Name: live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Dr. Silvia Soddu ve Dr. Giulia Federici'ye (Hücresel Ağlar ve Moleküler Terapötik Hedefler Birimi, IRCCS-Regina Elena Ulusal Kanser Enstitüsü, Roma, İtalya) görüntüleme protokolünün ön kurulumunda IncuCyte S3 Canlı Hücre Görüntüleme Sistemine erişim için teşekkür ederiz. Ayrıca, teknik tavsiyeleri için Bernadett Kolozsvari'ye teşekkür ederiz. Çalışma, Kanserli Çocuklar İngiltere hibesi (16-234) ve İtalya Sağlık Bakanlığı Ricerca Corrente tarafından desteklenmiştir. M Vinci, Kanserli Çocuklar İngiltere Üyesidir. R Ferretti, Fondazione Veronesi Bursu (2018 ve 2019) sahibidir. Yazarlar, destekleri için Fondazione Heal'e ve Queensland Çocuk Tümör Bankası'nı finanse ettiği için Çocuk Hastanesi Vakfı'na teşekkür eder.

Bu protokol, kurumların insan araştırmaları etik kurullarının yönergelerini takip eder.
NOT: Bu çalışma, Incucyte S3 ve/veya SX5 Canlı Hücre Analiz Cihazı (canlı hücre analiz cihazı olarak referans alınmıştır) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
1. Tekrarlanabilir büyüklükte tümör sferoidlerinin üretilmesi
NOT: Vinci ve ark. 2015 7,12 ta...

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).</li><li>Magr&#236;, A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+early+metastatic+seeding+occur+in+colorectal+cancer.">Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).</li><li>Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurocentric+perspective+on+glioma+invasion.">A neurocentric perspective on glioma invasion.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).</li><li>Caretti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+spread+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).</li><li>Pericoli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+multiple+platforms+for+the+analysis+of+multifluorescent+marking+technology+applied+to+pediatric+GBM+and+DIPG.">Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+and+cooperativity+between+subclonal+populations+of+pediatric+glioblastoma+and+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+cells.">Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).</li><li>Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+lentiviral-inducible+transgene+expression+systems+and+versatile+single-plasmid+reporters+for+in+vitro+and+in+vivo+cancer+biology+studies.">Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies.</a> Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).</li><li>Huang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-regulated+ROS+from+xanthine+oxidase+acts+as+an+early+effector+for+triggering+late+mitochondria-dependent+apoptosis+in+cathepsin+s-targeted+tumor+cells.">Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells.</a> PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).</li><li>Prudner, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+starvation+and+docetaxel+induce+c-Myc-driven+hENT1+surface+expression+to+overcome+gemcitabine+resistance+in+ASS1-negative+tumors.">Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).</li><li>Ferretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+invasion+into+Matrigel:+optimized+protocol+for+RNA+extraction.">Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction.</a> Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+role+of+CD44+in+cancer+progression:+therapeutic+implications.">The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 11 (1), 64 (2018).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).</li><li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma.">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).</li><li>Mount, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+antitumor+efficacy+of+anti-GD2+CAR+T+cells+in+H3-K27M.">Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M.</a> Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).</li><li>Louis, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2016+World+Health+Organization+classification+of+tumors+of+the+central+nervous+system:+A+summary.">The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary.</a> Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).</li><li>Czabanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctional+adhesion+molecule-C+mediates+the+recruitment+of+embryonic-endothelial+progenitor+cells+to+the+perivascular+niche+during+tumor+angiogenesis.">Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).</li><li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy.">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li><li>Pankov&#225;, K., R&#246;sel, D., Novotn&#253;, M., Br&#225;bek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+of+transition+between+mesenchymal+and+amoeboid+invasiveness+in+tumor+cells.">The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li></ol>

Burada pediatrik DMG invazyonu ve göçü için benimsediğimiz canlı 3D hücre immünositokimyası, meme ve kolon kanseri hücre hatları dahil olmak üzere diğer yüksek invaziv tümör hücre tipleri için de kolayca uyarlanabilir. 
Daha önce gerçekleştirilen canlı 2D hücre immünositokimya testlerinden farklı olarak,3D olarak çalışırken, bazı kritik adımlara dikkat edilmesi önerilir. Özellikle, tarif ettiğimiz invazyon testi için, ALR/antikor karı...

