Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

这项工作得到了NIH授予YH的F32-HL149191奖的部分支持;R00-HL144829 至 EL;R21-HL150456， R00-HL127302， R01-HL141278 至 MPL. 图 1、 图 2、 图 3 是在基于 Web 的科学插图工具（BioRender.com）的帮助下创建的。

开发的Python脚本已存放在GitHub上，网址为：https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons。脚本的副本在 补充文件 1 中给出。有关最新版本，请参阅 GitHub 存储库。
1. 实验准备
<ol><li>在启动协议之前检查所需的硬件。 注：需要以下硬件组件：OT-2 移液器、移液器吸头、4 合 1 管架套件、铝块套件、磁性模块、温度模块、96 孔 2 mL 深孔板（见 ...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions.">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li><li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+reproducibility,+human+error,+and+public+policy.">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li><li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

协议中的关键步骤 为了获得最佳性能，应使用与OT-2兼容的Opentrons验证的实验室器具，模块和耗材。可以按照 Opentrons 在 Reference14 中的说明创建自定义实验室器具。确保在首次使用时校准OT-2甲板，移液器和实验室器具。遵循SP3磁珠制造商的指南来制备用于肽和蛋白质纯化的微球也至关重要。值得注意的是，在磁珠和肽结合反应过程中，结合反应中乙腈的体积需要?...

基于质谱的鸟枪蛋白质组学是同时测量生物样品中许多蛋白质丰度的有力工具。具有生物信息学分析的蛋白质组学实验通常用于识别生物标志物并发现支持病理机制的相关生物复合物和途径。凭借其高分析物特异性和潜在的定量准确性，鸟枪蛋白质组学还具有极好的潜力，可以被研究机构和诊断实验室用于临床样品分析，而无需依赖抗体1，2。
为了制备用于鸟枪蛋白质组学分析的蛋白质样品，从生物样品（例如，细胞和组织）中提取的蛋白质通常首先需要使用冗长的方案进行处理，包括测量样品蛋白质浓度，蛋白质还原和烷基化，以及酶消化成肽。此外，在含有去垢剂的普通裂解缓冲液中提取的蛋白质在分析之前通常需要额外的缓冲液交换或去除洗涤剂的步骤，因为洗涤剂会干扰胰蛋白酶消化并显着降低下游液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）分析的性能3。肽通常在酶消化后在LC-MS / MS相容性溶剂中进一步脱盐，干燥和重组。这些蛋白质生化程序可能是劳动密集型和耗时的。因此，它们继续限制蛋白质组学工作流程的通量，并导致所获取数据的可变性4，5。人为错误和偏差已被公认为影响数据方差和可重复性的关键因素6，7。为了最大限度地减少质谱样品制备工作流程中的人为错误，已利用自动移液机器人系统来提高鸟枪蛋白质组学和靶向质谱分析中蛋白质鉴定和定量的通量和再现性，其中这些进步被誉为有助于继续推动蛋白质组学技术在关键研究和临床环境中的广泛采用8，9，10，11，12，13。然而，大多数现有的协议都使用机器人液体处理平台，这些平台需要大量的投资和培训，限制了它们在学术环境中的许多实验室中的实用性，或者预算有限。
本文介绍了一种方案，该协议利用低成本、开源的机器人液体处理系统OT-2，对典型的鸟枪蛋白质组学样品制备工作流程进行半自动化。OT-2的成本低于许多其他机器人液体处理系统，在撰写本文时，成本约为5，000美元。当考虑到不同模块和实验室器皿的价格时，在撰写本文时，在该协议中设置实验的总成本约为10，000美元，这使得它对于更广泛的实验室来说比更昂贵的选择更实惠。OT-2通过Python脚本与开源编程兼容，并在用户定义的DIY协议设计中提供了极大的灵活性。使用三个内部开发的脚本，下面的方案涵盖了在OT-2站上执行典型的鸟枪蛋白质组学样品制备工作流程，具有典型的蛋白质标准品（牛血清白蛋白;BSA）和正常人心裂解物的复杂蛋白质样品（图1）。处理（1）BSA样本和（2）复杂心脏裂解物样本的程序分别在方案第1，2，5，6和3，4，5，6节中详细说明。Sera-Mag羧酸盐修饰的磁珠用于单罐固相增强样品制备（SP3），以去除蛋白质和肽样品中的去垢剂和盐。来自牛血清白蛋白和人心脏蛋白的胰蛋白酶消化物通过SP3微球进一步清洁并提交LC-MS / MS分析。然后使用MaxQuant软件分析质谱，以进行肽和蛋白质鉴定。我们执行的代表性结果表明，该协议实现了出色的技术变异系数（CV），同时节省了工作时间，并且不劣于手工消化。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

