Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال جوائز المعاهد الوطنية للصحة F32-HL149191 إلى YH. R00-HL144829 إلى EL ؛ R21-HL150456، R00-HL127302، R01-HL141278 إلى MPL. يتم إنشاء الشكل 1 ، الشكل 2 ، الشكل 3 بمساعدة أداة توضيح علمية على شبكة الإنترنت ، BioRender.com.

تم إيداع نصوص Python المطورة على GitHub على: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. وترد نسخة من البرامج النصية في الملف التكميلي 1. يرجى الرجوع إلى مستودع GitHub للحصول على أحدث الإصدارات.
1. الاستعدادات التجريبية
<ol><li>تحقق من الأجهزة المطلوبة قبل بدء البروتوكول. ملا?...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions.">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li><li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+reproducibility,+human+error,+and+public+policy.">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li><li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول للحصول على أفضل أداء، يجب استخدام البرامج المخبرية والوحدات والمواد الاستهلاكية المتوافقة مع OT-2 التي تم التحقق منها من Opentrons. يمكن إنشاء برامج مختبرية مخصصة باتباع تعليمات Opentrons في Reference14. تأكد من معايرة سطح OT-2 والماصات وأدوات ال?...

تعد بروتينات البندقية القائمة على قياس الطيف الكتلي أداة قوية لقياس وفرة العديد من البروتينات في العينات البيولوجية في وقت واحد. يتم استخدام تجارب البروتينات مع تحليل المعلوماتية الحيوية بشكل روتيني لتحديد المؤشرات الحيوية واكتشاف المجمعات والمسارات البيولوجية المرتبطة بها التي تدعم الآليات المرضية. بفضل خصوصيتها التحليلية العالية ودقتها الكمية المحتملة ، تتمتع بروتينات البندقية أيضا بإمكانات ممتازة لاعتمادها من قبل مرافق البحوث ومختبرات التشخيص لتحليل العينات السريرية دون الحاجة إلى الاعتماد على الأجسام المضادة1,2.
لإعداد عينات البروتين لتحليل البروتينات البندقية ، عادة ما تحتاج البروتينات المستخرجة من العينات البيولوجية (مثل الخلايا والأنسجة) أولا إلى معالجتها باستخدام بروتوكولات طويلة ، بما في ذلك قياس تركيز بروتين العينة ، وتقليل البروتين ، والألكلة ، والهضم الأنزيمي إلى ببتيدات. وعلاوة على ذلك، فإن البروتينات المستخرجة في مخازن التحلل الشائعة التي تحتوي على منظفات غالبا ما تتطلب خطوات إضافية لتبادل المخزن المؤقت أو إزالة المنظفات قبل التحليل لأن المنظفات يمكن أن تتداخل مع هضم التربسين وتؤدي إلى تدهور كبير في أداء تحليل مطياف الكتلة الترادفية للكروماتوغرافيا السائلة في اتجاه المصب (LC-MS/MS) 3. عادة ما يتم تحلية الببتيدات وتجفيفها وإعادة تشكيلها في المذيبات المتوافقة مع LC-MS / MS بعد الهضم الأنزيمي. يمكن أن تكون إجراءات الكيمياء الحيوية للبروتين هذه كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا. وبالتالي ، فإنها تستمر في الحد من إنتاجية سير عمل البروتينات والمساهمة في تباين البيانات المكتسبة4,5. تم الاعتراف بالأخطاء والتحيزات البشرية كعوامل حاسمة تؤثر على تباين البيانات وقابليتها للتكرار6،7. وللتقليل إلى أدنى حد من الأخطاء البشرية في سير عمل إعداد عينات قياس الطيف الكتلي، استخدمت النظم الروبوتية للسحب الآلي لتحسين إنتاجية وقابلية تكرار تحديد البروتين وقياسه كميا من بروتينات البندقية وتحليل الطيف الكتلي المستهدف، حيث تم الإشادة بهذه التطورات باعتبارها مفيدة لمواصلة الدفع نحو اعتماد تكنولوجيات البروتيوميات على نطاق واسع في البحوث الحرجة والإعدادات السريرية8، 9,10,11,12,13. ومع ذلك ، تستخدم معظم البروتوكولات الحالية منصات مناولة السوائل الروبوتية التي تتطلب استثمارا وتدريبا كبيرين ، مما يحد من فائدتها في العديد من المختبرات في البيئة الأكاديمية أو بميزانية محدودة.
توضح هذه المقالة بروتوكولا يستخدم نظام معالجة سائل روبوتي منخفض التكلفة ومفتوح المصدر، وهو OT-2، لأتمتة سير عمل نموذجي لإعداد عينات البروتينات البندقية. تتميز OT-2 بتكلفة أقل من العديد من أنظمة مناولة السوائل الروبوتية الأخرى ، وفي وقت كتابة هذا التقرير ، تكلف حوالي 5000 دولار أمريكي. عند الأخذ في الاعتبار أسعار الوحدات والبرامج المخبرية المختلفة ، تبلغ التكلفة الإجمالية لإعداد التجارب في هذا البروتوكول في وقت كتابة هذا التقرير حوالي 10000 دولار ، مما يجعلها أكثر بأسعار معقولة لمجموعة أوسع بكثير من المختبرات على خيارات أكثر تكلفة. يتوافق OT-2 مع البرمجة مفتوحة المصدر من خلال برامج Python النصية ويوفر مرونة كبيرة في تصميم بروتوكول DIY المحدد من قبل المستخدم. باستخدام ثلاثة نصوص مطورة داخليا ، تغطي البروتوكولات أدناه تنفيذ سير عمل نموذجي لإعداد عينات البروتينات البندقية على محطة OT-2 مع معيار بروتين نموذجي (ألبومين مصل البقر; BSA) وعينة بروتين معقدة من غسول قلب الإنسان الطبيعي (الشكل 1). وترد تفاصيل إجراءات معالجة (1) عينة BSA و (2) عينة معقدة من ليزات القلب في أقسام البروتوكول 1 و 2 و 5 و 6 و 3 و 4 و 5 و 6 على التوالي. تستخدم الخرز المغناطيسي المعدل بكربوكسيلات Sera-Mag في إعداد العينات المعززة بالطور الصلب أحادي الوعاء (SP3) لإزالة المنظفات والأملاح في عينات البروتين والببتيد. يتم تنظيف الهضم التربتي من ألبومين مصل البقر وبروتينات القلب البشري بواسطة حبات SP3 وتقديمها لتحليل LC-MS / MS. ثم يتم تحليل أطياف الكتلة باستخدام برنامج MaxQuant لتحديد الببتيد والبروتين. تظهر النتائج التمثيلية التي أجريناها أن البروتوكول يحقق معاملات تقنية ممتازة للاختلاف (CV) مع توفير وقت مقاعد البدلاء وهو غير أدنى من الهضم اليدوي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

