Name: live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
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イメージングプロトコルの予備セットアップでIncuCyte S3ライブセルイメージングシステムにアクセスしてくださったSilvia Sodu博士とGiulia Federici博士(IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute、ローマ、イタリア)に感謝します。さらに、技術的なアドバイスを提供してくれたBernadett Kolozsvariに感謝します。この研究は、Children with Cancer UK助成金(16-234)とイタリア保健省Ricerca Correnteの支援を受けた。Mヴィンチは、小児がん英国フェローです。Rフェレッティは、フォンダツィオーネヴェロネーゼフェローシップ(2018年および2019年)の受賞者です。著者らは、Fondazione Healの支援と、クイーンズランド小児腫瘍バンクへの資金提供を行った小児病院財団に感謝しています。

このプロトコルは、機関の人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。
注:この研究は、Incucyte S3および/またはSX5生細胞分析機器(生細胞分析機器として参照)を使用して実施されました。
1. 再現性のあるサイズの腫瘍スフェロイドの作製
注:Vinci et al. 2015 7,12によって記述...

<ol>
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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+antitumor+efficacy+of+anti-GD2+CAR+T+cells+in+H3-K27M.">Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M.</a> Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).</li><li>Louis, D. 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今回採用した小児DMGの浸潤および遊走に採用した生3D細胞免疫細胞化学は、乳がんや結腸がんの細胞株など、他の高侵襲性腫瘍細胞にも容易に適応できます。 
以前に実施された生2D細胞免疫細胞化学アッセイ10とは異なり、3Dで作業する場合、いくつかの重要なステップに注意を払うことが示唆される。特に、ここで説明する浸潤アッセイでは、BMMを添?...

腫瘍細胞が周囲の組織を回避して拡散する能力は、癌の特徴です1。特に、腫瘍細胞の運動性は、乳房2や結腸直腸癌3などの転移性腫瘍型であろうと、びまん性神経膠腫4,5などの局所浸潤型であろうと、悪性腫瘍の特徴です。
イメージングは、腫瘍細胞の表現型の多くの側面の調査において中心的な役割を果たします。しかし、形態や細胞間相互作用の変化が起こり6,7、時間の経過とともにより簡単に調べることができる移動や浸潤などの動的な細胞プロセスを研究する場合は、生細胞イメージングが確実に好まれます。生細胞イメージングのために、位相差から共焦点蛍光顕微鏡まで、異なる光学顕微鏡システムを使用することができ、温度およびCO2制御用のチャンバーを備えた倒立顕微鏡、またはチャンバーを内蔵したハイコンテント画像解析システム、または全期間にわたって細胞を乱すことなくインキュベーター内に座ることができる画像システムにおいて、短期間または長期間にわたって画像取得を行うことができる実験の。使用するシステムの選択は、多くの場合、必要な分離能、全体的な取得時間と時間間隔の長さ、使用する容器の種類とアッセイのスループット(シングルチャンバーまたはマルチウェルプレート)、使用する細胞(貴細胞および/または希少細胞)の感度、蛍光色素が存在する場合の細胞の光毒性など、多くの要因によって決まります。
ライブモードでの蛍光イメージングに関しては、これは、安定した発現のために、または誘導可能なシステム8として蛍光タンパク質の発現のために細胞を形質導入することによって、一過性の細胞トランスフェクションによって、または生細胞標識7、生細胞追跡および細胞内オルガネラ9の標識のために現在利用可能な細胞色素を使用することによって達成することができる。
生細胞免疫細胞化学に有用なアプローチが最近開発されており、選択した表面マーカーを認識する抗体を標識試薬に結合させ、培地に添加すると、特異的マーカーを発現する細胞を生細胞イメージングによってリアルタイムで容易にイメージングできます。このようなシステムを用いたマーカー発現の可視化および定量化は、細胞が2次元(2D)培養条件下で増殖する場合に容易に達成することができる10。
この研究では、小児びまん性正中線神経膠腫(DMG)患者由来の細胞の生3D細胞免疫細胞化学の侵入と遊走のためのプロトコルを最適化しました11,12。DMGは、小児に影響を及ぼす非常に侵攻性の高い脳腫瘍であり、大多数はヒストンH3変異体におけるドライバー変異K27Mに関連する。DMGは、脳幹および中枢神経系(CNS)の正中線領域に発生し、非常に浸潤性の性質を特徴としています。この浸潤能力は、少なくとも部分的には、腫瘍内不均一性およびDMG細胞の癌幹様特徴によって媒介されることが示されている7。
アッセイを例示するために、抗体標識試薬(ALR)をCD44に対する抗体と組み合わせて使用しました。CD44は、幹細胞および他の細胞型に発現する膜貫通糖タンパク質および接着分子であり、癌幹細胞表現型ならびに腫瘍細胞の移動および浸潤に関連する13。プロトコルには、サンプル調製、明視野および蛍光モードでの画像取得、および3D侵入および遊走中のDMG細胞膜上の全体的なCD44発現をリアルタイムで定量的に測定できる生細胞分析装置での解析が含まれます。アッセイはまた、遊走および浸潤中の個々の細胞上のCD44の断続的な蛍光シグナルを視覚化する可能性を可能にしました。興味深いことに、抗CD44抗体の効果も観察され、これは潜在的にブロッキング抗体として作用し、細胞の移動と浸潤を減少させるだけでなく、集合間葉様からより単一細胞アメーバ様表現型への浸潤パターンの切り替えを誘導するようでした。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3056D</td>
			<td>solution for neurosphere dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Mv medical</td>
			<td>FFL16034</td>
			<td>cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-44 (156-3C11)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3570</td>
			<td>Mouse mAb IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>4743</td>
			<td>Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>-</td>
			<td>The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>any inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Green Background Suppressor Reagent</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>6500-0045</td>
			<td>Backgroung suppressor reagent (BSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor stem cell (TSM) medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>growth cell medium (see reference in the text for details)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>7007</td>
			<td>size 96 well, round bottom clear</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma

細胞の移動と浸潤は、びまん性正中線神経膠腫(DMG)H3K27M変異腫瘍の特定の特徴です。これらの特徴は、3次元(3D)細胞ベースの浸潤および遊走アッセイを使用してすでにモデル化されています。本研究では、これらの3Dアッセイを生細胞免疫細胞化学用に最適化しました。抗体標識試薬を使用して、DMG H3K27M初代患者由来細胞株の遊走細胞および浸潤細胞の原形質膜上の接着分子CD44の発現をリアルタイムで検出しました。CD44は、癌幹細胞の表現型および腫瘍細胞の移動および浸潤に関連しており、中枢神経系(CNS)細胞外マトリックスとの直接的な相互作用に関与しています。DMG H3K27M細胞株由来のニューロスフェア(NS)を、抗体標識試薬(ALR)と併せて抗CD44抗体の存在下で、基底膜マトリックス(BMM)に埋め込むか、またはBMMの薄いコーティング層上に配置した。生細胞解析装置で生3D細胞免疫細胞化学画像解析を行い、CD44発現全体、特に遊走細胞と浸潤細胞を定量的に測定しました。この方法はまた、遊走および浸潤する細胞の原形質膜上のCD44の間欠的発現をリアルタイムで視覚化することを可能にする。さらに、このアッセイは、DMG H3K27M細胞の間葉系からアメーバへの移行におけるCD44の潜在的な役割に関する新しい洞察も提供しました。

浸潤と遊走のためのLive-3D-Cell免疫細胞化学プロトコルは、 図1の簡単で再現性のあるワークフローにまとめられています。DMG細胞をULA 96ウェル丸底プレートに播種することにより、再現可能なサイズのNSが得られ、表示されたステップで使用されます。NSが理想的なサイズである~300 μmに達すると(播種後約4日)、侵入12 および遊走14 ア?...

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Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

この研究は、小児びまん性正中線グリオーマ細胞株に適用される生3D細胞免疫細胞化学のプロトコルを提示し、3D細胞の浸潤や遊走などの動的プロセス中の原形質膜上のタンパク質の発現をリアルタイムで研究するのに役立ちます。

