Name: live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
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Gostaríamos de agradecer à Dra. Silvia Soddu e à Dra. Giulia Federici (Unidade de Redes Celulares e Alvos Terapêuticos Moleculares, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Roma, Itália) pelo acesso ao IncuCyte S3 Live Cell Imaging System na configuração preliminar do protocolo de imagem. Além disso, agradecemos a Bernadett Kolozsvari pela assessoria técnica. O estudo foi apoiado pela bolsa Children with Cancer UK (16-234) e pelo Ministério da Saúde italiano Ricerca Corrente. M Vinci é bolsista da Children with Cancer UK. R Ferretti recebeu a bolsa Fondazione Veronesi (2018 e 2019). Os autores agradecem à Fondazione Heal por seu apoio e à Children's Hospital Foundation pelo financiamento do Queensland Children's Tumor Bank.

Este protocolo segue as diretrizes dos comitês de ética em pesquisa com seres humanos das instituições.
NOTA: Este estudo foi realizado utilizando o Incucyte S3 e/ou SX5 Live-Cell Analysis Instrument (referenciado como instrumento de análise de células vivas).
1. Geração de esferoides tumorais de tamanho reprodutível
NOTA: O protocolo (seção 1) descrito por Vinci et al., 2015 7,12</su...

<ol>
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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+antitumor+efficacy+of+anti-GD2+CAR+T+cells+in+H3-K27M.">Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M.</a> Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).</li><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+classification+of+tumors+of+the+central+nervous+system:+A+summary.">The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Czabanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+adhesion+molecule-C+mediates+the+recruitment+of+embryonic-endothelial+progenitor+cells+to+the+perivascular+niche+during+tumor+angiogenesis.">Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).</li><li>Pardoll, D. 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A imunocitoquímica de células vivas 3D que adotamos aqui para invasão e migração de DMG pediátrica pode ser facilmente adaptada também para outros tipos de células tumorais altamente invasivas, incluindo linhagens de células de câncer de mama e cólon. 
Diferentemente dos ensaios de imunocitoquímica de células vivas2D previamente realizados 10, quando se trabalha em 3D, sugere-se atentar para algumas etapas críticas. Em particular, para o ensaio de invasão...