تتطلب تجارب بروتينات البندقية القائمة على قياس الطيف الكتلي خطوات متعددة لإعداد العينات، بما في ذلك هضم البروتين الأنزيمي وتنظيفه، والتي يمكن أن تستغرق ساعات كبيرة من العمل على مقاعد البدلاء وتمثل مصدرا للتباين من دفعة إلى أخرى. يمكن أن تؤدي أتمتة المختبرات باستخدام روبوتات السحب إلى تقليل العمل اليدوي وزيادة الإنتاجية وزيادة قابلية إعادة إنتاج البحوث. ومع ذلك ، فإن الأسعار الأولية الباهظة لمحطات الأتمتة القياسية تجعلها غير ميسورة التكلفة للعديد من المختبرات الأكاديمية. توضح هذه المقالة سير عمل إعداد عينات البروتينات باستخدام نظام أتمتة مفتوح المصدر ميسور التكلفة (The Opentrons OT-2)، بما في ذلك إرشادات لإعداد خطوات تقليل البروتين والألكلة والهضم والتنظيف شبه الآلية؛ بالإضافة إلى مرافقة نصوص بايثون مفتوحة المصدر لبرمجة نظام OT-2 من خلال واجهة برمجة التطبيقات الخاصة به.

يتم توفير ثلاثة نصوص Python هنا متوافقة مع الروبوت OT-2 ، والتي تقوم بإعداد عينة لبروتينات قياس الطيف الكتلي مع ألبومين مصل البقر القياسي للبروتين الواحد (النسخ المتماثلة التقنية n = 5 عمليات الهضم) وعينة من تحلل القلب البشري المحتوي على المنظفات (n = 5 عمليات هضم). يتم تقسيم كل منتج هضم إلى تفاعلين...