基于质谱的鸟枪蛋白质组学实验需要多个样品制备步骤，包括酶蛋白消化和纯化，这可能占用大量的工作台劳动，并存在批次间变异性的来源。使用移液机器人实现实验室自动化可以减少手动工作，最大限度地提高通量，并提高研究的可重复性。尽管如此，标准自动化站的起始价格高昂，使许多学术实验室无法负担得起。本文介绍了使用经济实惠的开源自动化系统（Opentrons OT-2）的蛋白质组学样品制备工作流程，包括设置半自动蛋白质还原，烷基化，消化和纯化步骤的说明;以及随附的开源Python脚本，通过其应用程序编程接口对OT-2系统进行编程。

这里提供了三个与OT-2机器人兼容的Python脚本，它们使用单个蛋白质标准牛血清白蛋白（技术复制n = 5个消化）和一个含有洗涤剂的人心脏裂解物样品（n = 5个消化）执行质谱蛋白质组学的样品制备。每个消化产物被分成两个肽纯化反应。在每次运行BSA和心脏样品中，已鉴定的肽谱匹配（PSM），肽和蛋白质的数量如图 4 和 图5所示。BSA样本的中位数为728 PS...

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Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

提供了详细的协议和三个Python脚本，用于操作开源机器人液体处理系统，以执行质谱实验的半自动蛋白质样品制备，包括去垢剂去除，蛋白质消化和肽脱盐步骤。

Shotgun 蛋白质组学 样品处理 由开源实验室机器人自动执行

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

该协议使用自动化在质谱实验之前执行蛋白质生物化学制备，从而为蛋白质组学研究提供更高的通量和更低的变异性。该协议使用低成本，可编程的液体处理系统，这是更多实验室负担得起的。我们提供开源 Python 脚本，可以对其进行修改以进行进一步开发。演示该过程的将是Milton Amaya，我们实验室的硕士生。首先，打开noSP3_Digestion。在文本编辑器中编写 py 脚本，并在"仅在此处自定义"部分中根据需要指定特定于实验的变量。然后，打开 Opentrons 应用程序并将脚本上传到 Opentrons 应用程序中的"协议"选项卡。接下来，将所需的实验室器具和移液器放在Python脚本中指定的OT2甲板中的相应位置。然后，将碳酸氢铵溶液置于具有15毫升加50毫升管架顶部的四合一管架的A1孔中，并将蛋白质样品置于具有两毫升管架顶部的四合一管架的A1孔中。手动将两毫升蛋白质低结合管置于温度模块顶部的铝块孔中，从A1开始垂直向下移动。然后，将DTT溶液放在四合一管架的A6孔中，顶部有一个两毫升的管架。观察机器人将适当体积的碳酸氢铵缓冲液转移到铝块中的样品管中。然后，手动验证机器人程序是否已暂停并显示消息，确保DTT已加载到位于插槽4中的两毫升管架的A6中，然后再恢复协议。确认DTT管的位置并打开管盖后，单击Opentrons应用程序中的"恢复"按钮以继续。确保机器人将10微升的DTT溶液转移到每个样品孔中，然后进行五轮混合。接下来，验证机器人程序是否已暂停并显示消息，确保关闭样品管上的盖子。然后，手动关闭管的盖子，然后单击"恢复"以继续。等到机器人的温度模块开始加热铝块，温度达到55摄氏度，然后进行五分钟的孵育，让样品达到55摄氏度。然后，机器人将保持该温度30分钟，以允许DTT减少蛋白质。在孵育过程中，准备碘乙酰胺溶液并用铝箔手动包裹，以避免暴露在光线下。孵育后，当机器人的程序暂停并显示警告消息时，确保打开样品管上的盖子，打开样品管的盖子，然后单击"恢复"继续。接下来，手动验证机器人的程序是否已暂停并显示警告消息，在恢复协议之前，请确保碘乙酰胺已加载到位于插槽4中的两毫升管架的B6中。确认碘乙酰胺管的架子位置并打开管盖后，单击"恢复"并确保机器人将10微升碘乙酰胺溶液转移到每个样品管中，然后进行五轮混合。当机器人的程序暂停并显示消息时，关闭样品管上的盖子，盖上样品管并用箔片覆盖它们，然后用干净的箔片覆盖整个铝块，然后单击恢复继续。