Name: live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Vi takker Dr. Silvia Soddu og Dr. Giulia Federici (Unit of Cellular Networks and Molecular Therapeutic Targets, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Roma, Italia) for tilgang til IncuCyte S3 Live Cell Imaging System i det foreløpige oppsettet av bildebehandlingsprotokollen. Videre takker vi Bernadett Kolozsvari for de tekniske rådene. Studien ble støttet av Children with Cancer UK grant (16-234) og Det italienske helsedepartementet Ricerca Corrente. M Vinci er en barn med kreft UK Fellow. R Ferretti er mottaker av Fondazione Veronesi Fellowship (2018 og 2019). Forfatterne anerkjenner Fondazione Heal for deres støtte og Children's Hospital Foundation for finansiering av Queensland Children's Tumor Bank.

Denne protokollen følger retningslinjene til institusjonenes humane forskningsetiske komiteer.
MERK: Denne studien ble utført med Incucyte S3 og/eller SX5 Live-Cell Analysis Instrument (referert til som live cell analysis instrument).
1. Generering av reproduserbare størrelse tumor sfæroider
MERK: Protokollen (seksjon 1) beskrevet av Vinci et al. 2015 7,12, ble brukt som rapportert ned...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).</li><li>Magr&#236;, A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+early+metastatic+seeding+occur+in+colorectal+cancer.">Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Caretti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+spread+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).</li><li>Pericoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+multiple+platforms+for+the+analysis+of+multifluorescent+marking+technology+applied+to+pediatric+GBM+and+DIPG.">Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+and+cooperativity+between+subclonal+populations+of+pediatric+glioblastoma+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+cells.">Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).</li><li>Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lentiviral-inducible+transgene+expression+systems+and+versatile+single-plasmid+reporters+for+in+vitro+and+in+vivo+cancer+biology+studies.">Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).</li><li>Huang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-regulated+ROS+from+xanthine+oxidase+acts+as+an+early+effector+for+triggering+late+mitochondria-dependent+apoptosis+in+cathepsin+s-targeted+tumor+cells.">Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells.</a> PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).</li><li>Prudner, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+starvation+and+docetaxel+induce+c-Myc-driven+hENT1+surface+expression+to+overcome+gemcitabine+resistance+in+ASS1-negative+tumors.">Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).</li><li>Ferretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+invasion+into+Matrigel:+optimized+protocol+for+RNA+extraction.">Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction.</a> Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+role+of+CD44+in+cancer+progression:+therapeutic+implications.">The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 11 (1), 64 (2018).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).</li><li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).</li><li>Mount, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+antitumor+efficacy+of+anti-GD2+CAR+T+cells+in+H3-K27M.">Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M.</a> Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).</li><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+classification+of+tumors+of+the+central+nervous+system:+A+summary.">The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Czabanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+adhesion+molecule-C+mediates+the+recruitment+of+embryonic-endothelial+progenitor+cells+to+the+perivascular+niche+during+tumor+angiogenesis.">Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).</li><li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy.">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li><li>Pankov&#225;, K., R&#246;sel, D., Novotn&#253;, M., Br&#225;bek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+of+transition+between+mesenchymal+and+amoeboid+invasiveness+in+tumor+cells.">The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li></ol>

Den levende 3D-celle immunocytokjemi vi har vedtatt her for pediatrisk DMG invasjon og migrasjon kan lett tilpasses også for andre svært invasive tumorcelletyper, inkludert bryst- og tykktarmskreftcellelinjer. 
Forskjellig fra tidligere utførte live-2D-celle immunocytokjemiske analyser10, når du arbeider i 3D, anbefales det å være oppmerksom på noen kritiske trinn. Spesielt for invasjonsanalysen vi beskriver, anbefales det å tilsette ALR/antistoffblandingen dire...