Tümör hücrelerinin çevre dokudan kaçma ve yayılma yeteneği, kanserin ayırt edici özelliğidir1. Özellikle, tümör hücresi motilitesi, meme2 veya kolorektal kanser3 gibi metastatik bir tümör tipi veya diffüz glioma4,5 gibi lokal olarak invaziv bir tip olsun, malign tümörlerin karakteristik bir özelliğidir.
Görüntüleme, tümör hücresi fenotiplerinin birçok yönünün araştırılmasında merkezi bir role sahiptir; Bununla birlikte, göç ve invazyon gibi dinamik hücresel süreçleri incelerken, morfoloji ve hücre-hücre etkileşiminde 6,7 değişiklikler meydana geldiğinde ve zaman içinde daha kolay incelenebildiğinde, canlı hücre görüntüleme kesinlikle tercih edilmelidir. Canlı hücre görüntüleme için, faz kontrastından konfokal floresan mikroskoplara kadar farklı optik mikroskopi sistemleri kullanılabilir ve sıcaklık veCO2 kontrolü için bir hazne ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskopta kısa veya uzun bir süre boyunca gerçekleştirilen görüntü elde etme veya yerleşik odalara sahip yüksek içerikli görüntü analiz sistemlerinde veya alternatif olarak tüm süre boyunca hücreleri rahatsız etmeye gerek kalmadan inkübatörde oturabilen görüntü sistemlerinde deneyin. Kullanılan sistemin seçimi genellikle ihtiyaç duyulan çözünürlük, genel alım süresinin uzunluğu ve zaman aralıkları, kullanılan kap tipi ve testin verimi (tek odacıklı veya çok kuyulu plaka), kullanılan hücrelerin duyarlılığı (değerli ve/veya nadir hücreler) ve floroforlar varsa hücrelerin fototoksisitesi gibi bir dizi faktör tarafından belirlenir.
Canlı modda floresan görüntüleme ile ilgili olarak, bu, floresan proteinlerin ekspresyonu için hücrelerin kararlı ekspresyon veya indüklenebilir bir sistem8 olarak, geçici hücre transfeksiyonu ile transdüksiyonu veya şu anda canlı hücre etiketlemesi7, canlı hücre takibi ve hücre altı organelleri etiketleme9 için mevcut olan hücre boyaları kullanılarak elde edilebilir.
Son zamanlarda, seçilen bir yüzey markörünü tanıyan bir antikorun bir etiketleme reaktifine bağlanabildiği ve kültür ortamına eklendikten sonra, spesifik markörü eksprese eden hücrelerin canlı hücre görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak kolayca görüntülenebildiği canlı hücre immünositokimyası için yararlı bir yaklaşım geliştirilmiştir. Böyle bir sistem kullanılarak işaretleyici ekspresyonunun görselleştirilmesi ve miktarının belirlenmesi, hücreler iki boyutlu (2D) kültür koşullarında büyütüldüğünde kolayca elde edilebilir10.
Bu çalışmada, pediatrik diffüz orta hat glioma (DMG) hasta kaynaklı hücrelerin canlı 3D hücre immünositokimya invazyonu ve migrasyonu için protokolleri optimize ettik11,12. DMG, çocukları etkileyen oldukça agresif beyin tümörleridir ve büyük çoğunluğu histon H3 varyantlarındaki sürücü mutasyonu K27M ile ilişkilidir. DMG, beyin sapında ve merkezi sinir sisteminin (MSS) orta hat bölgelerinde ortaya çıkar ve oldukça infiltratif bir yapıya sahiptir. Bu invaziv kapasitenin en azından kısmen intratümör heterojenliği ve DMG hücrelerinin kanser kökü benzeri özellikleri tarafından aracılık edildiği gösterilmiştir7.
Testlerimizi örneklemek için, CD44 için bir antikor ile kombinasyon halinde bir antikor etiketleme reaktifi (ALR) kullanıldı. CD44, kanser kök hücre fenotipi ve tümör hücresi göçü ve invazyonu ile ilişkili, kök hücre ve diğer hücre tipleri üzerinde eksprese edilen bir transmembran glikoprotein ve adezyon molekülüdür13. Protokoller arasında numune hazırlama, parlak alan ve floresan modunda görüntü elde etme ve 3D invazyon ve göç sırasında DMG hücre zarı üzerindeki genel CD44 ekspresyonunun gerçek zamanlı olarak nicel olarak ölçülmesine izin veren bir canlı hücre analiz cihazında analiz yer alır. Tahliller ayrıca, göç ederken ve istila ederken CD44'ün aralıklı floresan sinyalini tek tek hücreler üzerinde görselleştirme olanağına da izin verdi. İlginç bir şekilde, potansiyel olarak bloke edici bir antikor olarak hareket eden anti-CD44 antikorunun bir etkisi de gözlendi, aynı zamanda hücre göçünü ve invazyonunu azalttığı ve ayrıca invazyon modelinin kolektif mezenkimal benzeri bir fenotipten daha tek hücreli amip benzeri bir fenotipe geçişini indüklediği görüldü.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well TC-Treated Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB3056D</td>
			<td>solution for neurosphere dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burker chamber</td>
			<td>Mv medical</td>
			<td>FFL16034</td>
			<td>cell counting chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-44 (156-3C11)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3570</td>
			<td>Mouse mAb IgG2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td>Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>4743</td>
			<td>Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>-</td>
			<td>The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>any inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-Green Background Suppressor Reagent</td>
			<td>Incucyte</td>
			<td>6500-0045</td>
			<td>Backgroung suppressor reagent (BSR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor stem cell (TSM) medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>growth cell medium (see reference in the text for details)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>7007</td>
			<td>size 96 well, round bottom clear</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-3d-cell immunocytochemistry assays of pediatric diffuse midline glioma

