Name: live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

ברצוננו להודות לד"ר סילביה סודו ולד"ר ג'וליה פדריצ'י (היחידה לרשתות סלולריות ומטרות טיפוליות מולקולריות, המכון הלאומי לסרטן IRCCS-Regina Elena, רומא, איטליה) על הגישה למערכת IncuCyte S3 Live Cell Imaging System בהגדרה הראשונית של פרוטוקול ההדמיה. יתר על כן, אנו מודים לברנדט קולוזווארי על הייעוץ הטכני. המחקר נתמך על ידי מענק ילדים חולי סרטן בבריטניה (16-234) ומשרד הבריאות האיטלקי Ricerca Corrente. M וינצ'י הוא עמית ילדים חולי סרטן בבריטניה. R Ferretti הוא חתן מלגת Fondazione Veronesi (2018 ו 2019). המחברים מודים ל-Fondazione Heal על תמיכתם ולקרן בית החולים לילדים על מימון בנק גידולי הילדים של קווינסלנד.

פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות ועדות האתיקה למחקר אנושי של המוסדות.
הערה: מחקר זה בוצע באמצעות Incucyte S3 ו/או SX5 Live-Cell Analysis Instrument (המכונה מכשיר ניתוח תאים חיים).
1. יצירת ספרואידים סרטניים בגודל שניתן לשכפל
הערה: הפרוטוקול (סעיף 1) שתואר על ידי...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).</li><li>Magr&#236;, A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+early+metastatic+seeding+occur+in+colorectal+cancer.">Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Caretti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+spread+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).</li><li>Pericoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+multiple+platforms+for+the+analysis+of+multifluorescent+marking+technology+applied+to+pediatric+GBM+and+DIPG.">Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+and+cooperativity+between+subclonal+populations+of+pediatric+glioblastoma+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+cells.">Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).</li><li>Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lentiviral-inducible+transgene+expression+systems+and+versatile+single-plasmid+reporters+for+in+vitro+and+in+vivo+cancer+biology+studies.">Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).</li><li>Huang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-regulated+ROS+from+xanthine+oxidase+acts+as+an+early+effector+for+triggering+late+mitochondria-dependent+apoptosis+in+cathepsin+s-targeted+tumor+cells.">Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells.</a> PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).</li><li>Prudner, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+starvation+and+docetaxel+induce+c-Myc-driven+hENT1+surface+expression+to+overcome+gemcitabine+resistance+in+ASS1-negative+tumors.">Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).</li><li>Ferretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+invasion+into+Matrigel:+optimized+protocol+for+RNA+extraction.">Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction.</a> Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+role+of+CD44+in+cancer+progression:+therapeutic+implications.">The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 11 (1), 64 (2018).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).</li><li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).</li><li>Mount, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+antitumor+efficacy+of+anti-GD2+CAR+T+cells+in+H3-K27M.">Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M.</a> Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).</li><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+classification+of+tumors+of+the+central+nervous+system:+A+summary.">The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Czabanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+adhesion+molecule-C+mediates+the+recruitment+of+embryonic-endothelial+progenitor+cells+to+the+perivascular+niche+during+tumor+angiogenesis.">Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).</li><li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy.">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li><li>Pankov&#225;, K., R&#246;sel, D., Novotn&#253;, M., Br&#225;bek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+of+transition+between+mesenchymal+and+amoeboid+invasiveness+in+tumor+cells.">The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li></ol>

האימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים שאימצנו כאן לפלישה והגירה של DMG בילדים יכולה להיות מותאמת בקלות גם לסוגים אחרים של תאי גידול פולשניים מאוד, כולל שורות תאים של סרטן השד והמעי הגס. 
בשונה מבדיקות אימונוציטוכימיה של תאים דו-ממדיים חייםשבוצעו בעבר 10, כאשר ?...