A capacidade das células tumorais de evadir e disseminar-se através do tecido circundante é uma característica do câncer1. Em particular, a motilidade das células tumorais é uma característica dos tumores malignos, seja um tipo de tumor metastático, comoo câncer de mama2 ou colorretal3, ou um tipo localmente invasivo, como o gliomadifuso4,5.
Os exames de imagem têm um papel central na investigação de muitos aspectos dos fenótipos de células tumorais; No entanto, a imagem de células vivas é definitivamente preferida quando se estudam processos celulares dinâmicos, como migração e invasão, quando ocorrem mudanças na morfologia e na interaçãocélula-célula6,7 e podem ser mais facilmente examinadas ao longo do tempo. Para imagens de células vivas, diferentes sistemas de microscopia óptica podem ser usados, desde contraste de fase até microscópios confocais fluorescentes, e aquisição de imagens realizadas por um curto ou longo período de tempo em um microscópio invertido equipado com uma câmara para controle de temperatura e CO2, ou em sistemas de análise de imagem de alto conteúdo que possuem câmaras embutidas, ou alternativamente em sistemas de imagem que podem ficar na incubadora sem a necessidade de perturbar as células durante toda a duração do experimento. A escolha do sistema utilizado é frequentemente ditada por uma série de fatores, tais como a resolução necessária, a duração do tempo total de aquisição e intervalos de tempo, o tipo de vaso utilizado e o rendimento do ensaio (câmara única ou placa de poço múltiplo), a sensibilidade das células utilizadas (células preciosas e/ou raras) e a fototoxicidade das células se fluoroforóricos estiverem presentes.
No que diz respeito à imagem fluorescente em modo vivo, isso pode ser obtido pela transdução de células para a expressão de proteínas fluorescentes para expressão estável ou como um sistema induzível8, por transfecção celular transitória ou pelo uso de corantes celulares que agora estão disponíveis para marcação de células vivas7, para rastreamento de células vivas e para marcação de organelas subcelulares9.
Uma abordagem útil foi recentemente desenvolvida para imunocitoquímica de células vivas, onde um anticorpo reconhecendo um marcador de superfície de escolha pode ser ligado a um reagente de marcação e, após adição ao meio de cultura, as células que expressam o marcador específico podem ser prontamente imageadas em tempo real por imagens de células vivas. A visualização e quantificação da expressão de marcadores por este sistema podem ser facilmente obtidas quando as células são cultivadas em condições de cultura bidimensional (2D)10.
Neste estudo, otimizamos protocolos para invasão imunocitoquímica de células vivas 3D e migração de células pediátricas derivadas de glioma difuso da linha média (DMG)do paciente 11,12. DMG são tumores cerebrais altamente agressivos que afetam crianças, para a grande maioria associados com a mutação condutora K27M em variantes de histona H3. As DMG surgem no tronco cerebral e nas regiões da linha média do sistema nervoso central (SNC) e são caracterizadas por uma natureza altamente infiltrativa. Demonstrou-se que essa capacidade invasiva é, pelo menos em parte, mediada pela heterogeneidade intratumoral e pelas características cancerígenas das células DMG7.
Para exemplificar nossos ensaios, um reagente de marcação de anticorpos (ALR) foi usado em combinação com um anticorpo para CD44. CD44 é uma glicoproteína transmembrana e molécula de adesão expressa em células-tronco e outros tipos celulares, associada ao fenótipo de células-tronco cancerígenas e à migração e invasão de célulastumorais13. Os protocolos incluem a preparação da amostra, a aquisição da imagem em modo de campo claro e fluorescente e a análise em um instrumento de análise de células vivas que permitiu medir quantitativamente em tempo real a expressão global de CD44 na membrana celular DMG durante a invasão e migração 3D. Os ensaios também permitiram visualizar o sinal fluorescente intermitente de CD44 em células individuais durante a migração e a invasão. Curiosamente, um efeito do anticorpo anti-CD44 também foi observado, que potencialmente agindo como um anticorpo bloqueador, também pareceu reduzir a migração e invasão celular, bem como induzir uma mudança do padrão de invasão de um mesenquimal coletivo para um fenótipo amebóide-like de célula única.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3056D</td>
			<td>solution for neurosphere dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Mv medical</td>
			<td>FFL16034</td>
			<td>cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-44 (156-3C11)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3570</td>
			<td>Mouse mAb IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>4743</td>
			<td>Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>-</td>
			<td>The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>any inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Green Background Suppressor Reagent</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>6500-0045</td>
			<td>Backgroung suppressor reagent (BSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor stem cell (TSM) medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>growth cell medium (see reference in the text for details)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>7007</td>
			<td>size 96 well, round bottom clear</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma

A migração e invasão celular são características específicas dos tumores mutantes H3K27M de glioma difuso da linha média (DMG). Já modelamos essas características usando ensaios tridimensionais (3D) de invasão e migração baseados em células. Neste estudo, otimizamos esses ensaios 3D para imunocitoquímica de células vivas. Um Antibody Labeling Reagent foi usado para detectar em tempo real a expressão da molécula de adesão CD44, na membrana plasmática de células migratórias e invasoras de uma linhagem celular primária derivada de paciente DMG H3K27M. O CD44 está associado ao fenótipo de células-tronco cancerígenas e à migração e invasão de células tumorais e está envolvido nas interações diretas com a matriz extracelular do sistema nervoso central (SNC). As neuroesferas (NS) da linhagem celular DMG H3K27M foram embutidas na matriz de membrana basal (BMM) ou colocadas em uma fina camada de revestimento de BMM, na presença de um anticorpo anti-CD44 em conjunto com o reagente de marcação de anticorpos (ALR). A análise de imagens imunocitoquímicas de células vivas em 3D foi realizada em um instrumento de análise de células vivas para medir quantitativamente a expressão global de CD44, especificamente nas células migrantes e invasoras. O método também permite visualizar em tempo real a expressão intermitente de CD44 na membrana plasmática de células migratórias e invasoras. Além disso, o ensaio também forneceu novos conhecimentos sobre o papel potencial do CD44 na transição mesenquimal para ameboide em células DMG H3K27M.