Hücre göçü ve invazyonu, Diffüz Orta Hat Gliomu (DMG) H3K27M mutant tümörlerinin ayırt edici özellikleridir. Bu özellikleri, üç boyutlu (3D) hücre tabanlı invazyon ve migrasyon tahlilleri kullanarak zaten modelledik. Bu çalışmada, bu 3D tahlilleri canlı hücre immünositokimyası için optimize ettik. Bir DMG H3K27M primer hasta kaynaklı hücre hattının göç eden ve istilacı hücrelerinin plazma membranı üzerindeki adezyon molekülü CD44'ün ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak tespit etmek için bir Antikor Etiketleme Reaktifi kullanıldı. CD44, kanser kök hücre fenotipi ve tümör hücresi göçü ve invazyonu ile ilişkilidir ve merkezi sinir sistemi (CNS) hücre dışı matrisi ile doğrudan etkileşimlerde rol oynar. DMG H3K27M hücre hattından nörosferler (NS), bazal membran matrisine (BMM) gömüldü veya antikor etiketleme reaktifi (ALR) ile birlikte bir anti-CD44 antikoru varlığında ince bir BMM kaplama tabakasına yerleştirildi. Canlı 3D hücre immünositokimya görüntü analizi, özellikle göç eden ve istilacı hücreler üzerinde genel CD44 ekspresyonunu kantitatif olarak ölçmek için bir canlı hücre analiz cihazında gerçekleştirildi. Yöntem ayrıca, göç eden ve istilacı hücrelerin plazma zarı üzerindeki CD44'ün aralıklı ekspresyonunun gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca, test, CD44'ün DMG H3K27M hücrelerinde mezenkimal - amipoid geçişindeki potansiyel rolü hakkında yeni bilgiler sağladı.

İnvazyon ve migrasyon için Live-3D-Cell İmmünositokimya protokolü, Şekil 1'de basit ve tekrarlanabilir bir iş akışında özetlenmiştir. DMG hücrelerinin ULA 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakalara tohumlanmasıyla, tekrarlanabilir boyutta NS elde edilir ve görüntülenen adımlarda kullanılır. NS ~300 μm'lik ideal boyuta ulaştığında (tohumlamadan yaklaşık 4 gün sonra) invazyon12 ve göç14 tahlilleri başlatılır. ALR/antik...

Watch this Scientific Journal Video about Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma at JoVE.com

Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma

Bu çalışma, 3D hücre invazyonu ve göçü gibi dinamik süreçler sırasında plazma zarı üzerindeki proteinlerin ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için yararlı olan, pediatrik diffüz orta hat glioma hücre hattına uygulanan bir canlı 3D hücre immünositokimyası protokolü sunmaktadır.

Pediatrik Diffüz Orta Hat Gliomunun Canlı 3D Hücre İmmünositokimya Testleri

Cell migration and invasion are specific hallmarks of Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutant tumors. We have already modeled these features using ...