היכולת של תאי הגידול להתחמק ולהתפשט דרך הרקמה שמסביב היא סימן ההיכר של סרטן1. בפרט, תנועתיות תאי הגידול היא מאפיין אופייני של גידולים ממאירים, בין אם מדובר בסוג גידול גרורתי כגון שד2 או סרטן המעי הגס3 או מסוג פולשני מקומי כגון גליומה מפושטת 4,5.
לדימות תפקיד מרכזי בחקירת היבטים רבים של פנוטיפים של תאי גידול; עם זאת, הדמיה של תאים חיים בהחלט עדיפה כאשר חוקרים תהליכים תאיים דינמיים כגון נדידה ופלישה, כאשר שינויים במורפולוגיה ובאינטראקציה בין תאים 6,7 מתרחשים וניתן לבחון אותם בקלות רבה יותר לאורך זמן. לצורך דימות תאים חיים ניתן להשתמש במערכות מיקרוסקופיה אופטיות שונות, החל מניגוד פאזה ועד מיקרוסקופים פלואורסצנטיים קונפוקליים, וקליטת תמונה המבוצעת על פני פרק זמן קצר או ארוך במיקרוסקופ הפוך המצויד בתא לבקרת טמפרטורהו-CO2, או במערכות ניתוח תמונה בעלות תוכן גבוה בעלות תאים מובנים, או לחילופין במערכות תמונה המסוגלות לשבת באינקובטור ללא צורך להפריע לתאים לאורך כל הזמן של הניסוי. בחירת המערכת בה נעשה שימוש מוכתבת לעיתים קרובות על ידי מספר גורמים כגון הרזולוציה הדרושה, אורך זמן הרכישה הכולל ומרווחי הזמן, סוג כלי הדם המשמש והתפוקה של הבדיקה (תא בודד או צלחת מרובת בארות), רגישות התאים המשמשים (תאים יקרים ו / או נדירים) ופוטוטוקסיות של התאים אם קיימים פלואורופורים.
באשר לדימות פלואורסצנטי במצב חי, ניתן להשיג זאת על ידי התמרת תאים לביטוי חלבונים פלואורסצנטיים או לביטוי יציב או כמערכת אינדוקציה8, על ידי התמרה של תאים חולפים, או על ידי שימוש בצבעי תאים הזמינים כעת לסימון תאים חיים7, למעקב אחר תאים חיים וכן לתיוג אברונים תת-תאיים9.
לאחרונה פותחה גישה שימושית לאימונוציטוכימיה של תאים חיים, שבה נוגדן המזהה סמן פני שטח נבחר יכול להיות קשור למגיב תיוג, ובתוספת מדיה תרבית, תאים המבטאים את הסמן הספציפי יכולים להיות מצולמים בקלות בזמן אמת על ידי הדמיה של תאים חיים. הדמיה וכימות של ביטוי סמן באמצעות מערכת כזו ניתן להשיג בקלות כאשר תאים גדלים בתנאי תרבית דו-ממדית (2D)10.
במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקולים לפלישה אימונוציטוכימית של תאים חיים בתלת-ממד והגירה של תאים שמקורם בגליומה מפושטת בקו האמצע בילדים (DMG)11,12. DMG הם גידולי מוח אגרסיביים מאוד הפוגעים בילדים, עבור רובם המכריע הקשורים למוטציה המניע K27M בגרסאות היסטון H3. DMG מתעוררים בגזע המוח ובאזורי קו האמצע של מערכת העצבים המרכזית (CNS) ומאופיינים באופי חדיר מאוד. יכולת פולשנית זו הוכחה כמתווכת לפחות בחלקה על ידי ההטרוגניות התוך-סרטנית והתכונות דמויות-הגזע הסרטני של תאי DMG7.
כדי להדגים את הבדיקות שלנו, נעשה שימוש בריאגנט תיוג נוגדנים (ALR) בשילוב עם נוגדן עבור CD44. CD44 הוא גליקופרוטאין טרנסממברנה ומולקולת היצמדות המתבטאת בתאי גזע ובסוגי תאים אחרים, הקשורים לפנוטיפ של תאי גזע סרטניים ולנדידת תאי גידול ופלישה13. הפרוטוקולים כוללים את הכנת הדגימה, רכישת התמונה במצב שדה בהיר ופלואורסצנטי, והניתוח על מכשיר ניתוח תאים חיים שאיפשר למדוד כמותית בזמן אמת את ביטוי CD44 הכולל על קרום תא DMG במהלך פלישה והגירה תלת-ממדית. הבדיקות אפשרו גם את האפשרות לדמיין את האות הפלואורסצנטי לסירוגין של CD44 על תאים בודדים בזמן נדידה ופלישה. מעניין לציין כי נצפתה גם השפעה של נוגדן אנטי-CD44, אשר עשוי לפעול כנוגדן חוסם, נראה גם להפחית נדידת תאים ופלישה, כמו גם לגרום לשינוי של דפוס הפלישה מ mesenchymal קולקטיבי דמוי פנוטיפ דמוי amoeboid תא יחיד יותר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3056D</td>
			<td>solution for neurosphere dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Mv medical</td>
			<td>FFL16034</td>
			<td>cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-44 (156-3C11)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3570</td>
			<td>Mouse mAb IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>4743</td>
			<td>Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>-</td>
			<td>The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>any inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Green Background Suppressor Reagent</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>6500-0045</td>
			<td>Backgroung suppressor reagent (BSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor stem cell (TSM) medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>growth cell medium (see reference in the text for details)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>7007</td>
			<td>size 96 well, round bottom clear</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma

נדידת תאים ופלישה הם סימני היכר ספציפיים של גידולים מוטנטיים מסוג Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M. כבר מידלנו תכונות אלה באמצעות מבחני פלישה והגירה תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) מבוססי תאים. במחקר זה, ביצענו אופטימיזציה של מבחני תלת-ממד אלה עבור אימונוציטוכימיה של תאים חיים. מגיב תיוג נוגדנים שימש כדי לזהות בזמן אמת את הביטוי של מולקולת ההידבקות CD44, על קרום הפלזמה של תאים נודדים ופולשים של קו תאים ראשוני שמקורו בחולה DMG H3K27M. CD44 קשור לפנוטיפ של תאי גזע סרטניים ולנדידה ופלישה של תאי גידול והוא מעורב באינטראקציות ישירות עם המטריצה החוץ תאית של מערכת העצבים המרכזית (CNS). נוירוספרות (NS) מקו התאים DMG H3K27M הוטמעו במטריצת קרום הבסיס (BMM) או הונחו על שכבת ציפוי דקה של BMM, בנוכחות נוגדן אנטי-CD44 בשילוב עם מגיב תיוג נוגדנים (ALR). ניתוח התמונה האימונוציטוכימית של תאים חיים בתלת-ממד בוצע על מכשיר ניתוח תאים חיים כדי למדוד כמותית את ביטוי CD44 הכולל, במיוחד על התאים הנודדים והפולשים. השיטה מאפשרת גם הדמיה בזמן אמת של ביטוי לסירוגין של CD44 על קרום הפלזמה של תאים נודדים ופולשים. יתר על כן, הבדיקה גם סיפקה תובנות חדשות לגבי התפקיד הפוטנציאלי של CD44 במעבר מזנכימלי לאמבואיד בתאי DMG H3K27M.

פרוטוקול אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים עבור פלישה והגירה מסוכם בתהליך עבודה פשוט וניתן לשחזור באיור 1. על ידי זריעת תאי DMG בלוחות תחתונים עגולים ULA 96, NS בגודל הניתן לשחזור מתקבלים ומשמשים בשלבים המוצגים. כאשר NS הגיעו לגודל האידיאלי של ~ 300 מיקרומטר (כ -4 ימים לאחר הזר...

Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

מחקר זה מציג פרוטוקול של אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים המיושמים על קו תאי גליומה מפוזר בקו האמצע בילדים, שימושי כדי לחקור בזמן אמת את ביטוי החלבונים על קרום הפלזמה במהלך תהליכים דינמיים כמו פלישה ונדידה של תאים תלת-ממדיים.

בדיקות אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים של גליומה מפושטת בקו האמצע בילדים

