Name: live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
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Nos gustaría agradecer a la Dra. Silvia Soddu y a la Dra. Giulia Federici (Unidad de Redes Celulares y Dianas Terapéuticas Moleculares, IRCCS-Instituto Nacional del Cáncer Regina Elena, Roma, Italia) por el acceso al sistema de imágenes de células vivas IncuCyte S3 en la configuración preliminar del protocolo de imágenes. Además, agradecemos a Bernadett Kolozsvari por el asesoramiento técnico. El estudio contó con el apoyo de la beca Children with Cancer UK (16-234) y el Ministerio de Salud italiano Ricerca Corrente. M Vinci es becaria de Children with Cancer UK. R Ferretti ha recibido la beca de la Fondazione Veronesi (2018 y 2019). Los autores agradecen a la Fondazione Heal por su apoyo y a la Fundación del Hospital Infantil por financiar el Banco de Tumores Infantiles de Queensland.

Este protocolo sigue las directrices de los comités de ética en investigación en humanos de las instituciones.
NOTA: Este estudio se realizó utilizando el instrumento de análisis de células vivas Incucyte S3 y/o SX5 (referenciado como instrumento de análisis de células vivas).
1. Generación de esferoides tumorales de tamaño reproducible
NOTA: Se utilizó el protocolo (sección 1) descrito por Vinci et al. 2015 <su...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. 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La inmunocitoquímica de células vivas en 3D que hemos adoptado aquí para la invasión y migración pediátrica de DMG podría adaptarse fácilmente también a otros tipos de células tumorales altamente invasivas, incluidas las líneas celulares de cáncer de mama y colon. 
A diferencia de los ensayos de inmunocitoquímica de células vivas 2D realizados anteriormente10, cuando se trabaja en 3D, se sugiere prestar atención a algunos pasos críticos. En particular, p...