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

يتم توفير بروتوكول مفصل وثلاثة نصوص بايثون لتشغيل نظام مناولة سائل روبوتي مفتوح المصدر لإجراء إعداد عينة بروتين شبه آلية لتجارب قياس الطيف الكتلي ، والتي تغطي إزالة المنظفات ، وهضم البروتين ، وخطوات تحلية الببتيد.

معالجة عينات البروتينات البندقية آلية بواسطة روبوت مختبر مفتوح المصدر

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

يستخدم هذا البروتوكول الأتمتة لإجراء مستحضرات الكيمياء الحيوية للبروتين قبل تجارب قياس الطيف الكتلي ، مما يسمح بإنتاجية أعلى وتباين أقل للدراسات البروتينية. يستخدم هذا البروتوكول نظام مناولة سائل منخفض التكلفة وقابل للبرمجة بأسعار معقولة لعدد أكبر من المختبرات. نحن نقدم نصوص Python مفتوحة المصدر يمكن تعديلها لمزيد من التطوير.سيكون عرض الإجراء هو ميلتون أمايا ، طالب الماجستير في مختبرنا. للبدء، افتح noSP3_Digestion. البرنامج النصي PY في محرر النصوص وتحديد المتغيرات الخاصة بالتجربة حسب الحاجة في القسم تخصيص هنا فقط.بعد ذلك، افتح تطبيق Opentrons وقم بتحميل البرنامج النصي إلى علامة التبويب البروتوكول في تطبيق Opentrons. بعد ذلك ، ضع البرامج المختبرية والماصات المطلوبة في الموقع المقابل في سطح OT2 المحدد في البرنامج النصي Python. ثم ضع محلول بيكربونات الأمونيوم في بئر A1 من رف الأنبوب أربعة في واحد مع سطح حامل الأنبوب 15 ملليلتر بالإضافة إلى 50 ملليلتر وضع عينة البروتين في بئر A1 من رف الأنبوب أربعة في واحد مع قمة حامل أنبوب مليلترين.ضع يدويا أنابيب البروتين منخفضة الارتباط التي يبلغ طولها مليلترين في آبار كتلة الألومنيوم الموضوعة أعلى وحدة درجة الحرارة ، بدءا من A1 والانتقال إلى الأسفل عموديا. ثم ضع محلول DTT في بئر A6 من رف الأنبوب أربعة في واحد مع قمة حامل أنبوب سعة 2 ملليلتر. لاحظ بينما ينقل الروبوت حجما مناسبا من المخزن المؤقت لبيكربونات الأمونيوم إلى أنابيب العينة في كتلة الألومنيوم.بعد ذلك ، تحقق يدويا من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة ، تأكد من تحميل DTT في A6 من حامل الأنبوب سعة 2 ملليلتر الموجود في الفتحة الرابعة قبل استئناف البروتوكول. بعد التأكد من موقع أنبوب DTT وفتح غطاء الأنبوب ، انقر فوق الزر استئناف في تطبيق Opentrons للمتابعة. تأكد من أن الروبوت ينقل 10 ميكرولترات من محلول DTT إلى كل عينة بشكل جيد ، تليها خمس جولات خلط.بعد ذلك ، تحقق من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا ويعرض الرسالة ، تأكد من إغلاق الأحرف الكبيرة على أنابيب العينة. ثم ، أغلق أغطية الأنابيب يدويا وانقر فوق استئناف للمتابعة. انتظر حتى تبدأ وحدة درجة حرارة الروبوت في تسخين كتلة الألومنيوم وتصل درجة الحرارة إلى 55 درجة مئوية ، تليها حضانة لمدة خمس دقائق للسماح للعينات بالوصول إلى 55 درجة مئوية.سيقوم الروبوت بعد ذلك بالاحتفاظ بدرجة الحرارة هذه لمدة 30 دقيقة للسماح بتقليل البروتين بواسطة DTT. أثناء الحضانة ، قم بإعداد محلول يودواسيتاميد ولفه يدويا بورق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء. بعد الحضانة ، عندما يتم إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا ويعرض رسالة التحذير ، تأكد من فتح الأحرف الكبيرة على أنابيب العينة ، وقم بإلغاء تغليف أنابيب العينة وانقر فوق استئناف للمتابعة.