O protocolo de imunocitoquímica de células vivas 3D para invasão e migração é resumido em um fluxo de trabalho simples e reprodutível na Figura 1. Ao semear as células DMG em placas de fundo redondo ULA 96 poços, NS de tamanho reprodutível são obtidos e usados nas etapas exibidas. Quando o SN atinge o tamanho ideal de ~300 μm (aproximadamente 4 dias pós-semeadura), iniciam-se os ensaios de invasão12 e migração14 . A adição do ...

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Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Este estudo apresenta um protocolo de imunocitoquímica de células vivas 3D aplicado a uma linhagem celular pediátrica de glioma difuso da linha média, útil para estudar em tempo real a expressão de proteínas na membrana plasmática durante processos dinâmicos como invasão e migração de células 3D.

Ensaios de imunocitoquímica de células 3D vivas de glioma difuso da linha média pediátrica

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

O glioma difuso da linha média é um tumor cerebral altamente invasivo. Este método ajuda a estudar em tempo real como as células DMG migram e invadem em um contexto 3D com insights específicos sobre o papel potencial de uma molécula chave de adesão. Usando um reagente de marcação e um anticorpo específico anti-CD44, podemos estudar por imagem de células vivas a expressão de CD44 na membrana plasmática nas células DMG também na migração e invasão 3D.A aplicação desta técnica evidenciou o potencial papel do CD44 na motilidade dessas células, sugerindo que poderia representar um alvo molecular valioso e invasivo. Para começar, reidrateie o ALR adicionando 100 microlitros de água estéril e misture a solução por pipetagem. Misture o anticorpo com o ALR no meio TSM em uma placa de fundo redondo de vários poços ou em um tubo âmbar e proteja-o da luz.Preparar quantidade suficiente do meio para dispensar 25 microlitros por poço a três vezes a concentração final do ensaio e, em seguida, incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Diluir a BSR no meio TSM na concentração de 1,5 milimolar para obter uma concentração final de 0,5 milimolar no final do ensaio. Em seguida, remova suave e lentamente 75 microlitros do meio de cada poço, evitando tocar o fundo do poço onde o SN se encontra e verificando visualmente a presença do SN.Adicione suavemente 25 microlitros do complexo de anticorpos BSR e ALR a cada poço e deixe o complexo de anticorpos ALR misturar-se com o meio durante dois a três minutos. Usando um microscópio invertido, certifique-se de que cada NS esteja localizado centralmente na parte inferior do poço. Evite a formação de bolhas, removendo-as usando uma agulha.Coloque a placa no gelo por cinco minutos para deixar o fundo da placa esfriar. Dispensar 75 microlitros de BMM por poço colocando uma ponta P200 pré-resfriada na parede interna do poço, evitando a formação de bolhas e tocando o fundo do poço. Deixe o prato no gelo por cinco minutos para deixar o BMM misturar com o meio.Usando um microscópio invertido, verifique a localização da SN. E se não estiver presente centralmente, centrifugar a placa a quatro graus Celsius a 180 vezes G por cinco minutos. Em seguida, transfira a placa no instrumento de análise de células vivas colocado dentro da incubadora ajustada a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. Uma vez que os poços são revestidos com BMM, corte uma ponta P200.Pegue 50 microlitros do meio celular e NS de cada poço selecionado e transfira-o para um poço de fundo plano revestido. Verifique visualmente a presença e a posição do SN em cada poço. Adicione suavemente 50 microlitros do anticorpo BSR e ALR diluídos a cada poço, aguardando dois a três minutos para deixar os reagentes se misturarem.E usando um microscópio invertido, certifique-se de que a maioria dos NS replicados estejam localizados centralmente no poço. Depois de garantir a ausência de qualquer bolha, transfira suavemente a placa no instrumento de análise de células vivas, conforme demonstrado anteriormente. No software de instrumento de análise de células vivas, selecione a opção agendamento para aquisição, clique na guia de adição e selecione digitalizar no cronograma para digitalizar as placas com intervalos conforme mencionado no manuscrito do texto.Na janela do software, crie ou restaure o vaso e clique na opção Novo. Selecione o tipo de varredura esferoide, fase mais campo brilhante, canais de imagem verde para o ensaio de invasão e objetivo 4X. Selecione varredura de clonagem de diluição, tipo objetivo 4X e fase e verde para