Une approche utile a récemment été développée pour l’immunocytochimie des cellules vivantes, où un anticorps reconnaissant un marqueur de surface de choix peut être lié à un réactif de marquage et, lors de l’ajout au milieu de culture, les cellules exprimant le marqueur spécifique peuvent être facilement imagées en temps réel par imagerie de cellules vivantes. La visualisation et la quantification de l’expression des marqueurs à l’aide d’un tel système peuvent être facilement réalisées lorsque les cellules sont cultivées dans des conditions de culture bidimensionnelles (2D)10.
Dans cette étude, nous avons optimisé les protocoles pour l’invasion immunocytochimique des cellules 3D vivantes et la migration des cellules pédiatriques de gliome diffus à ligne médiane (DMG) dérivées de patients11,12. Les DMG sont des tumeurs cérébrales très agressives affectant les enfants, pour la grande majorité associées à la mutation conductrice K27M dans les variantes de l’histone H3. Les DMG apparaissent dans le tronc cérébral et les régions médianes du système nerveux central (SNC) et se caractérisent par une nature hautement infiltrante. Il a été démontré que cette capacité invasive est au moins en partie médiée par l’hétérogénéité intratumorale et les caractéristiques cancéreuses des cellules DMG7.
Pour illustrer nos essais, un réactif de marquage d’anticorps (ALR) a été utilisé en combinaison avec un anticorps contre CD44. CD44 est une glycoprotéine transmembranaire et une molécule d’adhésion exprimée sur les cellules souches et d’autres types de cellules, associée au phénotype des cellules souches cancéreuses et à la migration et à l’invasion des cellules tumorales13. Les protocoles comprennent la préparation de l’échantillon, l’acquisition d’images en mode fond clair et fluorescent, et l’analyse sur un instrument d’analyse de cellules vivantes qui a permis de mesurer quantitativement en temps réel l’expression globale de CD44 sur la membrane cellulaire DMG pendant l’invasion et la migration 3D. Les tests ont également permis de visualiser le signal fluorescent intermittent de CD44 sur des cellules individuelles lors de la migration et de l’invasion. Il est intéressant de noter qu’un effet de l’anticorps anti-CD44 a également été observé, qui potentiellement agissant comme un anticorps bloquant, semblait également réduire la migration et l’invasion cellulaires ainsi qu’induire un changement du modèle d’invasion d’un phénotype mésenchymateux collectif à un phénotype amiboïde plus unicellulaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3056D</td>
			<td>solution for neurosphere dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Mv medical</td>
			<td>FFL16034</td>
			<td>cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-44 (156-3C11)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3570</td>
			<td>Mouse mAb IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>4743</td>
			<td>Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>-</td>
			<td>The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>any inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Green Background Suppressor Reagent</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>6500-0045</td>
			<td>Backgroung suppressor reagent (BSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor stem cell (TSM) medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>growth cell medium (see reference in the text for details)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>7007</td>
			<td>size 96 well, round bottom clear</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma

La migration et l’invasion cellulaires sont des caractéristiques spécifiques des tumeurs mutantes H3K27M du gliome médian diffus (DMG). Nous avons déjà modélisé ces caractéristiques à l’aide de tests tridimensionnels (3D) d’invasion et de migration cellulaires. Dans cette étude, nous avons optimisé ces tests 3D pour l’immunocytochimie des cellules vivantes. Un réactif de marquage des anticorps a été utilisé pour détecter en temps réel l’expression de la molécule d’adhésion CD44, sur la membrane plasmique des cellules migrantes et envahissantes d’une lignée cellulaire primaire dérivée du patient DMG H3K27M. CD44 est associé au phénotype des cellules souches cancéreuses et à la migration et à l’invasion des cellules tumorales et est impliqué dans les interactions directes avec la matrice extracellulaire du système nerveux central (SNC). Les neurosphères (NS) de la lignée cellulaire DMG H3K27M ont été intégrées dans la matrice de la membrane basale (BMM) ou placées sur une fine couche de revêtement de BMM, en présence d’un anticorps anti-CD44 en conjonction avec le réactif de marquage des anticorps (ALR). L’analyse d’images immunocytochimiques de cellules vivantes en 3D a été réalisée sur un instrument d’analyse de cellules vivantes pour mesurer quantitativement l’expression globale de CD44, en particulier sur les cellules migratrices et envahissantes. La méthode permet également de visualiser en temps réel l’expression intermittente de CD44 sur la membrane plasmique des cellules migrantes et envahissantes. De plus, le test a également fourni de nouvelles informations sur le rôle potentiel de CD44 dans la transition mésenchymateuse vers amiboïde dans les cellules DMG H3K27M.

