Name: live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Si ringraziano la Dott.ssa Silvia Soddu e la Dott.ssa Giulia Federici (Unità di Reti Cellulari e Bersagli Terapeutici Molecolari, IRCCS-Istituto Nazionale Tumori Regina Elena, Roma, Italia) per l'accesso al sistema di imaging IncuCyte S3 Live Cell nell'impostazione preliminare del protocollo di imaging. Inoltre, ringraziamo Bernadett Kolozsvari per la consulenza tecnica. Lo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione Children with Cancer UK (16-234) e dal Ministero della Salute italiano Ricerca Corrente. M Vinci è un Children with Cancer UK Fellow. R Ferretti è vincitore della Fondazione Veronesi Fellowship (2018 e 2019). Gli autori riconoscono Fondazione Heal per il loro sostegno e la Children's Hospital Foundation per il finanziamento della Queensland Children's Tumor Bank.

Questo protocollo segue le linee guida dei comitati etici per la ricerca umana delle istituzioni.
NOTA: Questo studio è stato eseguito utilizzando Incucyte S3 e/o SX5 Live-Cell Analysis Instrument (indicato come strumento di analisi delle cellule vive).
1. Generazione di sferoidi tumorali di dimensioni riproducibili
NOTA: Il protocollo (sezione 1) descritto da Vinci et al. 2015 7,12, è s...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).</li><li>Magr&#236;, A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+early+metastatic+seeding+occur+in+colorectal+cancer.">Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Caretti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+spread+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).</li><li>Pericoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+multiple+platforms+for+the+analysis+of+multifluorescent+marking+technology+applied+to+pediatric+GBM+and+DIPG.">Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+and+cooperativity+between+subclonal+populations+of+pediatric+glioblastoma+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+cells.">Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).</li><li>Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lentiviral-inducible+transgene+expression+systems+and+versatile+single-plasmid+reporters+for+in+vitro+and+in+vivo+cancer+biology+studies.">Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).</li><li>Huang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-regulated+ROS+from+xanthine+oxidase+acts+as+an+early+effector+for+triggering+late+mitochondria-dependent+apoptosis+in+cathepsin+s-targeted+tumor+cells.">Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells.</a> PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).</li><li>Prudner, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+starvation+and+docetaxel+induce+c-Myc-driven+hENT1+surface+expression+to+overcome+gemcitabine+resistance+in+ASS1-negative+tumors.">Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).</li><li>Ferretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+invasion+into+Matrigel:+optimized+protocol+for+RNA+extraction.">Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction.</a> Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+role+of+CD44+in+cancer+progression:+therapeutic+implications.">The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 11 (1), 64 (2018).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).</li><li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).</li><li>Mount, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+antitumor+efficacy+of+anti-GD2+CAR+T+cells+in+H3-K27M.">Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M.</a> Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).</li><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+classification+of+tumors+of+the+central+nervous+system:+A+summary.">The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Czabanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+adhesion+molecule-C+mediates+the+recruitment+of+embryonic-endothelial+progenitor+cells+to+the+perivascular+niche+during+tumor+angiogenesis.">Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).</li><li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy.">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li><li>Pankov&#225;, K., R&#246;sel, D., Novotn&#253;, M., Br&#225;bek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+of+transition+between+mesenchymal+and+amoeboid+invasiveness+in+tumor+cells.">The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li></ol>

L'immunocitochimica delle cellule 3D vive che abbiamo adottato qui per l'invasione e la migrazione del DMG pediatrico potrebbe essere facilmente adattata anche per altri tipi di cellule tumorali altamente invasive, comprese le linee cellulari di cancro al seno e al colon. 
A differenza dei saggi di immunocitochimica delle cellule 2D vive precedentemente eseguiti10, quando si lavora in 3D, si suggerisce di prestare attenzione ad alcuni passaggi critici. In particolare, p...