Tumorcellers evne til å unnslippe og spre seg gjennom det omkringliggende vevet er et kjennetegn på kreft1. Spesielt er tumorcellemotilitet et karakteristisk trekk ved ondartede svulster, enten det er en metastatisk tumortype som bryst2 eller kolorektal kreft3 eller en lokalt invasiv type som diffus gliom 4,5.
Avbildning har en sentral rolle i undersøkelsen av mange aspekter av tumorcellefenotyper; Imidlertid er levende celleavbildning definitivt å foretrekke når man studerer dynamiske cellulære prosesser som migrasjon og invasjon, når endringer i morfologi og celle-celleinteraksjon 6,7 forekommer og lettere kan undersøkes over tid. For levende celleavbildning kan forskjellige optiske mikroskopisystemer brukes, fra fasekontrast til konfokale fluorescerende mikroskoper, og bildeinnsamling utført over kort eller lang tid på et invertert mikroskop utstyrt med et kammer for temperatur og CO2-kontroll, eller i bildeanalysesystemer med høyt innhold som har innebygde kamre, eller alternativt i bildesystemer som kan sitte i inkubatoren uten å måtte forstyrre cellene under hele varigheten av eksperimentet. Valget av systemet som brukes dikteres ofte av en rekke faktorer som nødvendig oppløsning, lengden på den totale innsamlingstiden og tidsintervallene, fartøytypen som brukes og gjennomstrømningen av analysen (enkeltkammer eller flerbrønnsplate), følsomheten til cellene som brukes (dyrebare og / eller sjeldne celler) og fototoksisitet av cellene hvis fluoroforer er tilstede.
Med hensyn til fluorescerende avbildning i levende modus, kan dette oppnås ved å transducere celler for ekspresjon av fluorescerende proteiner enten for stabilt uttrykk eller som et induserbart system8, ved forbigående celletransfeksjon, eller ved å bruke cellefargestoffer som nå er tilgjengelige for live-cellemerking7, for live-cellesporing samt for merking av subcellulære organeller9.
En nyttig tilnærming har nylig blitt utviklet for levende celle immunocytokjemi, hvor et antistoff som gjenkjenner en overflatemarkør av valg kan bindes til et merkingsreagens, og ved tillegg til kulturmediet kan celler som uttrykker den spesifikke markøren lett avbildes i sanntid ved levende celleavbildning. Visualisering og kvantifisering av markøruttrykk ved hjelp av et slikt system kan lett oppnås når celler dyrkes i todimensjonale (2D) kulturforhold10.
I denne studien optimaliserte vi protokoller for live-3D-celle immunocytokjemisk invasjon og migrasjon av pediatrisk diffus midtlinjegliom (DMG) pasientavledede celler11,12. DMG er svært aggressive hjernesvulster som rammer barn, for de aller fleste assosiert med drivermutasjonen K27M i histon H3-varianter. DMG oppstår i hjernestammen og midtlinjeområdene i sentralnervesystemet (CNS) og er preget av en svært infiltrerende natur. Denne invasive kapasiteten har vist seg å være i det minste delvis mediert av intratumorheterogeniteten og kreftstammelignende egenskaper av DMG-celler7.
For å eksemplifisere våre analyser ble det brukt et antistoffmerkingsreagens (ALR) i kombinasjon med et antistoff mot CD44. CD44 er et transmembrant glykoprotein og adhesjonsmolekyl uttrykt på stamcelle og andre celletyper, assosiert med kreftstamcellefenotype og tumorcellemigrasjon og invasjon13. Protokollene inkluderer prøvepreparering, bildeoppkjøp i lysfelt og fluorescerende modus, og analysen på et levende celleanalyseinstrument som tillot å kvantitativt måle i sanntid det totale CD44-uttrykket på DMG-cellemembranen under 3D-invasjon og migrasjon. Analysene tillot også muligheten til å visualisere det intermitterende fluorescerende signalet av CD44 på individuelle celler mens de migrerte og invaderte. Interessant nok ble det også observert en effekt av anti-CD44-antistoffet, som potensielt virket som et blokkerende antistoff, også syntes å redusere cellemigrasjon og invasjon, samt å indusere en endring av invasjonsmønsteret fra en kollektiv mesenkymallignende til en mer encellet amoeboid-lignende fenotype.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3056D</td>
			<td>solution for neurosphere dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Mv medical</td>
			<td>FFL16034</td>
			<td>cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-44 (156-3C11)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3570</td>
			<td>Mouse mAb IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>4743</td>
			<td>Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>-</td>
			<td>The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>any inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Green Background Suppressor Reagent</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>6500-0045</td>
			<td>Backgroung suppressor reagent (BSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor stem cell (TSM) medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>growth cell medium (see reference in the text for details)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>7007</td>
			<td>size 96 well, round bottom clear</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma

Cellemigrasjon og invasjon er spesifikke kjennetegn på diffus midtlinjegliom (DMG) H3K27M-muterte svulster. Vi har allerede modellert disse funksjonene ved hjelp av tredimensjonale (3D) cellebaserte invasjons- og migrasjonsanalyser. I denne studien har vi optimalisert disse 3D-analysene for live-celle immunocytokjemi. Et antistoffmerkingsreagens ble brukt til å oppdage i sanntid ekspresjonen av adhesjonsmolekylet CD44, på plasmamembranen til migrerende og invaderende celler i en DMG H3K27M primær pasientavledet cellelinje. CD44 er assosiert med kreft stamcellefenotype og tumorcellemigrasjon og invasjon og er involvert i direkte interaksjoner med sentralnervesystemet (CNS) ekstracellulær matriks. Neurospheres (NS) fra DMG H3K27M-cellelinjen ble innebygd i basalmembranmatrisen (BMM) eller plassert på et tynt belegglag av BMM, i nærvær av et anti-CD44-antistoff i forbindelse med antistoffmerkingsreagenset (ALR). Den levende 3D-celle immunocytokjemiske bildeanalysen ble utført på et live-celleanalyseinstrument for kvantitativt å måle det totale CD44-uttrykket, spesielt på de migrerende og invaderende cellene. Metoden tillater også visualisering i sanntid av intermitterende ekspresjon av CD44 på plasmamembranen til migrerende og invaderende celler. Videre ga analysen også ny innsikt i den potensielle rollen til CD44 i mesenkymal til amoeboidovergang i DMG H3K27M-celler.