Le protocole d’immunocytochimie des cellules vivantes 3D pour l’invasion et la migration est résumé dans un flux de travail simple et reproductible à la figure 1. En ensemençant les cellules DMG dans des plaques à fond rond ULA 96 puits, des NS de taille reproductible sont obtenues et utilisées dans les étapes affichées. Lorsque les NS ont atteint la taille idéale de ~300 μm (environ 4 jours après l’ensemencement), les tests d’invasion12 et de migra...

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Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Cette étude présente un protocole d’immunocytochimie de cellules 3D vivantes appliqué à une lignée cellulaire de gliome diffus pédiatrique, utile pour étudier en temps réel l’expression des protéines sur la membrane plasmique au cours de processus dynamiques tels que l’invasion et la migration des cellules 3D.

Tests d’immunocytochimie sur cellules 3D vivantes du gliome médian diffus pédiatrique

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Le gliome diffus de la ligne médiane est une tumeur cérébrale très invasive. Cette méthode permet d’étudier en temps réel comment les cellules DMG migrent et envahissent dans un contexte 3D avec des informations spécifiques sur le rôle potentiel d’une molécule d’adhésion clé. En utilisant un réactif de marquage et un anticorps spécifique anti-CD44, nous pouvons étudier par imagerie cellulaire vivante l’expression de CD44 sur membrane plasmique sur les cellules DMG également dans la migration et l’invasion 3D.L’application de cette technique a mis en évidence le rôle potentiel de CD44 dans la motilité de ces cellules, suggérant qu’il pourrait représenter une cible moléculaire précieuse et invasive. Pour commencer, réhydratez l’ALR en ajoutant 100 microlitres d’eau stérile et mélangez la solution par pipetage. Mélanger l’anticorps avec l’ALR dans le milieu TSM dans une plaque multipuits à fond rond ou dans un tube ambré et le protéger de la lumière.Préparer une quantité suffisante du milieu pour distribuer 25 microlitres par puits à trois fois la concentration finale du dosage, puis incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Diluer la BSR dans le milieu VDMD à une concentration de 1,5 millimolaire pour obtenir une concentration finale de 0,5 millimolaire à la fin de l’essai. Ensuite, retirez doucement et lentement 75 microlitres du milieu de chaque puits, en évitant de toucher le fond du puits où se trouve le NS et en vérifiant visuellement la présence du NS.Ajouter doucement 25 microlitres du complexe d’anticorps BSR et ALR à chaque puits et laisser le complexe d’anticorps ALR se mélanger au milieu pendant deux à trois minutes. À l’aide d’un microscope inversé, assurez-vous que chaque NS est situé au centre du fond. Évitez la formation de bulles en les enlevant à l’aide d’une aiguille.Placez l’assiette sur de la glace pendant cinq minutes pour laisser le fond de l’assiette refroidir. Distribuez 75 microlitres de BMM par puits en plaçant une pointe P200 pré-refroidie sur la paroi interne du puits, en évitant la formation de bulles et en touchant le fond du puits. Laissez l’assiette sur la glace pendant cinq minutes pour laisser le BMM se mélanger au milieu.À l’aide d’un microscope inversé, vérifiez l’emplacement de NS. Et si elle n’est pas présente au centre, centrifuger la plaque à quatre degrés Celsius à 180 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, transférez la plaque dans l’instrument d’analyse de cellules vivantes placé dans l’incubateur réglé à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité. Une fois les puits recouverts de BMM, coupez une pointe P200.Prenez 50 microlitres du milieu cellulaire et NS de chaque puits sélectionné et transférez-le dans un puits à fond plat revêtu. Vérifiez visuellement la présence et la position du NS dans chaque puits. Ajouter doucement 50 microlitres des anticorps BSR et ALR dilués à chaque puits, en attendant deux à trois minutes pour laisser les réactifs se mélanger.Et à l’aide d’un microscope inversé, assurez-vous que la plupart des NS répliquées sont situées au centre du puits. Après vous être assuré de l’absence de bulle, transférez doucement la plaque dans l’instrument d’analyse de cellules vivantes comme démontré précédemment. Sur le logiciel de l’instrument d’analyse de cellules vivantes, sélectionnez le calendrier d’option à acquérir, puis cliquez sur l’onglet plus et sélectionnez scan on schedule pour scanner les plaques avec les intervalles mentionnés dans le manuscrit texte.Dans la fenêtre du logiciel, créez ou restaurez le navire, puis cliquez sur l’option Nouveau. Sélectionnez le type de balayage sphéroïde, la phase plus le fond clair, les canaux d’image verts pour le test d’invasion et l’objectif 4X. Sélectionnez l’analyse de clonage de dilution, l’objectif de type 4X et la phase et le vert pour le test de migration.Sélectionnez le type de plaque et définissez