La capacidad de las células tumorales para evadir y diseminarse a través del tejido circundante es un sello distintivodel cáncer. En particular, la motilidad de las células tumorales es un rasgo característico de los tumores malignos, ya sea un tipo de tumor metastásico como el cáncer de mama2 o colorrectal3 o un tipo localmente invasivo como el glioma difuso 4,5.
Las imágenes tienen un papel central en la investigación de muchos aspectos de los fenotipos de las células tumorales; Sin embargo, la obtención de imágenes de células vivas es definitivamente preferible cuando se estudian procesos celulares dinámicos como la migración y la invasión, cuando se producen cambios en la morfología y la interacción célula-célula 6,7 y pueden examinarse más fácilmente a lo largo del tiempo. Para la obtención de imágenes de células vivas, se pueden utilizar diferentes sistemas de microscopía óptica, desde el contraste de fase hasta los microscopios fluorescentes confocal, y la adquisición de imágenes realizada durante un corto o largo período de tiempo en un microscopio invertido equipado con una cámara para el control de la temperatura y elCO2, o en sistemas de análisis de imágenes de alto contenido que tienen cámaras incorporadas, o alternativamente en sistemas de imágenes que pueden permanecer en la incubadora sin necesidad de perturbar las células durante toda la duración del experimento. La elección del sistema utilizado suele estar dictada por una serie de factores, como la resolución necesaria, la duración del tiempo total de adquisición y los intervalos de tiempo, el tipo de recipiente utilizado y el rendimiento del ensayo (cámara única o placa de pocillos múltiples), la sensibilidad de las células utilizadas (células preciosas y/o raras) y la fototoxicidad de las células si hay fluoróforos presentes.
Con respecto a las imágenes fluorescentes en modo vivo, esto puede lograrse mediante la transducción de células para la expresión de proteínas fluorescentes, ya sea para una expresión estable o como un sistema inducible8, mediante la transfección celular transitoria o mediante el uso de colorantes celulares que ahora están disponibles para el marcaje de células vivas7, para el seguimiento de células vivas y para el etiquetado de orgánulos subcelulares9.
Recientemente se ha desarrollado un enfoque útil para la inmunocitoquímica de células vivas, en el que un anticuerpo que reconoce un marcador de superficie de elección puede unirse a un reactivo de marcaje y, al agregarlo al medio de cultivo, las células que expresan el marcador específico pueden obtener imágenes fácilmente en tiempo real mediante imágenes de células vivas. La visualización y cuantificación de la expresión de marcadores utilizando un sistema de este tipo puede lograrse fácilmente cuando las células se cultivan en condiciones de cultivo bidimensionales (2D)10.
En este estudio, optimizamos los protocolos para la invasión inmunocitoquímica de células vivas en 3D y la migración de células derivadas de pacientes con glioma difuso difuso de línea media (DMG) pediátrico11,12. Los DMG son tumores cerebrales altamente agresivos que afectan a los niños, en su gran mayoría asociados con la mutación conductora K27M en las variantes de la histona H3. Los DMG surgen en el tronco encefálico y en las regiones de la línea media del sistema nervioso central (SNC) y se caracterizan por una naturaleza altamente infiltrativa. Se ha demostrado que esta capacidad invasiva está, al menos en parte, mediada por la heterogeneidad intratumoral y las características similares a las de las células madre cancerosas de las células DMG7.
Para ejemplificar nuestros ensayos, se utilizó un reactivo de marcado de anticuerpos (ALR) en combinación con un anticuerpo para CD44. CD44 es una glicoproteína transmembrana y una molécula de adhesión expresada en células madre y otros tipos de células, asociada con el fenotipo de células madre cancerosas y la migración e invasión de células tumorales13. Los protocolos incluyen la preparación de la muestra, la adquisición de imágenes en modo de campo claro y fluorescente, y el análisis en un instrumento de análisis de células vivas que permitió medir cuantitativamente en tiempo real la expresión global de CD44 en la membrana celular de DMG durante la invasión y migración 3D. Los ensayos también permitieron visualizar la señal fluorescente intermitente de CD44 en células individuales mientras migran e invaden. Curiosamente, también se observó un efecto del anticuerpo anti-CD44, que potencialmente actuando como un anticuerpo bloqueador, también pareció reducir la migración e invasión celular, así como inducir un cambio en el patrón de invasión de un fenotipo colectivo de tipo mesenquimal a un fenotipo más similar al amebo de una sola célula.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3056D</td>
			<td>solution for neurosphere dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Mv medical</td>
			<td>FFL16034</td>
			<td>cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-44 (156-3C11)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3570</td>
			<td>Mouse mAb IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>4743</td>
			<td>Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>-</td>
			<td>The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>any inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Green Background Suppressor Reagent</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>6500-0045</td>
			<td>Backgroung suppressor reagent (BSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor stem cell (TSM) medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>growth cell medium (see reference in the text for details)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>7007</td>
			<td>size 96 well, round bottom clear</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma

La migración celular y la invasión son características distintivas específicas de los tumores con mutación H3K27M en glioma difuso de línea media (DMG). Ya hemos modelado estas características utilizando ensayos tridimensionales (3D) de invasión y migración basados en células. En este estudio, hemos optimizado estos ensayos 3D para la inmunocitoquímica de células vivas. Se utilizó un reactivo de marcaje de anticuerpos para detectar en tiempo real la expresión de la molécula de adhesión CD44, en la membrana plasmática de células migratorias e invasoras de una línea celular primaria derivada del paciente DMG H3K27M. CD44 se asocia con el fenotipo de las células madre cancerosas y la migración e invasión de células tumorales y está involucrado en las interacciones directas con la matriz extracelular del sistema nervioso central (SNC). Las neuroesferas (NS) de la línea celular DMG H3K27M se incrustaron en la matriz de la membrana basal (BMM) o se colocaron sobre una capa delgada de BMM, en presencia de un anticuerpo anti-CD44 junto con el reactivo de marcaje de anticuerpos (ALR). El análisis de imágenes de inmunocitoquímica de células vivas en 3D se realizó en un instrumento de análisis de células vivas para medir cuantitativamente la expresión general de CD44, específicamente en las células migratorias e invasoras. El método también permite visualizar en tiempo real la expresión intermitente de CD44 en la membrana plasmática de las células migratorias e invasoras. Además, el ensayo también proporcionó nuevos conocimientos sobre el papel potencial de CD44 en la transición mesenquimal a ameboide en células DMG H3K27M.

