Name: live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Сильвию Содду и д-ра Джулию Федеричи (Отдел сотовых сетей и молекулярных терапевтических мишеней, Национальный институт рака IRCCS-Regina Helen, Рим, Италия) за доступ к системе визуализации живых клеток IncuCyte S3 в предварительной настройке протокола визуализации. Кроме того, мы благодарим Бернадетт Коложсвари за технические консультации. Исследование было поддержано грантом Children with Cancer UK (16-234) и Министерством здравоохранения Италии Ricerca Corrente. М. Винчи является стипендиатом программы «Дети с раком» в Великобритании. Р. Ферретти является стипендиатом Фонда Веронези (2018 и 2019). Авторы выражают благодарность Fondazione Heal за поддержку и Фонду детской больницы за финансирование Банка детских опухолей Квинсленда.

Этот протокол соответствует руководящим принципам комитетов по этике исследований на людях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование было выполнено с использованием Incucyte S3 и/или SX5 Live-Cell Analysis Instrument (упоминается как инструмент для анализа живых клеток).
1. Генерация ...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).</li><li>Magr&#236;, A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+early+metastatic+seeding+occur+in+colorectal+cancer.">Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Caretti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+spread+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).</li><li>Pericoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+multiple+platforms+for+the+analysis+of+multifluorescent+marking+technology+applied+to+pediatric+GBM+and+DIPG.">Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+and+cooperativity+between+subclonal+populations+of+pediatric+glioblastoma+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+cells.">Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).</li><li>Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lentiviral-inducible+transgene+expression+systems+and+versatile+single-plasmid+reporters+for+in+vitro+and+in+vivo+cancer+biology+studies.">Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).</li><li>Huang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-regulated+ROS+from+xanthine+oxidase+acts+as+an+early+effector+for+triggering+late+mitochondria-dependent+apoptosis+in+cathepsin+s-targeted+tumor+cells.">Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells.</a> PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).</li><li>Prudner, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+starvation+and+docetaxel+induce+c-Myc-driven+hENT1+surface+expression+to+overcome+gemcitabine+resistance+in+ASS1-negative+tumors.">Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).</li><li>Ferretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+invasion+into+Matrigel:+optimized+protocol+for+RNA+extraction.">Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction.</a> Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+role+of+CD44+in+cancer+progression:+therapeutic+implications.">The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 11 (1), 64 (2018).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).</li><li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).</li><li>Mount, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+antitumor+efficacy+of+anti-GD2+CAR+T+cells+in+H3-K27M.">Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M.</a> Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).</li><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+classification+of+tumors+of+the+central+nervous+system:+A+summary.">The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Czabanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+adhesion+molecule-C+mediates+the+recruitment+of+embryonic-endothelial+progenitor+cells+to+the+perivascular+niche+during+tumor+angiogenesis.">Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).</li><li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy.">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li><li>Pankov&#225;, K., R&#246;sel, D., Novotn&#253;, M., Br&#225;bek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+of+transition+between+mesenchymal+and+amoeboid+invasiveness+in+tumor+cells.">The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li></ol>

Иммуноцитохимия живых 3D-клеток, которую мы применили для инвазии и миграции DMG у детей, может быть легко адаптирована и для других высокоинвазивных типов опухолевых клеток, включая клеточные линии рака молочной железы и толстой кишки. 
В отличие от ранее выполненных имму?...

