Name: live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Vi vill tacka Dr. Silvia Soddu och Dr. Giulia Federici (Enheten för cellulära nätverk och molekylära terapeutiska mål, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rom, Italien) för tillgång till IncuCyte S3 Live Cell Imaging System i den preliminära uppsättningen av bildprotokollet. Dessutom tackar vi Bernadett Kolozsvari för den tekniska rådgivningen. Studien stöddes av Children with Cancer UK-bidraget (16-234) och det italienska hälsoministeriet Ricerca Corrente. M Vinci är en Barn med Cancer UK Fellow. R Ferretti är mottagare av Fondazione Veronesi Fellowship (2018 och 2019). Författarna erkänner Fondazione Heal för deras stöd och Children's Hospital Foundation för finansiering av Queensland Children's Tumor Bank.

Detta protokoll följer riktlinjerna från institutionernas etiska kommittéer för humanforskning.
OBS: Denna studie utfördes med Incucyte S3 och / eller SX5 Live-Cell Analysis Instrument (refererad som levande cellanalysinstrument).
1. Generering av reproducerbara tumörsfäroider
OBS: Protokollet (avsnitt 1) som beskrivs av Vinci et al. 2015 7,12, användes enligt nedan, med vissa änd...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).</li><li>Magr&#236;, A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+early+metastatic+seeding+occur+in+colorectal+cancer.">Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Caretti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+spread+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).</li><li>Pericoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+multiple+platforms+for+the+analysis+of+multifluorescent+marking+technology+applied+to+pediatric+GBM+and+DIPG.">Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+and+cooperativity+between+subclonal+populations+of+pediatric+glioblastoma+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+cells.">Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).</li><li>Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lentiviral-inducible+transgene+expression+systems+and+versatile+single-plasmid+reporters+for+in+vitro+and+in+vivo+cancer+biology+studies.">Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).</li><li>Huang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-regulated+ROS+from+xanthine+oxidase+acts+as+an+early+effector+for+triggering+late+mitochondria-dependent+apoptosis+in+cathepsin+s-targeted+tumor+cells.">Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells.</a> PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).</li><li>Prudner, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+starvation+and+docetaxel+induce+c-Myc-driven+hENT1+surface+expression+to+overcome+gemcitabine+resistance+in+ASS1-negative+tumors.">Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).</li><li>Ferretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+invasion+into+Matrigel:+optimized+protocol+for+RNA+extraction.">Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction.</a> Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+role+of+CD44+in+cancer+progression:+therapeutic+implications.">The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 11 (1), 64 (2018).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).</li><li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).</li><li>Mount, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+antitumor+efficacy+of+anti-GD2+CAR+T+cells+in+H3-K27M.">Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M.</a> Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).</li><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+classification+of+tumors+of+the+central+nervous+system:+A+summary.">The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Czabanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+adhesion+molecule-C+mediates+the+recruitment+of+embryonic-endothelial+progenitor+cells+to+the+perivascular+niche+during+tumor+angiogenesis.">Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).</li><li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy.">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li><li>Pankov&#225;, K., R&#246;sel, D., Novotn&#253;, M., Br&#225;bek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+of+transition+between+mesenchymal+and+amoeboid+invasiveness+in+tumor+cells.">The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li></ol>

Den levande 3D-cellimmunocytokemin som vi har antagit här för pediatrisk DMG-invasion och migration kan enkelt anpassas även för andra mycket invasiva tumörcelltyper, inklusive bröst- och tjocktarmscancercellinjer. 
Till skillnad från tidigare utförda live-2D-cell immunocytokemianalyser10, när man arbetar i 3D, föreslås att man uppmärksammar några kritiska steg. I synnerhet, för invasionsanalysen som vi beskriver, rekommenderas det att tillsätta ALR / ant...