بعد ذلك ، تحقق يدويا من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا مع رسالة التحذير ، تأكد من تحميل يودواسيتاميد في B6 من رف الأنبوب المكون من مليلترين الموجود في الفتحة الرابعة قبل استئناف البروتوكول. بعد التأكد من موقع حامل أنبوب يودواسيتاميد وفتح غطاء الأنبوب ، انقر فوق استئناف وتأكد من أن الروبوت ينقل 10 ميكرولترات من محلول يودواسيتاميد إلى كل أنبوب عينة ، تليها خمس جولات خلط. عندما يتم إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة ، أغلق الأغطية على أنابيب العينة ، وقم بتغطية أنابيب العينة وتغطيتها بورق ، ثم قم بتغطية كتلة الألومنيوم بأكملها بقطعة نظيفة من الرقائق وانقر فوق استئناف للمتابعة.انتظر حتى يتم تحضين العينات عند 22 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وتأكد من تعطيل وحدة درجة حرارة الروبوت عند الانتهاء من حضانة يودواسيتاميد. عندما يتم إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا ويعرض رسالة التحذير ، تأكد من تحميل التربسين في C6 من رف الأنبوب ثنائي الملليلتر الموجود في الفتحة الرابعة قبل استئناف البروتوكول ، ضع محلول التربسين في بئر C6 من رف الأنبوب ثنائي الملليلتر مع فتح غطاء الأنبوب ، وانقر فوق استئناف للمتابعة. بعد ذلك ، عندما يتم إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا ويعرض رسالة التحذير ، افتح الأحرف الكبيرة على أنابيب العينة في وحدة درجة الحرارة ، وقم بفك غطاء أنابيب العينة وانقر فوق استئناف للمتابعة.في وضع الاستعداد بينما ينقل الروبوت 10 ميكرولترات من التربسين إلى كل أنبوب عينة ، تليها خمس جولات خلط. بعد هضم التربسين بين عشية وضحاها ، قم بتدوير العينات لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة ووضع العينات على رف أنبوب مغناطيسي. بعد دقيقتين ، انقل السوبرناتانت بعناية باستخدام ماصة إلى مجموعة جديدة من أنابيب الطرد المركزي الدقيق منخفضة الارتباط بالبروتين ، واحتفظ بالعينات في الثلاجة.بعد ذلك ، افتح SP3_peptide_cleanup. py Python script في محرر نصوص ، وحدد متغيرات التجربة حسب الحاجة في قسم تخصيص هنا فقط. بعد ذلك، قم بتحميل البرنامج النصي إلى علامة التبويب البروتوكول في تطبيق Opentrons.ضع البرامج المختبرية والماصات المطلوبة في الموقع المقابل في سطح OT2 المحدد في برنامج Python النصي ، وتأكد من تشغيل الوحدة المغناطيسية وتوصيلها بالروبوت. ضع صفيحة بئر جديدة بعمق 96 ملليلتر في الجزء العلوي من الوحدة المغناطيسية. بعد ذلك ، ضع العينات المهضومة في رف الأنبوب المكون من مليلترين بدءا من A1 والانتقال لأسفل عموديا.بعد ذلك ، تأكد من أن الروبوت ينقل 55 ميكرولتر من العينات المهضومة إلى الآبار في ألواح الآبار العميقة على الوحدة المغناطيسية. تحقق من إيقاف بروتوكول الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة، تأكد من تحميل الخرز الجاهز في A6 من حامل الأنبوب ثنائي الملليلتر الموجود في الفتحة الرابعة قبل استئناف البروتوكول. ثم ، قم بتدوير دوامة حبات SP3 لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة ووضعها في بئر A6 من رف الأنبوب ثنائي الملليلتر مع فتح الغطاء.تحقق من إيقاف برنامج الروبوتات مؤقتا وعرض الرسالة ، تأكد من تحميل 80٪ من الإيثانول في A4 من رف الأنبوب 15 ملليلتر بالإضافة إلى 50 ملليلتر الموجود في الفتحة الخامسة قبل استئناف البروتوكول. ثم ، ضع محلول إيثانول 80٪ في بئر A4 في رف الأنبوب وانقر فوق استئناف للمتابعة. لاحظ بينما يغير الروبوت سرعة السحب لإبطاء ، ويشفط المادة الفائقة من كل بئر ، ويوزعها في أنبوب النفايات.انتظر حتى يغير الروبوت سرعة السحب مرة أخرى إلى الوضع الافتراضي ويفصل الوحدة المغناطيسية. عندما يتم إيقاف برنامج الروبوتات مؤقتا ويعرض الرسالة ، افتح الغطاء على أنبوب بيكربونات الأمونيوم ، وافتح غطاء محلول بيكربونات الأمونيوم ، ثم انقر فوق استئناف للمتابعة. في وضع الاستعداد بينما يقوم الروبوت بفصل الوحدة المغناطيسية ، ينقل 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لبيكربونات الأمونيوم إلى كل بئر ، ويخلط على الفور لمدة 10 مرات.