La capacità delle cellule tumorali di eludere e diffondersi attraverso il tessuto circostante è un segno distintivo del cancro1. In particolare, la motilità delle cellule tumorali è una caratteristica dei tumori maligni, sia che si tratti di un tipo di tumore metastatico come il cancro della mammella2 o del colon-retto3 o di un tipo localmente invasivo come il glioma diffuso 4,5.
L'imaging ha un ruolo centrale nello studio di molti aspetti dei fenotipi delle cellule tumorali; Tuttavia, l'imaging delle cellule vive è sicuramente da preferire quando si studiano processi cellulari dinamici come la migrazione e l'invasione, quando si verificano cambiamenti nella morfologia e nell'interazione cellula-cellula 6,7 e possono essere esaminati più facilmente nel tempo. Per l'imaging di cellule vive possono essere utilizzati diversi sistemi di microscopia ottica, dal contrasto di fase ai microscopi fluorescenti confocali, e l'acquisizione di immagini eseguita per un breve o lungo periodo di tempo su un microscopio invertito dotato di una camera per il controllo della temperatura e della CO2, o in sistemi di analisi delle immagini ad alto contenuto che hanno camere incorporate, o in alternativa in sistemi di immagini che possono stare nell'incubatore senza la necessità di disturbare le cellule durante l'intera durata dell'esperimento. La scelta del sistema utilizzato è spesso dettata da una serie di fattori quali la risoluzione necessaria, la durata del tempo e degli intervalli di tempo complessivi di acquisizione, il tipo di vaso utilizzato e la produttività del saggio (monocamera o piastra multipozzetto), la sensibilità delle cellule utilizzate (cellule preziose e/o rare) e la fototossicità delle cellule se sono presenti fluorofori.
Per quanto riguarda l'imaging fluorescente in modalità live, ciò può essere ottenuto trasducendo le cellule per l'espressione di proteine fluorescenti sia per l'espressione stabile che come sistema inducibile8, mediante trasfezione di cellule transitorie, o utilizzando coloranti cellulari che sono ora disponibili per l'etichettatura di cellule vive7, per il tracciamento di cellule vive e per l'etichettatura di organelli subcellulari9.
Un approccio utile è stato recentemente sviluppato per l'immunocitochimica delle cellule vive, in cui un anticorpo che riconosce un marcatore di superficie di scelta può essere legato a un reagente di marcatura e, dopo l'aggiunta ai terreni di coltura, le cellule che esprimono il marcatore specifico possono essere prontamente visualizzate in tempo reale mediante imaging di cellule vive. La visualizzazione e la quantificazione dell'espressione dei marcatori utilizzando un tale sistema possono essere facilmente ottenute quando le cellule sono coltivate in condizioni di coltura bidimensionale (2D)10.
In questo studio, abbiamo ottimizzato i protocolli per l'invasione immunocitochimica delle cellule immunocitochimiche 3D vive e la migrazione delle cellule derivate dai pazienti con glioma diffuso della linea mediana pediatrica (DMG)11,12. I DMG sono tumori cerebrali altamente aggressivi che colpiscono i bambini, per la stragrande maggioranza associati alla mutazione driver K27M nelle varianti H3 dell'istone. I DMG insorgono nel tronco encefalico e nelle regioni mediane del sistema nervoso centrale (SNC) e sono caratterizzati da una natura altamente infiltrativa. Questa capacità invasiva ha dimostrato di essere almeno in parte mediata dall'eterogeneità intratumorale e dalle caratteristiche simili a staminali tumorali delle cellule DMG7.
Per esemplificare i nostri test, è stato utilizzato un reagente di etichettatura anticorpale (ALR) in combinazione con un anticorpo per CD44. CD44 è una glicoproteina transmembrana e una molecola di adesione espressa sulle cellule staminali e su altri tipi di cellule, associata al fenotipo delle cellule staminali tumorali e alla migrazione e invasione delle cellule tumorali13. I protocolli includono la preparazione del campione, l'acquisizione di immagini in modalità brightfield e fluorescente e l'analisi su uno strumento di analisi di cellule vive che ha permesso di misurare quantitativamente in tempo reale l'espressione complessiva di CD44 sulla membrana cellulare DMG durante l'invasione e la migrazione 3D. I saggi hanno anche permesso di visualizzare il segnale fluorescente intermittente di CD44 su singole cellule durante la migrazione e l'invasione. È interessante notare che è stato osservato anche un effetto dell'anticorpo anti-CD44, che potenzialmente agendo come anticorpo bloccante, sembrava anche ridurre la migrazione e l'invasione cellulare, nonché indurre un passaggio del modello di invasione da un fenotipo mesenchimale collettivo a un fenotipo più simile all'ameboide a singola cellula.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3056D</td>
			<td>solution for neurosphere dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Mv medical</td>
			<td>FFL16034</td>
			<td>cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-44 (156-3C11)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3570</td>
			<td>Mouse mAb IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>4743</td>
			<td>Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>-</td>
			<td>The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>any inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Green Background Suppressor Reagent</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>6500-0045</td>
			<td>Backgroung suppressor reagent (BSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor stem cell (TSM) medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>growth cell medium (see reference in the text for details)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>7007</td>
			<td>size 96 well, round bottom clear</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma

La migrazione e l'invasione cellulare sono caratteristiche specifiche dei tumori mutanti H3K27M del glioma diffuso della linea mediana (DMG). Abbiamo già modellato queste caratteristiche utilizzando saggi di invasione e migrazione tridimensionali (3D) basati su cellule. In questo studio, abbiamo ottimizzato questi saggi 3D per l'immunocitochimica delle cellule vive. Un antibody labeling reagent è stato utilizzato per rilevare in tempo reale l'espressione della molecola di adesione CD44, sulla membrana plasmatica delle cellule migranti e invasive di una linea cellulare primaria DMG H3K27M derivata dal paziente. CD44 è associato al fenotipo delle cellule staminali tumorali e alla migrazione e invasione delle cellule tumorali ed è coinvolto nelle interazioni dirette con la matrice extracellulare del sistema nervoso centrale (SNC). Le neurosfere (NS) della linea cellulare DMG H3K27M sono state incorporate nella matrice della membrana basale (BMM) o posizionate su un sottile strato di rivestimento di BMM, in presenza di un anticorpo anti-CD44 in combinazione con il reagente di etichettatura degli anticorpi (ALR). L'analisi dell'immagine immunocitochimica delle cellule 3D vive è stata eseguita su uno strumento di analisi delle cellule vive per misurare quantitativamente l'espressione complessiva di CD44, in particolare sulle cellule migratorie e invasori. Il metodo consente inoltre di visualizzare in tempo reale l'espressione intermittente di CD44 sulla membrana plasmatica delle cellule migratorie e invasori. Inoltre, il test ha anche fornito nuove informazioni sul potenziale ruolo di CD44 nella transizione da mesenchimale ad ameboide nelle cellule DMG H3K27M.

Il protocollo di immunocitochimica delle cellule 3D vive per l'invasione e la migrazione è riassunto in un flusso di lavoro semplice e riproducibile nella Figura 1. Seminando le celle DMG in piastre a fondo tondo ULA a 96 pozzetti, si ottengono NS di dimensioni riproducibili e vengono utilizzate nei passaggi visualizzati. Quando i NS hanno raggiunto la dimensione ideale di ~300 μm (circa 4 giorni dopo la semina) vengono avviati i saggi di invasione12 e migrazione<su...

Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Questo studio presenta un protocollo di immunocitochimica delle cellule 3D vive applicato ad una linea cellulare di glioma diffuso pediatrico della linea mediana, utile per studiare in tempo reale l'espressione delle proteine sulla membrana plasmatica durante processi dinamici come l'invasione e la migrazione delle cellule 3D.