Способность опухолевых клеток уклоняться и распространяться через окружающие ткани является отличительной чертой рака1. В частности, подвижность опухолевых клеток является характерной чертой злокачественных опухолей, будь то метастатический тип опухоли, такой как рак молочной железы 2 или колоректальныйрак 3, или местноинвазивный тип, такой как диффузная глиома 4,5.
Визуализация играет центральную роль в исследовании многих аспектов фенотипов опухолевых клеток; Тем не менее, визуализация живых клеток, безусловно, предпочтительна при изучении динамических клеточных процессов, таких как миграция и инвазия, когда происходят изменения в морфологии и межклеточном взаимодействии 6,7 и могут быть легче изучены с течением времени. Для визуализации живых клеток могут использоваться различные системы оптической микроскопии, от фазово-контрастных до конфокальных флуоресцентных микроскопов, и получение изображений выполняется в течение короткого или длительного периода времени на инвертированном микроскопе, оснащенном камерой для контроля температуры иCO2, или в системах анализа изображений с высоким содержанием изображения, которые имеют встроенные камеры, или, в качестве альтернативы, в системах изображений, которые могут находиться в инкубаторе без необходимости тревожить клетки в течение всего времени эксперимента. Выбор используемой системы часто продиктован рядом факторов, таких как необходимое разрешение, продолжительность общего времени сбора данных и временные интервалы, тип используемого сосуда и пропускная способность анализа (однокамерная или многолуночная планшет), чувствительность используемых клеток (драгоценные и/или редкие клетки) и фототоксичность клеток при наличии флуорофоров.
Что касается флуоресцентной визуализации в режиме реального времени, то это может быть достигнуто путем трансдукции клеток для экспрессии флуоресцентных белков либо для стабильной экспрессии, либо в качестве индуцируемой системы8, путем транзиторной клеточной трансфекции или с помощью клеточных красителей, которые в настоящее время доступны для мечения живых клеток7, для отслеживания живых клеток, а также для мечения субклеточных органелл9.
Недавно был разработан полезный подход для иммуноцитохимии живых клеток, при котором антитело, распознающее поверхностный маркер выбора, может быть связано с реагентом для мечения, а при добавлении питательной среды клетки, экспрессирующие специфический маркер, могут быть легко визуализированы в режиме реального времени с помощью визуализации живых клеток. Визуализация и количественная оценка экспрессии маркеров с помощью такой системы могут быть легко достигнуты при выращивании клеток в двумерных (2D) условиях культивирования10.
В этом исследовании мы оптимизировали протоколы для инвазии и миграции клеток диффузной срединной глиомы (DMG) у детей11,12. DMG являются высокоагрессивными опухолями головного мозга, поражающими детей, в подавляющем большинстве случаев связанными с драйверной мутацией K27M в вариантах гистонов H3. ДМГ возникают в стволе головного мозга и срединных отделах центральной нервной системы (ЦНС) и характеризуются высокой инфильтративной природой. Было показано, что эта инвазивная способность, по крайней мере частично, опосредована внутриопухолевой гетерогенностью и ракоподобными особенностями стволовых клеток DMG7.
В качестве примера для наших анализов использовали реагент для мечения антител (ALR) в комбинации с антителами к CD44. CD44 представляет собой трансмембранный гликопротеин и молекулу адгезии, экспрессируемую на стволовых клетках и других типах клеток, связанную с фенотипом раковых стволовых клеток, миграцией и инвазией опухолевых клеток13. Протоколы включают в себя подготовку образца, получение изображения в светлопольном и флуоресцентном режиме, а также анализ на приборе для анализа живых клеток, который позволил количественно измерить в режиме реального времени общую экспрессию CD44 на клеточной мембране DMG во время 3D-инвазии и миграции. Анализы также позволили визуализировать прерывистый флуоресцентный сигнал CD44 на отдельных клетках во время миграции и вторжения. Интересно, что также наблюдался эффект антитела к CD44, который, потенциально действуя как блокирующее антитело, также, по-видимому, уменьшал миграцию и инвазию клеток, а также индуцировал переключение паттерна инвазии с коллективного мезенхимоподобного на более одноклеточный амебоидный фенотип.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3056D</td>
			<td>solution for neurosphere dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Mv medical</td>
			<td>FFL16034</td>
			<td>cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-44 (156-3C11)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3570</td>
			<td>Mouse mAb IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>4743</td>
			<td>Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>-</td>
			<td>The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>any inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Green Background Suppressor Reagent</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>6500-0045</td>
			<td>Backgroung suppressor reagent (BSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor stem cell (TSM) medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>growth cell medium (see reference in the text for details)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>7007</td>
			<td>size 96 well, round bottom clear</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma

Миграция и инвазия клеток являются специфическими признаками диффузной срединной глиомы (DMG) H3K27M-мутантных опухолей. Мы уже смоделировали эти особенности с помощью трехмерного (3D) клеточного анализа инвазии и миграции. В этом исследовании мы оптимизировали эти 3D-анализы для иммунохимии живых клеток. Реагент для мечения антител был использован для обнаружения в режиме реального времени экспрессии молекулы адгезии CD44 на плазматической мембране мигрирующих и вторгающихся клеток первичной клеточной линии DMG H3K27M, полученной от пациентов. CD44 связан с фенотипом раковых стволовых клеток, миграцией и инвазией опухолевых клеток и участвует в прямом взаимодействии с внеклеточным матриксом центральной нервной системы (ЦНС). Нейросферы (НС) из клеточной линии DMG H3K27M встраивали в матрицу базальной мембраны (BMM) или помещали на тонкий слой покрытия BMM в присутствии антитела к CD44 в сочетании с реагентом для мечения антител (ALR). Иммуноцитохимический анализ живых 3D-клеток проводили на приборе для анализа живых клеток для количественного измерения общей экспрессии CD44, в частности, мигрирующих и вторгающихся клеток. Метод также позволяет визуализировать в режиме реального времени прерывистую экспрессию CD44 на плазматической мембране мигрирующих и инвирующих клеток. Кроме того, анализ также позволил по-новому взглянуть на потенциальную роль CD44 в мезенхимальном переходе в амебоидный в клетках DMG H3K27M.