El protocolo de inmunocitoquímica de células vivas en 3D para la invasión y la migración se resume en un flujo de trabajo sencillo y reproducible en la Figura 1. Al sembrar las células DMG en placas de fondo redondo ULA de 96 pocillos, se obtienen NS de tamaño reproducible y se utilizan en los pasos que se muestran. Cuando los SN han alcanzado el tamaño ideal de ~300 μm (aproximadamente 4 días después de la siembra) se inician los ensayos de invasión12 y mi...

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Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Este estudio presenta un protocolo de inmunocitoquímica de células vivas en 3D aplicado a una línea celular de glioma difuso de línea media pediátrico, útil para estudiar en tiempo real la expresión de proteínas en la membrana plasmática durante procesos dinámicos como la invasión y migración de células 3D.

Ensayos de inmunocitoquímica de células 3D vivas del glioma difuso de línea media infantil

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

El glioma difuso de la línea media es un tumor cerebral altamente invasivo. Este método ayuda a estudiar en tiempo real cómo migran e invaden las células DMG en un contexto 3D con información específica sobre el papel potencial de una molécula de adhesión clave. Mediante el uso de un reactivo de marcaje y un anticuerpo específico anti-CD44, podemos estudiar mediante imágenes de células vivas la expresión de CD44 en la membrana plasmática de las células DMG también en la migración e invasión 3D.La aplicación de esta técnica puso de manifiesto el papel potencial de CD44 en la motilidad de estas células, lo que sugiere que podría representar una diana molecular valiosa e invasiva. Para empezar, rehidrate el ALR añadiendo 100 microlitros de agua estéril y mezcle la solución mediante pipeteo. Mezcle el anticuerpo con el ALR en el medio TSM en una placa de pocillos múltiples de fondo redondo o en un tubo ámbar y protéjalo de la luz.Prepare una cantidad suficiente del medio para dispensar 25 microlitros por pocillo a tres veces la concentración final del ensayo y luego incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Diluir BSR en el medio TSM a una concentración de 1,5 milimolares para obtener una concentración final de 0,5 milimolares al final del ensayo. A continuación, retire suave y lentamente 75 microlitros del medio de cada pocillo, evitando tocar el fondo del pocillo donde se asienta el SN y comprobando visualmente la presencia del NS.Agregue suavemente 25 microlitros del complejo de anticuerpos BSR y ALR a cada pocillo y deje que el complejo de anticuerpos ALR se mezcle con el medio durante dos o tres minutos. Con un microscopio invertido, asegúrese de que cada NS esté ubicado en el centro del fondo del pozo. Evite la formación de burbujas retirándolas con una aguja.Coloque el plato sobre hielo durante cinco minutos para que el fondo del plato se enfríe. Dispense 75 microlitros de BMM por pocillo colocando una punta P200 preenfriada en la pared interna del pocillo, evitando la formación de burbujas y tocando el fondo del pocillo. Deje el plato en hielo durante cinco minutos para que el BMM se mezcle con el medio.Con un microscopio invertido, verifique la ubicación del SN. Y si no está presente en el centro, centrifugar la placa a cuatro grados centígrados a 180 veces G durante cinco minutos. A continuación, transfiera la placa en el instrumento de análisis de células vivas colocado dentro de la incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad. Una vez que los pocillos estén recubiertos con BMM, corte una punta P200.Tome 50 microlitros del medio celular y NS de cada pocillo seleccionado y transfiéralo a un pocillo de fondo plano recubierto. Verifique visualmente la presencia y la posición del NS en cada pozo. Agregue suavemente 50 microlitros de los anticuerpos BSR y ALR diluidos a cada pocillo, esperando de dos a tres minutos para que los reactivos se mezclen.Y usando un microscopio invertido, asegúrese de que la mayoría de los SN replicados estén ubicados en el centro del pozo. Después de asegurarse de que no haya burbujas, transfiera suavemente la placa en el instrumento de análisis de células vivas como se demostró anteriormente. En el software del instrumento de análisis de células vivas, seleccione la opción de programación para adquirir, luego haga clic en la pestaña más y seleccione escanear según programación para escanear las placas con intervalos como se menciona en el manuscrito de texto.En la ventana del software, cree o restaure el recipiente y luego haga clic en la opción Nuevo. Seleccione el tipo de escaneo esferoide, la fase más el campo claro, los canales de imagen verde para el ensayo de invasión y el objetivo 4X. Seleccione el escaneo de clonación por dilución, escriba el objetivo 4X y la fase y el verde para el ensayo de migración.Seleccione el tipo de placa y defina los pocillos que se van a escanear resaltándolos en el mapa de la placa y, a