Live-3D-Cell Immunocytochemistry-protokoll for invasjon og migrasjon er oppsummert i en enkel og reproduserbar arbeidsflyt i figur 1. Ved såing av DMG-cellene i ULA 96-brønns rundbunnsplater, oppnås reproduserbar størrelse NS og brukes i trinnene som vises. Når NS har nådd den ideelle størrelsen på ~300 μm (ca. 4 dager etter såing), startes invasjon12 og migrasjon14-analyser . Tilsetningen av ALR / antistoffkomplekset sammen med bakgr...

Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Denne studien presenterer en protokoll for live-3D-celle immunocytokjemi anvendt på en pediatrisk diffus midtlinje gliomcellelinje, nyttig for å studere i sanntid uttrykket av proteiner på plasmamembranen under dynamiske prosesser som 3D-celleinvasjon og migrasjon.

Live-3D-celle immunocytokjemi analyser av pediatrisk diffus midtlinje gliom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Diffus midline glioma er en svært invasiv hjernesvulst. Denne metoden bidrar til å studere i sanntid hvordan DMG-celler migrerer og invaderer i en 3D-kontekst med spesifikk innsikt i den potensielle rollen til et nøkkeladhesjonsmolekyl. Ved å bruke et merkingsreagens og et spesifikt antistoff-anti-CD44, kan vi studere ved levende celleavbildning uttrykket av CD44 på plasmamembran på DMG-cellene også i 3D-migrasjon og invasjon.Anvendelsen av denne teknikken fremhevet CD44s potensielle rolle i motiliteten til disse cellene, noe som tyder på at den kan representere et verdifullt og invasivt molekylært mål. For å begynne, rehydrer ALR ved å tilsette 100 mikroliter sterilt vann og bland løsningen ved pipettering. Bland antistoffet med ALR i TSM-mediet i en rund bunn flerbrønnsplate eller i et gult rør og beskytt det mot lys.Forbered nok mengde av mediet til å dispensere 25 mikroliter per brønn ved tre ganger endelig analysekonsentrasjon og inkuber deretter ved romtemperatur i 15 minutter. Fortynn BSR i TSM-mediet ved 1,5 millimolar konsentrasjon for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,5 millimolar ved slutten av analysen. Fjern deretter forsiktig og sakte 75 mikroliter av mediet fra hver brønn, unngå å berøre bunnen av brønnen der NS sitter og kontrollere tilstedeværelsen av NS visuelt.Tilsett forsiktig 25 mikroliter av BSR- og ALR-antistoffkomplekset til hver brønn og la ALR-antistoffkomplekset blandes med mediet i to til tre minutter. Bruk et invertert mikroskop, sørg for at hver NS er sentralt plassert i bunnen av brønnen. Unngå dannelse av bobler ved å fjerne dem med en nål.Legg tallerkenen på is i fem minutter for å la bunnen av tallerkenen bli kald. Dispenser 75 mikroliter BMM per brønn ved å plassere en forkjølt P200-spiss på brønnens indre vegg, unngå bobledannelse og berøre bunnen av brønnen. La platen ligge på is i fem minutter for å la BMM-en blandes med mediet.Bruk et invertert mikroskop, sjekk plasseringen av NS. Og hvis den ikke er til stede sentralt, sentrifugerer du platen ved fire grader Celsius ved 180 ganger G i fem minutter. Overfør deretter platen i live-celleanalyseinstrumentet plassert i inkubatorsettet ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid og 95% fuktighet. Når brønnene er belagt med BMM, kutt en P200-spiss.Ta 50 mikroliter av cellemediet og NS fra hver valgt brønn og overfør den til en belagt flatbunnsbrønn. Kontroller tilstedeværelsen og posisjonen til NS i hver brønn visuelt. Tilsett forsiktig 50 mikroliter av det fortynnede BSR- og ALR-antistoffet til hver brønn, og vent i to til tre minutter for å la reagensene blande seg.Og ved hjelp av et invertert mikroskop, sørg for at det meste av replikerende NS er sentralt plassert i brønnen. Etter å ha sikret fravær av bobler, overfør platen forsiktig i instrumentet for levende celleanalyse som vist tidligere. På programvaren for live celleanalyseinstrument velger du alternativplanen du vil anskaffe, deretter klikker du på plussfanen og velger skann etter planen for å skanne platene med intervaller som nevnt i tekstmanuskriptet.I programvarevinduet, opprett eller gjenopprett fartøy og klikk deretter på alternativet Ny. Velg sfæroidskanningstype, fase pluss lysstyrkefelt, grønne bildekanaler for