Tumörcellernas förmåga att undvika och sprida sig genom den omgivande vävnaden är ett kännetecken för cancer1. I synnerhet är tumörcellmotilitet ett karakteristiskt drag hos maligna tumörer, oavsett om det är en metastatisk tumörtyp såsom bröst2 eller kolorektal cancer3 eller en lokalt invasiv typ såsom diffust gliom 4,5.
Avbildning har en central roll i undersökningen av många aspekter av tumörcellfenotyper; Levande cellavbildning är dock definitivt att föredra när man studerar dynamiska cellulära processer som migration och invasion, när förändringar i morfologi och cell-cellinteraktion 6,7 inträffar och lättare kan undersökas över tiden. För levande cellavbildning kan olika optiska mikroskopisystem användas, från faskontrast till konfokala fluorescerande mikroskop, och bildinsamling utförs under en kort eller lång tidsperiod på ett inverterat mikroskop utrustat med en kammare för temperatur och CO2-kontroll, eller i höginnehållsbildanalyssystem som har inbyggda kammare, eller alternativt i bildsystem som kan sitta i inkubatorn utan att behöva störa cellerna under hela tiden av experimentet. Valet av vilket system som används bestäms ofta av ett antal faktorer såsom den upplösning som behövs, längden på den totala förvärvstiden och tidsintervallen, fartygstyp som används och analysens genomströmning (enkammare eller flerbrunnsplatta), känsligheten hos de celler som används (värdefulla och/eller sällsynta celler) och cellernas fototoxicitet om fluoroforer förekommer.
När det gäller fluorescerande avbildning i live-läge kan detta uppnås genom att transducera celler för uttryck av fluorescerande proteiner antingen för stabilt uttryck eller som ett inducerbart system8, genom övergående celltransfektion eller genom att använda cellfärgämnen som nu är tillgängliga för märkning av levande celler7, för spårning av levande celler samt för märkning av subcellulära organeller9.
Ett användbart tillvägagångssätt har nyligen utvecklats för levande cellimmunocytokemi, där en antikropp som känner igen en valfri ytmarkör kan bindas till ett märkningsreagens, och vid tillägg till odlingsmediet kan celler som uttrycker den specifika markören lätt avbildas i realtid genom levande cellavbildning. Visualisering och kvantifiering av marköruttryck med hjälp av ett sådant system kan enkelt uppnås när celler odlas i tvådimensionella (2D) odlingsförhållanden10.
I denna studie optimerade vi protokoll för invasion av levande 3D-cellsimmunocytokemi och migration av pediatriska diffusa midlinegliom (DMG) patienthärledda celler11,12. DMG är mycket aggressiva hjärntumörer som drabbar barn, för de allra flesta associerade med drivarmutationen K27M i histon H3-varianter. DMG uppstår i hjärnstammen och mittlinjeregionerna i centrala nervsystemet (CNS) och kännetecknas av en mycket infiltrativ natur. Denna invasiva kapacitet har visat sig åtminstone delvis medieras av intratumor heterogenitet och cancerstamliknande egenskaper hos DMG-celler7.
För att exemplifiera våra analyser användes ett antikroppsmärkningsreagens (ALR) i kombination med en antikropp för CD44. CD44 är en transmembranglykoprotein och adhesionsmolekyl uttryckt på stamceller och andra celltyper, associerad med cancerstamcellsfenotyp och tumörcellmigration och invasion13. Protokollen inkluderar provberedning, bildförvärv i ljusfält och fluorescerande läge och analysen på ett levande cellanalysinstrument som gjorde det möjligt att kvantitativt mäta i realtid det övergripande CD44-uttrycket på DMG-cellmembranet under 3D-invasion och migration. Analyserna möjliggjorde också möjligheten att visualisera den intermittenta fluorescerande signalen från CD44 på enskilda celler under migrering och invasion. Intressant nog observerades också en effekt av anti-CD44-antikroppen, som potentiellt fungerade som en blockerande antikropp, tycktes också minska cellmigration och invasion samt inducera en förändring av invasionsmönstret från en kollektiv mesenkymalliknande till en mer encellig amoeboidliknande fenotyp.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3056D</td>
			<td>solution for neurosphere dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Mv medical</td>
			<td>FFL16034</td>
			<td>cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-44 (156-3C11)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3570</td>
			<td>Mouse mAb IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>4743</td>
			<td>Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>-</td>
			<td>The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>any inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Green Background Suppressor Reagent</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>6500-0045</td>
			<td>Backgroung suppressor reagent (BSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor stem cell (TSM) medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>growth cell medium (see reference in the text for details)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>7007</td>
			<td>size 96 well, round bottom clear</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma

Cellmigration och invasion är specifika kännetecken för diffusa mittlinjegliom (DMG) H3K27M-mutanta tumörer. Vi har redan modellerat dessa funktioner med hjälp av tredimensionella (3D) cellbaserade invasions- och migrationsanalyser. I denna studie har vi optimerat dessa 3D-analyser för levande cellimmunocytokemi. Ett antikroppsmärkningsreagens användes för att i realtid detektera uttrycket av vidhäftningsmolekylen CD44, på plasmamembranet hos migrerande och invaderande celler i en DMG H3K27M primär patient-härledd cellinje. CD44 är associerat med cancerstamcellsfenotyp och tumörcellsmigration och invasion och är involverat i de direkta interaktionerna med den extracellulära matrisen i centrala nervsystemet (CNS). Neurosfärer (NS) från DMG H3K27M-cellinjen inbäddades i basalmembranmatrisen (BMM) eller placerades på ett tunt beläggningsskikt av BMM, i närvaro av en anti-CD44-antikropp i kombination med antikroppsmärkningsreagenset (ALR). Den levande 3D-cellimmunocytokemiska bildanalysen utfördes på ett levande cellanalysinstrument för att kvantitativt mäta det övergripande CD44-uttrycket, särskilt på de migrerande och invaderande cellerna. Metoden gör det också möjligt att i realtid visualisera det intermittenta uttrycket av CD44 på plasmamembranet hos migrerande och invaderande celler. Dessutom gav analysen också nya insikter om CD44: s potentiella roll i mesenkymal till amoeboidövergång i DMG H3K27M-celler.

Live-3D-Cell Immunocytochemistry protokoll för invasion och migration sammanfattas i ett enkelt och reproducerbart arbetsflöde i figur 1. Genom att seeda DMG-cellerna i ULA 96-brunns rundbottenplattor erhålls reproducerbar storlek NS och används i de visade stegen. När NS har nått den ideala storleken på ~ 300 μm (ungefär 4 dagar efter sådd) initieras invasion12 och migration14 analyser. Tillägget av ALR / antikroppskomplexet tillsam...

Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Denna studie presenterar ett protokoll för levande 3D-cellimmunocytokemi applicerat på en pediatrisk diffus gliomcellinje, användbar för att studera i realtid uttrycket av proteiner på plasmamembranet under dynamiska processer som 3D-cellinvasion och migration.