Saggi di immunocitochimica delle cellule 3D del glioma diffuso della linea mediana pediatrica

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Il glioma diffuso della linea mediana è un tumore cerebrale altamente invasivo. Questo metodo aiuta a studiare in tempo reale come le cellule DMG migrano e invadono in un contesto 3D con approfondimenti specifici sul ruolo potenziale di una molecola di adesione chiave. Utilizzando un reagente di marcatura e un anticorpo specifico anti-CD44, possiamo studiare mediante imaging cellulare vivo l'espressione di CD44 sulla membrana plasmatica sulle cellule DMG anche nella migrazione e invasione 3D.L'applicazione di questa tecnica ha evidenziato il potenziale ruolo di CD44 nella motilità di queste cellule, suggerendo che potrebbe rappresentare un bersaglio molecolare prezioso e invasivo. Per iniziare, reidratare l'ALR aggiungendo 100 microlitri di acqua sterile e mescolare la soluzione mediante pipettaggio. Mescolare l'anticorpo con l'ALR nel mezzo TSM in una piastra multipozzetto a fondo rotondo o in un tubo ambra e proteggerlo dalla luce.Preparare una quantità sufficiente di terreno per erogare 25 microlitri per pozzetto a tre volte la concentrazione finale del saggio e quindi incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Diluire BSR nel mezzo TSM a concentrazione di 1,5 millimolari per ottenere una concentrazione finale di 0,5 millimolari alla fine del test. Quindi rimuovere delicatamente e lentamente 75 microlitri del mezzo da ciascun pozzetto, evitando di toccare il fondo del pozzo dove si trova il NS e controllando visivamente la presenza del NS.Aggiungere delicatamente 25 microlitri del complesso anticorpale BSR e ALR a ciascun pozzetto e lasciare che il complesso anticorpale ALR si mescoli con il mezzo per due o tre minuti. Utilizzando un microscopio invertito, assicurarsi che ogni NS sia posizionato centralmente sul fondo del pozzo. Evitare la formazione di bolle rimuovendole con un ago.Mettere il piatto sul ghiaccio per cinque minuti per far raffreddare il fondo del piatto. Erogare 75 microlitri di BMM per pozzetto posizionando una punta P200 pre-raffreddata sulla parete interna del pozzetto, evitando la formazione di bolle e toccando il fondo del pozzetto. Lasciare la piastra sul ghiaccio per cinque minuti per lasciare che il BMM si mescoli con il mezzo.Utilizzando un microscopio invertito, controllare la posizione di NS. E se non presente centralmente, centrifugare la piastra a quattro gradi Celsius a 180 volte G per cinque minuti. Quindi trasferire la piastra nello strumento di analisi delle cellule vive posto all'interno dell'incubatore impostato a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità. Una volta che i pozzetti sono rivestiti con BMM, tagliare una punta P200.Prendi 50 microlitri del mezzo cellulare e NS da ciascun pozzetto selezionato e trasferiscilo in un pozzetto a fondo piatto rivestito. Controllare visivamente la presenza e la posizione del NS in ciascun pozzetto. Aggiungere delicatamente 50 microlitri di anticorpi BSR e ALR diluiti a ciascun pozzetto, aspettando due o tre minuti per lasciare che i reagenti si mescolino.E usando un microscopio invertito, assicurati che la maggior parte dei NS replicati siano situati centralmente nel pozzo. Dopo aver verificato l'assenza di bolle, trasferire delicatamente la piastra nello strumento di analisi delle cellule vive come dimostrato in precedenza. Sul software dello strumento di analisi delle cellule vive, selezionare l'opzione di pianificazione da acquisire, quindi fare clic sulla scheda più e selezionare scansione in programma per scansionare le lastre con intervalli come indicato nel manoscritto di testo.Nella finestra del software, creare o ripristinare la nave e quindi fare clic sull'opzione Nuovo. Selezionare il tipo di scansione sferoide, la fase più il campo luminoso, i canali di immagine verde per il test di invasione e l'obiettivo 4X. Selezionare la scansione di clonazione della diluizione, digitare 4X obiettivo e fase e verde per il test di migrazione.Selezionare il tipo di piastra e definire i pozzetti da scansionare evidenziandoli sulla mappa della piastra, quindi impostare la frequenza di scansione. Fare clic su Aggiungi a programma e avviare la scansione. Selezionare la scheda Crea nuova