Протокол иммуноцитохимии живых 3D-клеток для инвазии и миграции обобщен в виде простого и воспроизводимого рабочего процесса на рисунке 1. Путем посева ячеек DMG в 96-луночные пластины с круглым дном ULA получаются NS воспроизводимого размера, которые используются на показан...

Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

В этом исследовании представлен протокол иммуноцитохимии живых 3D-клеток, применяемый к детской диффузной срединной клеточной линии глиомы, полезный для изучения в режиме реального времени экспрессии белков на плазматической мембране во время динамических процессов, таких как инвазия и миграция 3D-клеток.

Иммуноцитохимический анализ живых 3D-клеток диффузной срединной глиомы у детей

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Диффузная срединная глиома является высокоинвазивной опухолью головного мозга. Этот метод помогает в режиме реального времени изучать, как клетки DMG мигрируют и проникают в 3D-контекст с конкретным пониманием потенциальной роли ключевой молекулы адгезии. Используя реагент для мечения и специфическое антитело против CD44, мы можем изучить с помощью визуализации живых клеток экспрессию CD44 на плазматической мембране на клетках DMG, а также при 3D-миграции и инвазии.Применение этого метода подчеркнуло потенциальную роль CD44 в подвижности этих клеток, предполагая, что он может представлять собой ценную и инвазивную молекулярную мишень. Для начала регидратируйте ALR, добавив 100 микролитров стерильной воды, и перемешайте раствор с помощью пипетирования. Смешайте антитело с ALR в среде TSM в многолуночном планшете с круглым дном или в янтарной пробирке и защитите его от света.Приготовьте достаточное количество среды для дозирования 25 микролитров на лунку при трехкратной конечной концентрации анализа, а затем инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Разбавляют BSR в среде TSM при концентрации 1,5 миллимоляра для получения конечной концентрации 0,5 миллимоляра в конце анализа. Затем аккуратно и медленно удалите 75 микролитров среды из каждой лунки, избегая касания дна лунки, где находится НС и проверяя наличие НС визуально.Аккуратно добавьте 25 микролитров комплекса антител BSR и ALR в каждую лунку и дайте комплексу антител ALR смешаться со средой в течение двух-трех минут. Используя инвертированный микроскоп, убедитесь, что каждый NS расположен по центру на дне лунки. Избежать образования пузырьков можно, удалив их с помощью иглы.Поставьте тарелку на лед на пять минут, чтобы дно тарелки остыло. Дозируйте 75 микролитров BMM на лунку, поместив предварительно охлажденный наконечник P200 на внутреннюю стенку скважины, избегая образования пузырьков и касаясь дна лунки. Оставьте тарелку на льду на пять минут, чтобы BMM смешался со средой.С помощью инвертированного микроскопа проверьте расположение НС. А если он отсутствует в центре, центрифугируйте планшет при температуре четыре градуса Цельсия при 180 градусах G в течение пяти минут. Затем перенесите планшет в прибор для анализа живых клеток, помещенный в инкубатор, установленный при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа и 95% влажности. После того, как лунки будут покрыты BMM, обрежьте наконечник P200.Из каждой выбранной лунки берут по 50 микролитров клеточной среды и НС и переносят в лунку с плоским дном с покрытием. Проверьте наличие и положение НС в каждой скважине визуально. Аккуратно добавьте 50 микролитров разбавленных антител BSR и ALR в каждую лунку, подождите две-три минуты, чтобы реагенты смешались.А с помощью инвертированного микроскопа убедитесь, что большая часть репликаций NS расположена по центру лунки. Убедившись в отсутствии пузырьков, осторожно перенесите планшет в прибор для анализа живых клеток, как было показано ранее. В программном обеспечении прибора для анализа живых клеток выберите опцию «Расписание» для получения, затем нажмите на вкладку «плюс» и выберите «Сканировать по расписанию», чтобы сканировать планшеты с интервалами, указанными в текстовой рукописи.В окне программного обеспечения создайте или восстановите судно, а затем нажмите на опцию Создать. Выберите тип сканирования сфероида, фазу плюс светлое поле, зеленые каналы изображения для анализа инвазии и 4-кратный объектив. Выберите сканирование клонирования с разбавлением, объектив типа 4X, а также фазу и зеленый цвет для анализа миграции.