等到样品在22摄氏度下孵育30分钟，并确保机器人的温度模块在碘乙酰胺孵育完成后停用。当机器人的程序暂停并显示警告消息时，确保胰蛋白酶已加载到恢复方案之前位于插槽4中的两毫升管架的C6中，将胰蛋白酶溶液放入管盖打开的两毫升管架的C6孔中，然后单击恢复继续。然后，当机器人的程序暂停并显示警告消息时，打开温度模块上样品管上的盖子，打开样品管的盖子，然后单击恢复继续。待机时，机器人将10微升胰蛋白酶转移到每个样品管中，然后进行五轮混合。胰蛋白酶消化过夜后，使用台式微量离心机短暂旋转样品，并将样品放在磁管架上。两分钟后，用移液管将上清液小心地转移到一组新的蛋白质低结合微量离心管中，并将样品保存在冰箱中。接下来，打开SP3_peptide_cleanup。在文本编辑器中使用 py Python 脚本，并在"仅在此处自定义"部分中根据需要指定实验变量。然后，将脚本上传到 Opentrons 应用程序中的"协议"选项卡。将所需的实验室器具和移液器放在Python脚本中指定的OT2甲板中的相应位置，并确保磁性模块已打开电源并连接到机器人。在磁性模块的顶部放置一个新的两毫升，96孔深的孔板。接下来，将消化的样品放入从A1开始垂直向下移动的两毫升管架中。然后，确保机器人将55微升的消化样品转移到磁性模块上的深孔板中的孔中。验证机器人协议是否已暂停并显示消息，在恢复协议之前，请确保准备好的磁珠已加载到位于插槽4中的两毫升管架的A6中。然后，在微型台式离心机中涡旋SP3珠子并短暂旋转，并将它们放置在两毫升管架的A6孔中，盖子打开。验证机器人程序是否已暂停并显示消息，确保在恢复协议之前，已将80%乙醇加载到位于插槽5中的15毫升加50毫升管架的A4中。然后，将80%乙醇溶液放入管架中的A4孔中，然后单击"恢复"继续。观察机器人何时将移液速度变慢，从每个孔中吸出上清液，并将其分配到废液管中。等到机器人将移液速度变回默认值并脱离磁性模块。当机器人程序暂停并显示消息时，打开碳酸氢铵管上的盖子，打开碳酸氢铵溶液的盖子，然后单击"恢复"继续。待机时，机器人脱离磁性模块，将250微升碳酸氢铵缓冲液转移到每个孔中，并立即混合10次。然后，观察机器人将移液速度变慢，并将上清液从每个孔转移到废液管中。等到机器人将100微升碳酸氢铵缓冲液转移到每个孔中，并立即混合10次。验证机器人程序是否已暂停并显示消息，确保在恢复协议之前已将新的收集管放置在两毫升铝块中。然后，在最初在块中的最后一个样品管之后立即将一组新的低蛋白保留微量离心管放入铝块中，然后单击"恢复"继续。待机，而机器人将碳酸氢铵缓冲液中的每个样品转移到新的两毫升管中。当机器人的程序暂停并显示消息时，确保胰蛋白酶已加载到位于插槽4中的两毫升管架的C6中，然后再恢复方案，将胰蛋白酶溶液放入管盖打开的两毫升管架的C6孔中，然后单击恢复继续。程序运行完成后，用石蜡膜包裹样品管盖，将所有样品转移到温控混合器中，并在37摄氏度下孵育16至20小时，振动1， 000 RPM。使用BSA样品，鉴定出728个肽谱匹配的培养基和65个肽，变异系数分别为5.2%和3.2%。对于复杂的心脏样本，在10次运行中鉴定出9，526个肽谱匹配，7，558个肽和1，336个蛋白质的培养基，分别具有7.6%5.9%和3.6%的变异系数。为了确定肽定量的变异性，计算了映射到独特蛋白质的10种肽的提取离子色谱图强度的变化系数。当将人与机器人实验结果在测量蛋白质浓度方面的变异性与BCA测定进一步比较时，机器人BCA测定的平均变异系数低于人体手动BCA测定。该协议减少了处理每个样品的台架时间。它为我们探索多种药物治疗之间细胞系中的蛋白质组学差异铺平了道路。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

使用开源 smfBox 进行精确和准确的单分子 FRET 测量

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Shotgun 蛋白质组学 样品处理 由开源实验室机器人自动执行

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