definizione di analisi.Quindi selezionare invasione sferoide o applicazione analizzatore di base per invasione e migrazione rispettivamente nella scheda. Selezionare i canali appropriati per l'invasione e la migrazione nel canale immagine. Selezionate alcune immagini rappresentative da tre a quattro pozzetti per visualizzare in anteprima e perfezionare l'impostazione di analisi.Per il saggio di invasione, nella scheda di definizione dell'analisi, regolare le impostazioni dell'applicazione nei canali brightfield e green con le impostazioni menzionate nel manoscritto di testo per generare una segmentazione precisa tra le cellule sferoidi e invasori. Per il test di migrazione, regolare le impostazioni dell'applicazione come indicato nel manoscritto di testo nei canali fase e verde per generare una segmentazione precisa tra la confluenza e le celle verdi. Verificare che le impostazioni di analisi siano corrette per il NS facendo clic in modo casuale su diversi pozzi.Selezionare i pozzi e i punti temporali da analizzare. Salvate la definizione dell'analisi e fate clic su Fine (Finish). Le immagini confocali immunofluorescenti rappresentative dell'espressione di CD44 in cellule derivate da pazienti DMG primari hanno dimostrato il ruolo di CD44 nella migrazione e nell'invasione cellulare.L'immunochimica delle cellule 3D dal vivo consente di visualizzare l'espressione di CD44. I fotogrammi rappresentativi del time lapse sia per la migrazione che per l'invasione mostrano la presenza e l'assenza del segnale fluorescente verde sulla stessa cellula osservata nel tempo, suggerendo che l'espressione di CD44 è accesa e spenta mentre le cellule migrano e invadono. I processi di migrazione e invasione sono seguiti per 96 ore, mostrando cellule QCTB-R059 con un alto livello di CD44.La quantificazione dell'espressione di CD44 e il suo aumento nel tempo è stata misurata dal segnale complessivo di fluorescenza verde associato all'ALR sia per la migrazione che per l'invasione. Quando l'anticorpo anti-CD44 viene utilizzato su cellule vive, influenza la morfologia cellulare, inducendo una transizione dall'invasione mesenchimale a quella ameboide e una riduzione della capacità invasiva e migratoria di queste cellule. Le fasi più critiche del metodo sono la miscelazione del reagente di etichettatura con un anticorpo, l'aggiunta della miscela al Matrigel e del mezzo e l'accesso allo strumento di imaging delle cellule vive.Questo metodo può essere ulteriormente implementato mediante l'uso di due o più reagenti e anticorpi marcatori distintivi per studiare l'interazione delle cellule DMG mediata da cellule dirette e contatto. Il nostro metodo offre nuovi strumenti per studiare in 3D i meccanismi cellulari e molecolari della migrazione e dell'invasione del DMG, fornendo nuove direzioni per inibire il loro fenotipo infiltrativo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Il trapianto di tumori del cervello pediatrico di Zebrafish in ospedali immunitario-competenti per uno studio a lungo termine del comportamento della cellula tumorale e della risposta ai farmaci

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

Whole-body PET/MRI dei pazienti pediatrici: I dettagli che contano

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Determinazione del livello di espressione della proteina in cellule coltivate di immunocitochimica su blocchi di paraffina celle

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Valutazione di biomarcatori in Glioma mediante immunoistochimica su paraffina 3D Glioma Neurosphere culture

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Imaging intravitale longitudinale del comportamento delle cellule tumorali cerebrali in risposta a una biopsia chirurgica invasiva

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Monitoraggio in tempo reale della migrazione delle cellule del Glioma umano sulle coculture di Asse-Olgon-Oligodendroce

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Analisi per la convalida degli inibitori dell'acetiltransferasi di Histone

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flusso di lavoro di screening rapido per identificare la potenziale terapia combinata per GBM utilizzando cellule staminali di glioma derivate dal paziente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...