بعد ذلك ، لاحظ بينما يغير الروبوت سرعة السحب إلى إبطاء ، وينقل supernatant من كل بئر إلى أنبوب النفايات. انتظر حتى ينقل الروبوت 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لبيكربونات الأمونيوم إلى كل بئر ويخلط على الفور لمدة 10 مرات. تحقق من إيقاف برنامج الروبوتات مؤقتا وعرض الرسالة ، تأكد من وضع أنابيب تجميع جديدة في كتلة الألومنيوم ذات الملليلتر قبل استئناف البروتوكول.بعد ذلك ، ضع مجموعة جديدة من أنابيب الطرد المركزي الدقيق منخفضة الاحتفاظ بالبروتين في كتلة الألومنيوم مباشرة بعد أنبوب العينة الأخير في البداية في الكتلة ، وانقر فوق استئناف للمتابعة. في وضع الاستعداد بينما ينقل الروبوت كل عينة في المخزن المؤقت لبيكربونات الأمونيوم إلى الأنابيب الجديدة التي يبلغ طولها مليلترين. عندما يتم إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا ويعرض الرسالة، تأكد من تحميل التربسين في C6 من رف الأنبوب ثنائي الملليلتر الموجود في الفتحة الرابعة قبل استئناف البروتوكول، وضع محلول التربسين في بئر C6 من رف الأنبوب ثنائي الملليلتر مع فتح غطاء الأنبوب، وانقر على استئناف للمتابعة.بمجرد الانتهاء من تشغيل البرنامج ، قم بلف أغطية أنبوب العينة بفيلم البارافين ، ونقل جميع العينات إلى خلاط يتم التحكم في درجة حرارته ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 20 ساعة مع اهتزاز 1000 دورة في الدقيقة. مع عينة BSA ، تم تحديد وسط من 728 تطابق طيف الببتيد و 65 الببتيد ، مع معاملات تباين 5.2٪ و 3.2٪ ، على التوالي. مع عينة قلب معقدة ، تم تحديد وسط من 9،526 تطابق طيف الببتيد ، و 7،558 الببتيد ، و 1،336 بروتين في 10 أشواط مع 7.6 ٪ 5.9 ٪ و 3.6 ٪ من معاملات التباين ، على التوالي.لتحديد التباين في قياس كمية الببتيد ، تم حساب معاملات التباين في كثافة كروماتوجرام الأيونات المستخرجة ل 10 ببتيدات ترتبط ببروتين فريد. عندما تمت مقارنة تباين النتائج التجريبية للإنسان مقابل الروبوت في قياس تركيز البروتين مع فحص BCA ، كان متوسط معامل التباين في فحص BCA للروبوت أقل من فحص BCA اليدوي البشري. يقلل هذا البروتوكول من وقت الجلوس لمعالجة كل عينة.إنه يمهد الطريق لنا لاستكشاف الاختلافات في البروتينات في لوحة من خطوط الخلايا بين العلاجات الدوائية المتعددة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS للمتعمقة توصيف والكمي لالجلوتامين والهليونين نزع الأميد في البندقية البروتيوميات

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

إعداد الأقسام الفرعية بلاستيدات الخضراء من نبات لتحليل البروتين التعريب Immunoblotting أو البروتيوميات

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

استخدام خط أنابيب MALDI TOF-MS IDBac المفتوح المصدر لتحليل البروتين الميكروبي وبيانات المستقلب المتخصصة

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

حامل عينة الكل في واحد لبلورات الأشعة السينية الجزيئية مع الحد الأدنى من تشتت الخلفية

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

إعداد عينة البلازما لقياس الطيف الكتلي باستخدام محطة عمل آلية

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

إعداد عينة TMT لتقديم مرافق Proteomics وتحليل البيانات اللاحقة

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

إجراء قياسات دقيقة ودقيقة أحادية الجزيء FRET باستخدام smfBox مفتوح المصدر

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...