les puits à scanner en les mettant en surbrillance sur la carte des plaques, puis configurez la fréquence de balayage. Cliquez sur Ajouter à la planification et lancez l’analyse. Sélectionnez l’onglet Créer une nouvelle définition d’analyse.Sélectionnez ensuite l’invasion sphéroïde ou l’application d’analyseur de base pour l’invasion et la migration respectivement dans l’onglet. Sélectionnez les canaux d’invasion et de migration appropriés dans le canal d’image. Sélectionnez quelques images représentatives de trois à quatre puits pour prévisualiser et affiner le paramètre d’analyse.Pour le test d’invasion, dans l’onglet de définition de l’analyse, ajustez les paramètres de l’application dans les canaux en fond clair et vert avec les paramètres mentionnés dans le manuscrit du texte pour générer une segmentation précise entre les cellules sphéroïdes et envahissantes. Pour le test de migration, ajustez les paramètres de l’application comme indiqué dans le manuscrit de texte dans la phase et les canaux verts pour générer une segmentation précise entre la confluence et les cellules vertes. Vérifiez que les paramètres d’analyse sont corrects pour le NS en cliquant au hasard sur plusieurs puits.Sélectionnez les puits et les points temporels à analyser. Enregistrez la définition de l’analyse et cliquez sur Terminer. Les images confocales immunofluorescentes représentatives de l’expression de CD44 dans les cellules primaires dérivées de patients atteints de DMG ont démontré le rôle de CD44 dans la migration et l’invasion cellulaires.L’immunochimie cellulaire 3D vivante permet de visualiser l’expression de CD44. Les images représentatives du laps de temps pour la migration et l’invasion montrent la présence et l’absence du signal fluorescent vert sur la même cellule observée au fil du temps, ce qui suggère que l’expression de CD44 est activée et désactivée pendant que les cellules migrent et envahissent. Les processus de migration et d’invasion sont suivis pendant 96 heures, montrant des cellules QCTB-R059 avec un niveau élevé de CD44.La quantification de l’expression de CD44 et son augmentation au fil du temps ont été mesurées par le signal de fluorescence vert global associé à l’ALR pour la migration et l’invasion. Lorsque l’anticorps anti-CD44 est utilisé sur des cellules vivantes, il affecte la morphologie cellulaire, induisant une transition de l’invasion mésenchymateuse à l’invasion amiboïde et une réduction de la capacité invasive et migratoire de ces cellules. L’étape la plus critique de la méthode est le mélange du réactif de marquage avec un anticorps, l’ajout du mélange au Matrigel et au milieu, et l’accès à l’instrument d’imagerie de cellules vivantes.Cette méthode peut être mise en œuvre par l’utilisation de deux ou plusieurs réactifs et anticorps de marquage distinctifs pour étudier l’interaction des cellules DMG médiée par les cellules directes et le contact. Notre méthode offre de nouveaux outils pour étudier en 3D les mécanismes cellulaires et moléculaires de la migration et de l’invasion des DMG, fournissant de nouvelles directions pour inhiber leur phénotype infiltrant.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocole pour Rapid Post-mortem Culture cellulaire de Diffuse Intrinsic Pontine gliome (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantation de tumeurs cérébrales pédiatriques de poisson zèbre dans des hôtes immunisés pour une étude à long terme du comportement des cellules tumorales et de la réponse aux médicaments

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

Corps entier TEP/IRM des Patients pédiatriques : les détails qui comptent

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Détermination du niveau d’Expression de protéine dans des cellules cultivées par immunocytochimie sur des blocs de paraffine cellulaire

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Évaluation de biomarqueurs dans les gliomes par immunohistochimie sur la paraffine 3D gliome Neurosphère Cultures

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Imagerie longitudinale intravitale du comportement cellulaire de tumeur cérébrale en réponse à une biopsie chirurgicale invasive

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Surveillance en temps réel de la migration cellulaire des gliomes humains sur les co-cultures d'Axon-Oligodendrocyte de Ganglion de racine dorsal

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Tests de validation des inhibiteurs de l’histone d’acétyltransférase

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flux de travail de dépistage rapide pour identifier la thérapie combinée potentielle pour le GBM à l’aide de cellules souches de gliome dérivées du patient

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Co-culture de neurones glutamatergiques et de cellules de gliome pédiatrique de haut grade dans des dispositifs microfluidiques pour évaluer les interactions électriques