Live-3D-cell immunocytokemi analyser av pediatriskt diffust mittlinjegliom

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Diffust mittlinjegliom är en mycket invasiv hjärntumör. Denna metod hjälper till att studera i realtid hur DMG-celler migrerar och invaderar i ett 3D-sammanhang med specifika insikter om den potentiella rollen för en nyckeladhesionsmolekyl. Genom att använda ett märkningsreagens och en specifik antikropp anti-CD44 kan vi genom levande cellavbildning studera uttrycket av CD44 på plasmamembran på DMG-cellerna även vid 3D-migration och invasion.Tillämpningen av denna teknik belyste CD44: s potentiella roll i dessa cellers rörlighet, vilket tyder på att den kan representera ett värdefullt och invasivt molekylärt mål. Börja med att rehydrera ALR genom att tillsätta 100 mikroliter sterilt vatten och blanda lösningen genom pipettering. Blanda antikroppen med ALR i TSM-mediet i en rund bottenplatta med flera brunnar eller i ett bärnstensrör och skydda den från ljus.Bered tillräckligt med mängd av mediet för att dosera 25 mikroliter per brunn vid tre gånger den slutliga analyskoncentrationen och inkubera sedan vid rumstemperatur i 15 minuter. Späd BSR i TSM-mediet vid 1,5 millimolär koncentration för att erhålla en slutlig koncentration av 0,5 millimolar vid slutet av analysen. Ta sedan försiktigt och långsamt bort 75 mikroliter av mediet från varje brunn, undvik att röra botten av brunnen där NS sitter och kontrollera närvaron av NS visuellt.Tillsätt försiktigt 25 mikroliter av BSR- och ALR-antikroppskomplexet till varje brunn och låt ALR-antikroppskomplexet blandas med mediet i två till tre minuter. Använd ett inverterat mikroskop, se till att varje NS är centralt placerad längst ner i brunnen. Undvik bildandet av bubblor genom att ta bort dem med en nål.Lägg plattan på is i fem minuter för att låta botten av plattan bli kall. Fördela 75 mikroliter BMM per brunn genom att placera en förkyld P200-spets på brunnens inre vägg, undvik bubbelbildning och vidrör brunnens botten. Låt plattan ligga på is i fem minuter för att låta BMM blandas med mediet.Använd ett inverterat mikroskop, kontrollera platsen för NS. Och om den inte finns centralt, centrifugera plattan vid fyra grader Celsius vid 180 gånger G i fem minuter. Överför sedan plattan i det levande cellanalysinstrumentet placerat i inkubatorn inställd på 37 grader Celsius, 5% koldioxid och 95% luftfuktighet. När brunnarna är belagda med BMM, skär en P200-spets.Ta 50 mikroliter av cellmediet och NS från varje vald brunn och överför den till en belagd platt bottenbrunn. Kontrollera närvaron och positionen för NS i varje brunn visuellt. Tillsätt försiktigt 50 mikroliter av den utspädda BSR- och ALR-antikroppen i varje brunn och vänta i två till tre minuter för att låta reagenserna blandas.Och med hjälp av ett inverterat mikroskop, se till att de flesta av replikatets NS är centralt placerade i brunnen. Efter att ha säkerställt frånvaron av någon bubbla, överför försiktigt plattan i analysinstrumentet för levande celler enligt tidigare demonstration. På programvaran för levande cellanalysinstrument väljer du alternativet schema att förvärva, klickar sedan på plusfliken och väljer skanna enligt schema för att skanna plattorna med intervall som nämns i textmanuskriptet.Skapa eller återställ kärlet i programvarufönstret och klicka sedan på alternativet Ny. Välj sfäroidskanningstyp, fas plus ljusfält, gröna bildkanaler för invasionsanalysen och 4X-mål. Välj skanning av utspädningskloning, skriv 4X-mål och fas och grönt för migreringsanalysen.Välj platttyp och definiera brunnarna som ska skannas genom att markera dem på plattkartan och ställ sedan in skanningsfrekvensen. Klicka på Lägg till i schema och starta skanningen. Välj fliken Skapa ny analysdefinition.Välj sedan sfäroidinvasion eller grundläggande analysprogram för invasion respektive migrering på fliken. Välj lämpliga kanaler för invasion och migrering i bildkanalen. Välj några representativa bilder från tre till fyra brunnar för förhandsgranskning och finjustering av analysinställningen.För invasionsanalysen, på fliken analysdefinition, justera applikationsinställningarna i ljusfältet och gröna kanaler med de inställningar som nämns i textmanuskriptet för att generera en exakt segmentering mellan sfäroiden och invaderande celler. För migreringsanalys justerar du programinställningarna som nämns i textmanuskriptet i fasen och gröna kanaler för att generera en exakt segmentering mellan sammanflödet och gröna celler. Kontrollera att analysinställningarna är korrekta för NS genom att klicka slumpmässigt på flera brunnar.Välj de brunnar och tidpunkter som ska analyseras. Spara analysdefinitionen och klicka på Slutför. De representativa immunofluorescerande konfokala bilderna av CD44-uttryck i primära DMG-patient-härledda celler visade CD44: s roll i cellmigration och invasion.Den levande 3D-cellimmunokemin gör det möjligt att visualisera CD44-uttryck. De representativa ramarna för tidsfördröjningen för både migration och invasion visar närvaron och frånvaron av den gröna fluorescerande signalen på samma cell observerad över tiden, vilket tyder på att uttrycket av CD44 är på och av medan celler migrerar och invaderar. Migrations- och invasionsprocesserna följs under 96 timmar och visar QCTB-R059-celler med en hög nivå av CD44.Kvantifieringen av CD44-uttryck och dess ökning över tid mättes av den totala gröna fluorescenssignalen associerad med ALR för både migration och invasion. När anti-CD44-antikroppen används på levande celler påverkar den cellmorfologin, vilket inducerar en övergång från mesenkymalliknande till amoeboidliknande invasion och en minskning av dessa cellers invasiva och migrerande kapacitet. Det mest kritiska steget i metoden är blandning av märkningsreagens med en antikropp, tillsats av blandningen till matrigel och medium och tillgång till levande cellavbildningsinstrument.Denna metod kan implementeras ytterligare genom användning av två eller flera distinkta märkningsreagens och antikroppar för att undersöka DMG-cellinteraktionen medierad av direkta celler och kontakt. Vår metod erbjuder nya verktyg för att i 3D undersöka de cellulära och molekylära mekanismerna för DMG-migration och invasion, vilket ger nya riktningar för att hämma deras infiltrativa fenotyp.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ett protokoll för Rapid Post mortem Cell Culture av Diffus Intrinsic Pontine Gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Transplantation av sebrafiskpediatriska hjärntumörer till immunkompetenta värdar för långvarig studie av tumörcellsbeteende och drogrespons

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

Hela kroppen PET/Mr av pediatriska patienter: de detaljer som är viktiga

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Bestämning av Protein uttryck nivå i odlade celler genom immuncytokemi på Paraffin-inbäddat Cell block

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Utvärdering av biomarkörer i gliom av immunohistokemi på Paraffin-inbäddat 3D gliom Neurosphere kulturer

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinell Intravital avbildning av hjärntumör cell beteende som svar på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Real tidsövervakning av humana Glioma cell migration på dorsala root ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-kulturer

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Analyser för validering av Histone Acetyltransferas hämmare

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Ett snabbt screeningarbetsflöde för att identifiera potentiell kombinationsterapi för GBM med hjälp av patientbaserade Glioma-stamceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...