o ensaio de migração.Selecione o tipo de placa e defina os poços a serem escaneados, destacando-os no mapa da placa e, em seguida, configure a frequência de varredura. Clique em Adicionar à programação e inicie a verificação. Selecione a guia Criar Nova Definição de Análise.Em seguida, selecione invasão esferoide ou aplicativo analisador básico para invasão e migração, respectivamente, na guia. Selecione os canais de invasão e migração apropriados no canal de imagem. Selecione algumas imagens representativas de três a quatro poços para visualizar e refinar a configuração de análise.Para o ensaio de invasão, na aba definição da análise, ajuste as configurações da aplicação nos canais de campo claro e verde com as configurações mencionadas no manuscrito do texto para gerar uma segmentação precisa entre as células esferoides e invasoras. Para o ensaio de migração, ajuste as configurações da aplicação conforme mencionado no texto manuscrito na fase e canais verdes para gerar uma segmentação precisa entre a confluência e as células verdes. Verifique se as configurações de análise estão corretas para o SN clicando aleatoriamente em vários poços.Selecione os poços e os pontos de tempo a serem analisados. Salve a definição da análise e clique em Concluir. As imagens confocais de imunofluorescência representativas da expressão de CD44 em células primárias derivadas de pacientes com DMG demonstraram o papel do CD44 na migração e invasão celular.A imunoquímica de células 3D ao vivo permite visualizar a expressão de CD44. Os quadros representativos do lapso de tempo tanto para migração quanto para invasão mostram a presença e ausência do sinal verde fluorescente na mesma célula observado ao longo do tempo, sugerindo que a expressão de CD44 está ligada e desligada enquanto as células estão migrando e invadindo. Os processos de migração e invasão são acompanhados ao longo de 96 horas, mostrando células QCTB-R059 com alto nível de CD44.A quantificação da expressão de CD44 e seu aumento ao longo do tempo foi medida pelo sinal de fluorescência verde global associado à ALR tanto para migração quanto para invasão. Quando o anticorpo anti-CD44 é usado em células vivas, afeta a morfologia celular, induzindo uma transição da invasão mesenquimal para ameboide e uma redução da capacidade invasiva e migratória dessas células. A etapa mais crítica do método é a mistura do reagente de marcação com um anticorpo, a adição da mistura ao Matrigel e do meio e o acesso ao instrumento de imagem de células vivas.Este método pode ser implementado pelo uso de dois ou mais reagentes de marcação distintos e anticorpos para investigar a interação celular DMG mediada por células diretas e contato. Nosso método oferece novas ferramentas para investigar em 3D os mecanismos celulares e moleculares de migração e invasão de DMG, fornecendo novas direções para inibir seu fenótipo infiltrativo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Um protocolo para a Cultura rápidos post-mortem celular de Difuso Intrínseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Pesquisa do câncer

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplante de Tumores Cerebrais Pediátricos de Zebrafish em Hospedeiros Imune-competentes para Estudo a Longo Prazo do Comportamento de Células Tumorais e Resposta a Medicamentos

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

PET/RM de corpo inteiro de pacientes pediátricos: os detalhes que importam

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Determinação do nível de expressão da proteína em pilhas cultivadas por imunocitoquímica em blocos de parafina

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Avaliação de biomarcadores em Glioma por imuno-histoquímica na parafina Glioma 3D Neurosphere culturas

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Imagem latente longitudinal de intravital do comportamento da pilha do tumor cerebral em resposta a uma biópsia cirúrgica invasora

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Monitoramento em tempo real da migração humana de células glioma em co-culturas de raiz dorsal Ganglion Axon-Oligodendrocyte

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Ensaios para validação de inibidores de acetiltransferase histone

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A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Um fluxo de trabalho de triagem rápida para identificar terapia de combinação potencial para GBM usando células-tronco glioma derivadas do paciente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...