小児びまん性正中線神経膠腫の生3D細胞免疫細胞化学アッセイ

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

びまん性正中線神経膠腫は、浸潤性の高い脳腫瘍です。この方法は、DMG細胞がどのように移動および侵入するかを3Dコンテキストでリアルタイムで研究し、重要な接着分子の潜在的な役割に関する特定の洞察を得るのに役立ちます。標識試薬と抗CD44特異的抗体を用いることで、DMG細胞上の原形質膜上のCD44の発現を3D遊走・浸潤においても生細胞イメージングにより研究することができます。この技術の適用は、これらの細胞の運動性におけるCD44の潜在的な役割を強調し、それが貴重で侵襲的な分子標的を表す可能性があることを示唆しています。まず、100マイクロリットルの滅菌水を加えてALRを再水和し、ピペッティングで溶液を混合します。丸底マルチウェルプレートまたは琥珀色のチューブでTSM培地中のALRと抗体を混合し、光から保護します。ウェルあたり25マイクロリットルを最終アッセイ濃度の3倍で分注するのに十分な量の培地を調製し、室温で15分間インキュベートします。TSM培地でBSRを1.5ミリモル濃度で希釈し、アッセイ終了時に0.5ミリモルの最終濃度を得た。次に、NSが置かれているウェルの底に触れないようにし、NSの存在を目視で確認しながら、各ウェルから75マイクロリットルの培地を穏やかかつゆっくりと取り出します。25マイクロリットルのBSRおよびALR抗体複合体を各ウェルに穏やかに添加し、ALR抗体複合体を培地と2〜3分間混合させます。倒立顕微鏡を使用して、各NSがウェルの底の中央に配置されていることを確認します。針を使用して気泡を除去することにより、気泡の形成を回避します。プレートを氷の上に5分間置き、プレートの底を冷たくします。予冷したP200チップをウェルの内壁に配置し、気泡の形成を避け、ウェルの底に触れることにより、ウェルあたり75マイクロリットルのBMMを分注します。プレートを氷の上に5分間置いて、BMMを培地と混合させます。倒立顕微鏡を用いて、NSの位置を確認します。また、中央に存在しない場合は、プレートを摂氏4度で180倍Gで5分間遠心分離します。次に、摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度95%に設定されたインキュベーター内に置かれた生細胞分析装置にプレートを移します。ウェルがBMMでコーティングされたら、P200チップを切断します。選択した各ウェルから50マイクロリットルの細胞培地とNSを取り出し、コーティングされた平底ウェルに移します。各ウェルにおけるNSの存在及び位置を目視で確認する。希釈したBSRおよびALR抗体50マイクロリットルを各ウェルに静かに加え、試薬が混合されるまで2〜3分待ちます。また、倒立顕微鏡を使用して、複製NSのほとんどがウェルの中央に配置されていることを確認します。気泡がないことを確認した後、前述のように、生細胞分析装置にプレートを静かに移します。生細胞解析装置ソフトウェアで、取得するスケジュールオプションを選択し、プラスタブをクリックしてスキャンオンスケジュールを選択し、テキスト原稿に記載されている間隔でプレートをスキャンします。ソフトウェアウィンドウで、船舶を作成または復元し、[新規]オプションをクリックします。スフェロイドスキャンタイプ、位相と明視野、侵襲アッセイ用の緑色の画像チャンネル、および4X対物レンズを選択します。希釈クローニングスキャン、タイプ4X対物レンズ、および移行アッセイ用のフェーズとグリーンを選択します。プレートタイプを選択し、プレートマップ上でスキャンするウェルを強調表示して定義し、スキャン頻度を設定します。[スケジュールに追加]をクリックして、スキャンを開始します。[新しい解析定義の作成]タブを選択します。次に、タブでそれぞれ侵入と移動のためのスフェロイド侵入または基本的なアナライザーアプリケーションを選択します。イメージ チャネルで侵入および移行に適したチャネルを選択します。3 つから 4 つのウェルからいくつかの代表的な画像を選択して、解析設定をプレビューおよび調整します。浸潤アッセイでは、解析定義タブで、明視野チャンネルとグリーンチャンネルのアプリケーション設定をテキスト原稿に記載されている設定で調整し、スフェロイド細胞と浸潤細胞の間に正確なセグメンテーションを生成します。遊走アッセイでは、フェーズチャネルとグリーンチャンネルのテキスト原稿に記載されているようにアプリケーション設定を調整して、コンフルエンスセルとグリーンセルの間に正確なセグメンテーションを生成します。複数のウェルをランダムにクリックして、NSの分析設定が正しいことを確認します。分析するウェルと時点を選択します。解析定義を保存し、[完了]をクリックします。初代DMG患者由来の細胞におけるCD44発現の代表的な免疫蛍光共焦点画像は、細胞の移動および浸潤におけるCD44の役割を実証した。ライブ3D細胞免疫化学により、CD44発現を視覚化することができます。遊走と浸潤の両方の時間経過の代表的なフレームは、経時的に観察された同じ細胞上の緑色蛍光シグナルの有無を示しており、細胞が遊走および浸潤している間、CD44の発現がオンとオフであることを示唆しています。遊走および浸潤過程を96時間にわたって追跡し、高レベルのCD44を有するQCTB-R059細胞を示す。CD44発現の定量化および経時的なその増加は、遊走および浸潤の両方についてALRに関連する全体的な緑色蛍光シグナルによって測定された。抗CD44抗体を生細胞に使用すると、細胞形態に影響を及ぼし、間葉様からアメーバ様の浸潤への移行を誘導し、これらの細胞の浸潤および遊走能力を低下させます。この方法の最も重要なステップは、標識試薬と抗体の混合、マトリゲルおよび培地への混合物の添加、および生細胞イメージング装置へのアクセスです。この方法は、直接細胞および接触によって媒介されるDMG細胞相互作用を調べるために2つ以上の特徴的な標識試薬および抗体を使用することによってさらに実施することができる。私たちの方法は、DMGの移動と侵入の細胞および分子メカニズムを3Dで調査するための新しいツールを提供し、それらの浸潤表現型を阻害するための新しい方向性を提供します。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

びまん性内因橋膠腫の迅速な死後の細胞培養のためのプロトコル（DIPG）

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

小児患者の全身 PET ・ MRI: 重要な詳細

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

セルのパラフィン包埋ブロックの免疫細胞化学による培養細胞の蛋白質発現レベルの定量

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Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

パラフィン埋め込まれた 3 D 神経膠腫 Neurosphere 文化に免疫組織化学による神経膠腫におけるバイオ マーカーの評価

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Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

侵襲性外科生検に対する脳腫瘍細胞行動の縦腔内イメージング

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

後根神経節軸軸索-オリゴデンドロサイト共培養におけるヒトグリオーマ細胞移動のリアルタイムモニタリング

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Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

ヒストンアセチルトランスビセラーゼ阻害剤の検証のためのアッセイ

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A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

患者由来グリオーマ幹細胞を用いたGBMの潜在的併用療法を同定するための迅速スクリーニングワークフロー

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