continuación, configure la frecuencia de escaneo. Haga clic en Agregar a la programación e inicie el escaneo. Seleccione la pestaña Crear nueva definición de análisis.A continuación, seleccione la invasión de esferoides o la aplicación de analizador básico para la invasión y la migración, respectivamente, en la pestaña. Seleccione los canales apropiados de invasión y migración en el canal de imagen. Seleccione algunas imágenes representativas de tres o cuatro pocillos para obtener una vista previa y refinar la configuración del análisis.Para el ensayo de invasión, en la pestaña de definición de análisis, ajuste la configuración de la aplicación en los canales de campo claro y verde con la configuración mencionada en el manuscrito de texto para generar una segmentación precisa entre el esferoide y las células invasoras. Para el ensayo de migración, ajuste la configuración de la aplicación como se menciona en el manuscrito de texto en los canales de fase y verde para generar una segmentación precisa entre la confluencia y las celdas verdes. Compruebe que la configuración del análisis es correcta para el NS haciendo clic aleatoriamente en varios pozos.Seleccione los pozos y los puntos de tiempo que desea analizar. Guarde la definición del análisis y haga clic en Finalizar. Las imágenes confocales inmunofluorescentes representativas de la expresión de CD44 en células primarias derivadas de pacientes con DMG demostraron el papel de CD44 en la migración e invasión celular.La inmunoquímica de células vivas en 3D permite visualizar la expresión de CD44. Los marcos representativos del lapso de tiempo tanto para la migración como para la invasión muestran la presencia y ausencia de la señal fluorescente verde en la misma célula observada a lo largo del tiempo, lo que sugiere que la expresión de CD44 está activada y desactivada mientras las células migran e invaden. Los procesos de migración e invasión se siguen durante 96 horas, mostrando células QCTB-R059 con un alto nivel de CD44.La cuantificación de la expresión de CD44 y su aumento a lo largo del tiempo se midió mediante la señal de fluorescencia verde global asociada con el ALR tanto para la migración como para la invasión. Cuando el anticuerpo anti-CD44 se utiliza en células vivas, afecta a la morfología celular, induciendo una transición de invasión mesenquimal a ameboide y una reducción de la capacidad invasiva y migratoria de estas células. El paso más crítico del método es la mezcla del reactivo de marcaje con un anticuerpo, la adición de la mezcla al Matrigel y del medio, y el acceso al instrumento de obtención de imágenes de células vivas.Este método se puede implementar aún más mediante el uso de dos o más reactivos de marcaje distintivos y anticuerpos para investigar la interacción de las células DMG mediada por células directas y contacto. Nuestro método ofrece nuevas herramientas para investigar en 3D los mecanismos celulares y moleculares de la migración e invasión de DMG, proporcionando nuevas direcciones para inhibir su fenotipo infiltrativo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocolo para la rápida post-mortem de cultivos celulares de glioma pontino intrínsecos difusos (DIPG)

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Investigación

Investigación sobre el cáncer

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Transplante de Tumores cerebrales pediátricos de Zebrafish en huéspedes inmune-competentes para el estudio a largo plazo del comportamiento de la célula de tumor y de la respuesta de la droga

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Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

PET/MRI de cuerpo entero de pacientes pediátricos: los detalles que importan

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Determinación del nivel de expresión de la proteína en células cultivadas por Immunocytochemistry en bloques de parafina-encajado de la célula

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Evaluación de biomarcadores en Glioma por Immunohistochemistry en parafina-encajado 3D Glioma desarrolló culturas

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Imagen intravital longitudinal del comportamiento de las células tumorales cerebrales en respuesta a una biopsia quirúrgica invasiva

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Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

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Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Ensayos para validar los inhibidores de la acetiltransferasa histona

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flujo de trabajo de detección rápido para identificar una posible terapia combinada para GBM utilizando células madre de glioma derivadas del paciente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Cocultivo de neuronas glutamatérgicas y células pediátricas de glioma de alto grado en dispositivos microfluídicos para evaluar las interacciones eléctricas