Выберите тип пластины и определите скважины для сканирования, выделив их на карте пластины, а затем настройте частоту сканирования. Нажмите «Добавить в расписание» и запустите сканирование. Перейдите на вкладку Создать новое определение анализа.Затем на вкладке выберите spheroid invasion или basic analyzer application for invasion и migration соответственно. Выберите каналы, соответствующие вторжению и миграции, в канале образа. Выберите несколько репрезентативных изображений из трех-четырех лунок для предварительного просмотра и уточнения параметров анализа.Для инвазионного анализа на вкладке определения анализа настройте параметры приложения в светлом и зеленом каналах с настройками, указанными в текстовой рукописи, чтобы создать точную сегментацию между сфероидом и вторгающимися клетками. Для миграционного анализа отрегулируйте параметры приложения, как указано в текстовой рукописи, в фазовом и зеленом каналах, чтобы создать точную сегментацию между слиянием и зелеными клетками. Проверьте правильность настроек анализа для NS, щелкнув случайным образом по нескольким лункам.Выберите скважины и временные точки для анализа. Сохраните определение анализа и нажмите кнопку Готово. Репрезентативные иммунофлуоресцентные конфокальные изображения экспрессии CD44 в первичных клетках, полученных от пациентов с помощью DMG, продемонстрировали роль CD44 в клеточной миграции и инвазии.Живая 3D-клеточная иммунохимия позволяет визуализировать экспрессию CD44. Репрезентативные кадры временной задержки как для миграции, так и для инвазии показывают наличие и отсутствие зеленого флуоресцентного сигнала на одной и той же клетке, наблюдаемой с течением времени, что позволяет предположить, что экспрессия CD44 включается и выключается во время миграции и вторжения клеток. Процессы миграции и инвазии наблюдаются в течение 96 часов, показывая клетки QCTB-R059 с высоким уровнем CD44.Количественную оценку экспрессии CD44 и ее увеличение с течением времени измеряли по общему сигналу зеленой флуоресценции, связанному с ALR как для миграции, так и для инвазии. Когда антитело к CD44 используется на живых клетках, оно влияет на морфологию клеток, индуцируя переход от мезенхимальноподобной инвазии к амебоидной и снижая инвазивную и миграционную способность этих клеток. Наиболее важным этапом метода является смешивание реагента для мечения с антителом, добавление смеси к Matrigel и среде, а также доступ к прибору для визуализации живых клеток.Этот метод может быть дополнительно реализован путем использования двух или более различных реагентов для мечения и антител для исследования взаимодействия клеток DMG, опосредованного прямыми клетками и контактом. Наш метод предлагает новые инструменты для исследования в 3D клеточных и молекулярных механизмов миграции и инвазии DMG, предоставляя новые направления для ингибирования их инфильтративного фенотипа.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Протокол для быстрой Посмертное культуре клеток диффузной Характеристическая Понтийской глиомы (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Трансплантация опухолей головного мозга у детей в мозг в иммунокомпетентные хозяева для долгосрочного изучения поведения опухолевых клеток и лекарственного ответа

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

Всего тела PET/МРТ педиатрических больных: детали, которые важны

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Определение уровня выражения протеина в культивируемых клеток Immunocytochemistry на клетки, парафин врезанных блоков

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Оценка биомаркеров в глиомы, иммуногистохимия на парафин врезанных 3D глиомы нейросферы культур

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Продольная интравитальная визуализация поведения опухолевых клеток головного мозга в ответ на инвазивную хирургическую биопсию

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Мониторинг в режиме реального времени миграции клеток глиомы человека на dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Анализы для проверки ингибиторов ацетилтрансферазы гистона

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Быстрый процесс скрининга для определения потенциальной комбинированной терапии GBM с использованием стволовых клеток глиомы, полученных от пациента

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Кокультура глутаматергических нейронов и педиатрических клеток глиомы высокой степени в микрофлюидные устройства для оценки электрических взаимодействий