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

גליומה מפושטת בקו האמצע היא גידול פולשני מאוד במוח. שיטה זו מסייעת לחקור בזמן אמת כיצד תאי DMG נודדים ופולשים בהקשר תלת-ממדי עם תובנות ספציפיות על התפקיד הפוטנציאלי של מולקולת היצמדות מרכזית. על ידי שימוש בריאגנט תיוג ונוגדן ספציפי נגד CD44, אנו יכולים לחקור על ידי הדמיה של תאים חיים את הביטוי של CD44 על קרום הפלזמה על תאי DMG גם בנדידה תלת ממדית ופלישה.היישום של טכניקה זו הדגיש את התפקיד הפוטנציאלי של CD44 בתנועתיות של תאים אלה, מה שמרמז על כך שהוא יכול לייצג מטרה מולקולרית פולשנית בעלת ערך. כדי להתחיל, rehydrate את ALR על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מים סטריליים ולערבב את הפתרון על ידי pipetting. מערבבים את הנוגדן עם ה-ALR בתווך TSM בצלחת מרובת בארות תחתונה עגולה או בצינור ענבר ומגנים עליו מפני אור.הכינו כמות מספקת של המדיום כדי להוציא 25 מיקרוליטר לבאר בריכוז פי שלושה מהבדיקה הסופית ולאחר מכן דגרו בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לדלל BSR בתווך TSM בריכוז 1.5 מילימולרי כדי לקבל ריכוז סופי של 0.5 מילימולר בסוף הבדיקה. לאחר מכן בעדינות ובאיטיות להסיר 75 מיקרוליטר של המדיום מכל באר, הימנעות לגעת בתחתית הבאר שבו NS יושב ולבדוק את נוכחותו של NS חזותית.הוסף בעדינות 25 מיקרוליטר של קומפלקס נוגדנים BSR ו- ALR לכל באר ולתת קומפלקס נוגדנים ALR להתערבב עם המדיום במשך שתיים עד שלוש דקות. באמצעות מיקרוסקופ הפוך, ודא שכל NS ממוקם במיקום מרכזי בתחתית הבאר. הימנע היווצרות של בועות על ידי הסרתם באמצעות מחט.מניחים את הצלחת על קרח במשך חמש דקות כדי לתת לתחתית הצלחת להתקרר. יש להוציא 75 מיקרוליטר BMM לכל באר על ידי הנחת קצה P200 מקורר מראש על הקיר הפנימי של הבאר, תוך הימנעות מהיווצרות בועות ונגיעה בתחתית הבאר. השאירו את הצלחת על קרח למשך חמש דקות כדי לתת ל-BMM להתערבב עם המדיום.באמצעות מיקרוסקופ הפוך, בדוק את המיקום של NS. ואם לא קיים באופן מרכזי, צנטריפוגו את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס ב 180 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר מכן העבירו את הצלחת במכשיר ניתוח התא החי הממוקם בתוך האינקובטור שנקבע על 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו -95% לחות. ברגע שהבארות מצופות ב-BMM, חותכים קצה P200.קח 50 מיקרוליטר של מדיום התא ו- NS מכל באר שנבחרה והעבר אותו לבאר תחתית שטוחה מצופה. בדוק את הנוכחות ואת המיקום של NS בכל באר חזותית. מוסיפים בעדינות 50 מיקרוליטר של נוגדן BSR ו- ALR מדולל לכל באר, ומחכים שתיים עד שלוש דקות כדי לתת לריאגנטים להתערבב.ובאמצעות מיקרוסקופ הפוך, ודא שרוב NS המשוכפל ממוקם במיקום מרכזי בבאר. לאחר הבטחת היעדר בועה, העבר בעדינות את הצלחת במכשיר ניתוח התא החי כפי שהודגם קודם לכן. בתוכנת המכשיר לניתוח תאים חיים, בחר את האפשרות לוח זמנים לרכישה, ולאחר מכן לחץ על כרטיסיית הפלוס ובחר סרוק לפי לוח הזמנים כדי לסרוק את הלוחות עם מרווחים כפי שהוזכר בכתב היד של הטקסט.בחלון התוכנה, צור או שחזר כלי ולאחר מכן לחץ על האפשרות חדש. בחר סוג סריקה ספרואידית, פאזה בתוספת שדה בהיר, ערוצי תמונה ירוקים לבדיקת הפלישה ומטרה 4X. בחר סריקת שכפול דילול, מטרה מסוג 4X ופאזה וירוק עבור בדיקת ההעברה.בחר את סוג הלוח והגדר את הבארות לסריקה על-ידי הדגשתן במפת הלוחות, ולאחר מכן הגדר את תדירות הסריקה. לחץ על הוסף ללוח זמנים והתחל בסריקה. בחר בכרטיסיה צור הגדרת ניתוח חדשה.