Diffüz orta hat gliomu oldukça invaziv bir beyin tümörüdür. Bu yöntem, DMG hücrelerinin nasıl göç ettiğini ve istila ettiğini 3B bağlamda gerçek zamanlı olarak incelemeye yardımcı olur ve önemli bir adezyon molekülünün potansiyel rolü hakkında özel bilgiler sağlar. Bir etiketleme reaktifi ve spesifik bir antikor anti-CD44 kullanarak, canlı hücre görüntüleme ile CD44'ün DMG hücreleri üzerindeki plazma membranı üzerindeki ekspresyonunu 3D migrasyon ve invazyonda da inceleyebiliriz.Bu tekniğin uygulanması, CD44'ün bu hücrelerin hareketliliğindeki potansiyel rolünü vurgulayarak, değerli ve invaziv bir moleküler hedefi temsil edebileceğini düşündürdü. Başlamak için, 100 mikrolitre steril su ekleyerek ALR'yi yeniden sulandırın ve çözeltiyi pipetleyerek karıştırın. Antikoru TSM ortamındaki ALR ile yuvarlak tabanlı çok kuyulu bir plakada veya kehribar bir tüpte karıştırın ve ışıktan koruyun.Son tahlil konsantrasyonunun üç katında oyuk başına 25 mikrolitre dağıtmak için yeterli miktarda ortam hazırlayın ve ardından oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Testin sonunda 0.5 milimolar nihai konsantrasyon elde etmek için BSR'yi TSM ortamında 1.5 milimolar konsantrasyonda seyreltin. Daha sonra, NS'nin oturduğu kuyunun dibine dokunmaktan ve NS'nin varlığını görsel olarak kontrol etmekten kaçınarak, her bir kuyucuktan 75 mikrolitre ortamı yavaşça ve yavaşça çıkarın.Her bir oyuğa yavaşça 25 mikrolitre BSR ve ALR antikor kompleksi ekleyin ve ALR antikor kompleksinin ortamla iki ila üç dakika karışmasına izin verin. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, her NS'nin kuyunun dibinde merkezi olarak bulunduğundan emin olun. Bir iğne kullanarak çıkararak kabarcık oluşumunu önleyin.Plakanın tabanının soğumasını sağlamak için plakayı beş dakika boyunca buzun üzerine koyun. Kuyunun iç duvarına önceden soğutulmuş bir P200 ucu yerleştirerek, kabarcık oluşumunu önleyerek ve kuyu dibine dokunarak kuyu başına 75 mikrolitre BMM dağıtın. BMM'nin ortamla karışmasını sağlamak için plakayı beş dakika buz üzerinde bırakın.Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak NS'nin yerini kontrol edin. Ve merkezi olarak mevcut değilse, plakayı beş dakika boyunca 180 kez G'de dört santigrat derecede santrifüjleyin. Daha sonra plakayı 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %95 nem ayarlı inkübatör içine yerleştirilmiş canlı hücre analiz cihazına aktarın. Kuyular BMM ile kaplandıktan sonra bir P200 ucu kesin.Seçilen her kuyucuktan 50 mikrolitre hücre ortamı ve NS alın ve kaplanmış düz tabanlı bir kuyuya aktarın. Her bir kuyucuktaki NS'nin varlığını ve konumunu görsel olarak kontrol edin. Her bir oyuğa yavaşça 50 mikrolitre seyreltilmiş BSR ve ALR antikoru ekleyin ve reaktiflerin karışması için iki ila üç dakika bekleyin.Ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, çoğaltılmış NS'lerin çoğunun kuyuda merkezi olarak bulunduğundan emin olun. Herhangi bir kabarcık olmadığından emin olduktan sonra, plakayı daha önce gösterildiği gibi canlı hücre analiz cihazına yavaşça aktarın. Canlı hücre analiz cihazı yazılımında, elde edilecek program seçeneğini seçin, ardından artı sekmesine tıklayın ve plakaları metin yazısında belirtildiği gibi aralıklarla taramak için programa göre tara'yı seçin.Yazılım penceresinde, gemi oluşturun veya geri yükleyin ve ardından Yeni seçeneğine tıklayın. İnvazyon testi için küresel tarama tipini, faz artı parlak alanı, yeşil görüntü kanallarını ve 4X objektifi seçin. Geçiş tahlili için seyreltme klonlama taraması, tip 4X hedefi ve faz ve yeşili seçin.Plaka tipini seçin ve taranacak kuyucukları plaka haritasında vurgulayarak tanımlayın, ardından tarama frekansını ayarlayın. Programa Ekle'ye tıklayın ve taramayı başlatın. Yeni Analiz Tanımı Oluştur sekmesini seçin.Ardından, sekmede sırasıyla istila ve geçiş için küresel istila veya temel analizör uygulamasını seçin. Görüntü kanalında invasion ve migration'a uygun kanalları seçin. Analiz ayarını önizlemek ve iyileştirmek için üç ila dört kuyudan birkaç temsili görüntü seçin.