invasjonsanalysen og 4X-mål. Velg fortynningskloningsskanning, type 4X-mål og fase og grønn for overføringsanalysen.Velg platetype og definer brønnene som skal skannes ved å merke dem på platekartet, og deretter sette opp skannefrekvensen. Klikk på Legg til i tidsplan og start skanningen. Velg fanen Opprett ny analysedefinisjon.Velg deretter henholdsvis sfæroid invasjon eller grunnleggende analysatorapplikasjon for invasjon og migrasjon på fanen. Velg de aktuelle kanalene for invasjon og flytting i bildekanalen. Velg noen få representative bilder fra tre til fire brønner for forhåndsvisning og finjustering av analyseinnstillingen.For invasjonsanalysen, i analysedefinisjonsfanen, juster applikasjonsinnstillingene i lysfeltet og grønne kanaler med innstillingene nevnt i tekstmanuskriptet for å generere en presis segmentering mellom sfæroid- og invaderende celler. For migreringsanalyse, juster applikasjonsinnstillingene som nevnt i tekstmanuskriptet i fase- og grønne kanaler for å generere en presis segmentering mellom sammenløp og grønne celler. Sjekk at analyseinnstillingene er riktige for NS ved å klikke tilfeldig på flere brønner.Velg brønnene og tidspunktene som skal analyseres. Lagre analysedefinisjonen og klikk på Fullfør. De representative immunfluorescerende konfokale bildene av CD44-uttrykk i primære DMG-pasientavledede celler demonstrerte CD44s rolle i cellemigrasjon og invasjon.Den levende 3D-celleimmunokjemien gjør det mulig å visualisere CD44-uttrykk. De representative rammene for tidsforløpet for både migrasjon og invasjon viser tilstedeværelsen og fraværet av det grønne fluorescerende signalet på samme celle observert over tid, noe som tyder på at uttrykket av CD44 er av og på mens celler migrerer og invaderer. Migrasjons- og invasjonsprosessene følges over 96 timer, og viser QCTB-R059-celler med høyt nivå av CD44.Kvantifiseringen av CD44-ekspresjon og dens økning over tid ble målt ved det samlede grønne fluorescenssignalet assosiert med ALR for både migrasjon og invasjon. Når anti-CD44-antistoffet brukes på levende celler, påvirker det cellemorfologien, induserer en overgang fra mesenkymallignende til amoeboidlignende invasjon og en reduksjon av den invasive og migrerende kapasiteten til disse cellene. Det mest kritiske trinnet i metoden er blanding av merkingsreagens med et antistoff, tilsetning av blandingen til Matrigel og mediet, og tilgang til levende celleavbildningsinstrument.Denne metoden kan implementeres videre ved bruk av to eller flere karakteristiske merkingsreagenser og antistoffer for å undersøke DMG-celleinteraksjonen mediert av direkte celler og kontakt. Vår metode gir nye verktøy for å undersøke i 3D de cellulære og molekylære mekanismene for DMG-migrasjon og invasjon, og gir nye retninger for å hemme deres infiltrative fenotype.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

En protokoll for Rapid Post mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantasjon av Zebrafish Pediatric Brain Tumors til Immun-kompetente verter for langvarig studie av Tumor Cell Behavior og Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

Hele kroppen PET/MRI av pediatriske pasienter: detaljene som rolle

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Fastsettelse av Protein uttrykk nivå i kulturperler celler av Immunocytochemistry på parafin-embedded celleblokker

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Evaluering av Biomarkers i Glioma av immunhistokjemi på parafin-Embedded 3D Glioma Neurosphere kulturer

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Langsgående Intravital Imaging av Brain tumor Cell atferd som svar på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Real-Time overvåking av Human glioma Cell migrasjon på rygg rot Ganglion axon-Oligodendrocyte co-kulturer

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Analyser for validering av histone acetyltransferasehemmere

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

En arbeidsflyt for rask screening for å identifisere potensiell kombinasjonsterapi for GBM ved bruk av pasientavledede gliomastammeceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...