לאחר מכן בחר פלישה ספרואידית או יישום אנלייזר בסיסי לפלישה והגירה בהתאמה בכרטיסייה. בחרו בערוצים המתאימים לפלישה ולהעברה בערוץ התמונה. בחרו כמה תמונות מייצגות משלוש עד ארבע בארות לתצוגה מקדימה ולליטוש הגדרת הניתוח.עבור מבחן הפלישה, בכרטיסייה הגדרת ניתוח, התאם את הגדרות היישום בשדה הבהיר ובערוצים הירוקים עם ההגדרות המוזכרות בכתב היד של הטקסט כדי ליצור פילוח מדויק בין התאים הספרואידים לתאים הפולשים. עבור בדיקת העברה, התאם את הגדרות היישום כפי שהוזכר בכתב היד של הטקסט בפאזה ובערוצים הירוקים כדי ליצור פילוח מדויק בין המפגש לתאים הירוקים. בדוק שהגדרות הניתוח נכונות עבור NS על ידי לחיצה אקראית על מספר בארות.בחר את הבארות ונקודות הזמן לניתוח. שמור את הגדרת הניתוח ולחץ על סיום. התמונות הקונפוקליות האימונופלואורסצנטיות המייצגות של ביטוי CD44 בתאים ראשוניים שמקורם בחולה DMG הדגימו את התפקיד של CD44 בנדידת תאים ופלישה.אימונוכימיה חיה של תאים תלת-ממדיים מאפשרת הדמיה של ביטוי CD44. המסגרות המייצגות של חלוף הזמן הן עבור הגירה והן עבור פלישה מראות את נוכחותו והיעדרו של אות פלואורסצנטי ירוק על אותו תא שנצפה לאורך זמן, דבר המצביע על כך שהביטוי של CD44 מופעל ונכבה בזמן שתאים נודדים ופולשים. תהליכי ההגירה והפלישה מבוצעים במשך 96 שעות, ומראים תאי QCTB-R059 עם רמה גבוהה של CD44.כימות ביטוי CD44 וגידולו לאורך זמן נמדדו על ידי האות הפלואורסצנטי הירוק הכולל הקשור ל- ALR הן להגירה והן לפלישה. כאשר נוגדן אנטי CD44 משמש על תאים חיים, הוא משפיע על המורפולוגיה של התא, גרימת מעבר מפלישה דמוית מזנכימלית לפלישה דמוית אמבוידים והפחתה של יכולת פולשנית ונדידה של תאים אלה. השלב הקריטי ביותר בשיטה הוא ערבוב של מגיב תיוג עם נוגדן, הוספת התערובת למטריג'ל ולמדיום, וגישה למכשיר הדמיה של תאים חיים.שיטה זו יכולה להיות מיושמת עוד יותר על ידי שימוש בשני או יותר ריאגנטים תיוג ייחודיים ונוגדנים כדי לחקור את האינטראקציה של תאי DMG בתיווך תאים ישירים ומגע. השיטה שלנו מציעה כלים חדשים לחקור בתלת-ממד את המנגנונים התאיים והמולקולריים של נדידת DMG ופלישה, ומספקת כיוונים חדשים לעיכוב הפנוטיפ החודר שלהם.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

השתלת דג הזברה גידולים מוחיים במוח לתוך מארחים המוסמכת החיסונית עבור מחקר לטווח ארוך של התנהגות תאים סרטניים והתגובה לסמים

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

לכל הגוף PET/MRI של ילדים חולים: הפרטים חשובים

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

קביעת רמת ביטוי חלבונים בתאים בתרבית על ידי Immunocytochemistry על בלוקי תא פרפין-מוטבע

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

הערכה של סמנים Glioma מאת אימונוהיסטוכימיה על תרבויות Neurosphere פרפין-מוטבע Glioma תלת-ממד

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

האורך הדמיה של התנהגות המוח תאים סרטניים בתגובה ביופסיה פולשנית כירורגית

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

ניטור בזמן אמת של הגירה של תא האדם Glioma על גבי גנגליון שורש-אוליגודנדרוציטים שיתוף תרבויות

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

תסרוקות לאימות מעכבי אצטילטרנספראז היסטון

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

זרימת עבודה מהירה של סינון לזיהוי טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות תאי גזע גליומה שמקורם במטופל

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...