İnvazyon tahlili için, analiz tanımı sekmesinde, küresel ve istilacı hücreler arasında kesin bir segmentasyon oluşturmak için parlak alan ve yeşil kanallardaki uygulama ayarlarını metin yazısında belirtilen ayarlarla ayarlayın. Migrasyon tahlili için, birleşim ve yeşil hücreler arasında kesin bir segmentasyon oluşturmak için uygulama ayarlarını faz ve yeşil kanallardaki metin metninde belirtildiği gibi ayarlayın. Birkaç kuyucuğa rastgele tıklayarak NS için analiz ayarlarının doğru olup olmadığını kontrol edin.Analiz edilecek kuyuları ve zaman noktalarını seçin. Analiz tanımını kaydedin ve Son'a tıklayın. Primer DMG hastadan türetilen hücrelerde CD44 ekspresyonunun temsili immünofloresan konfokal görüntüleri, CD44'ün hücre göçü ve invazyonundaki rolünü göstermiştir.Canlı 3D hücre immünokimyası, CD44 ekspresyonunun görselleştirilmesine izin verir. Hem göç hem de istila için zaman atlamasının temsili çerçeveleri, zaman içinde gözlemlenen aynı hücrede yeşil floresan sinyalinin varlığını ve yokluğunu gösterir, bu da hücreler göç ederken ve istila ederken CD44 ekspresyonunun açık ve kapalı olduğunu gösterir. Migrasyon ve invazyon süreçleri 96 saat boyunca takip edilir ve yüksek düzeyde CD44 içeren QCTB-R059 hücreleri gösterilir.CD44 ekspresyonunun nicelleştirilmesi ve zaman içindeki artışı, hem göç hem de invazyon için ALR ile ilişkili genel yeşil floresan sinyali ile ölçüldü. Anti-CD44 antikoru canlı hücrelerde kullanıldığında, hücre morfolojisini etkiler, mezenkimal benzerden amip benzeri istilaya geçişi ve bu hücrelerin invaziv ve göç kapasitesinin azalmasına neden olur. Yöntemin en kritik adımı, etiketleme reaktifinin bir antikorla karıştırılması, karışımın Matrigel ve besiyerine eklenmesi ve canlı hücre görüntüleme cihazına erişimdir.Bu yöntem, doğrudan hücreler ve temasın aracılık ettiği DMG hücre etkileşimini araştırmak için iki veya daha fazla ayırt edici etiketleme reaktifi ve antikorun kullanılmasıyla daha da uygulanabilir. Yöntemimiz, DMG göçü ve invazyonunun hücresel ve moleküler mekanizmalarını 3D olarak araştırmak için yeni araçlar sunar ve infiltratif fenotiplerini inhibe etmek için yeni yönler sağlar.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Diffüz İçsel Pontine Glioma Hızlı post-mortem Hücre Kültürü için Protokol (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Whole-body PET/MRI of Pediatric Patients: The Details That Matter

Tüm vücut PET/MRG Pediatrik hastalarda: fark Ayrıntılar

Integrated PET/MRI is a hybrid imaging technique enabling clinicians to acquire diagnostic images for tumor assessment and treatment monitoring with both ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunocytochemistry hücre parafin gömülü bloklar tarafından kültürlü hücrelerdeki Protein ifade düzeyinin belirlenmesi

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Invaziv cerrahi biyopsiye yanıt olarak beyin tümörü hücre davranışının boyuna Intravital görüntüleme

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Hasta Kaynaklı Glioma Kök Hücreleri Kullanarak GBM için Potansiyel Kombinasyon Tedavisini Belirlemek için Hızlı Tarama İş Akışı

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells Into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions

Glutamaterjik Nöronların ve Pediatrik Yüksek Dereceli Glioma Hücrelerinin Mikroakışkan Cihazlara Ortak Kültürü Elektriksel Etkileşimleri Değerlendirmek İçin