Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af NIH awards F32-HL149191 til YH; R00-HL144829 til EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 til MPL. Figur 1, figur 2, figur 3 oprettes ved hjælp af et webbaseret videnskabeligt illustrationsværktøj, BioRender.com.

De udviklede Python scripts er blevet deponeret på GitHub på: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Der er angivet en kopi af scriptene i supplerende fil 1. Der henvises til GitHub-lageret for at få de nyeste versioner.
1. Eksperimentelle præparater
<ol><li>Kontroller den nødvendige hardware, før protokollen startes. BEMÆRK: Følgende hardwarekomponenter er påkrævet: OT-2 pipetter, pipettespidser, 4-i-1 rørholdersæt, al...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions.">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li><li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+reproducibility,+human+error,+and+public+policy.">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li><li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

Kritiske trin i protokollen For at opnå den bedste ydeevne bør Der anvendes Opentrons-verificerede labware, moduler og forbrugsvarer, der er kompatible med OT-2. Custom labware kan oprettes efter Opentrons 'instruktion på Reference14. Sørg for at kalibrere OT-2 dæk, pipetter og labware, når de anvendes for første gang. Det er også vigtigt at følge retningslinjerne fra SP3 perler producent til at forberede perler til peptid og protein oprydning. Navnlig under perle- og ...

Massespektrometri-baserede shotgun proteomics er et kraftfuldt værktøj til at måle overflod af mange proteiner i biologiske prøver samtidigt. Proteomics eksperimenter med bioinformatik analyse er rutinemæssigt ansat til at identificere biomarkører og opdage tilknyttede biologiske komplekser og veje, der understøtter patologiske mekanismer. Med sin høje analysand specificitet og potentielle kvantitative nøjagtighed, shotgun proteomics har også fremragende potentiale til at blive vedtaget af forskningsfaciliteter og diagnostiske laboratorier til klinisk prøve analyse uden behov for at stole på antistoffer1,2.
For at forberede proteinprøver til shotgun proteomics analyse, proteiner udvundet fra biologiske prøver (f.eks celler og væv) typisk først skal behandles ved hjælp af lange protokoller, herunder måling af prøven proteinkoncentration, protein reduktion, og alkylation, og enzymatisk fordøjelse i peptider. Desuden kræver proteiner, der udvindes i almindelige lysisbuffere, der indeholder rengøringsmidler, ofte yderligere trin til bufferudveksling eller fjernelse af vaskemiddel før analyse, fordi vaskemiddel kan forstyrre trypsin fordøjelsen og forringe ydeevnen af downstream flydende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) analyse3. Peptider er typisk yderligere afsaltet, tørret og rekonstitueret i LC-MS/MS kompatible opløsningsmidler efter enzymatisk fordøjelse. Disse protein biokemi procedurer kan være arbejdskrævende og tidskrævende. De begrænser således fortsat proteomics arbejdsganges gennemløb og bidrager til variationen af erhvervede data4,5. Menneskelige fejl og fordomme er blevet anerkendt som afgørende faktorer, der påvirker dataafvigelse og reproducerbarhed6,7. For at minimere menneskelige fejl i arbejdsgange for massespektrometriprøvepræparater er automatiserede pipetteringrobotsystemer blevet anvendt til at forbedre gennemløbet og reproducerbarheden af proteinidentifikation og kvantificering fra shotgun proteomics og målrettet massespektrometrianalyse, hvor sådanne fremskridt er blevet hyldet som medvirkende til at fortsætte presset for udbredt indførelse af proteomicsteknologier i kritisk forskning og kliniske indstillinger8 9,10,11,12,13. Men de fleste eksisterende protokoller udnytter robot flydende håndtering platforme, der kræver betydelige investeringer og uddannelse, begrænse deres nytte i mange laboratorier i det akademiske miljø eller på anden måde med et begrænset budget.
I denne artikel beskrives en protokol, der bruger et billigt, open source robotvæskehåndteringssystem, OT-2, til at semiautomatere en typisk arbejdsgang for præparat af proteomics-prøver. OT-2 har en lavere pris end mange andre robot flydende håndteringssystemer, og i skrivende stund koster omkring $ 5.000 dollar. Når factoring i priserne på forskellige moduler og labware, de samlede omkostninger til at oprette eksperimenter i denne protokol i skrivende stund er omkring $ 10.000, hvilket gør det mere overkommeligt at et betydeligt bredere sæt af laboratorier over dyrere muligheder. OT-2 er kompatibel med open source programmering gennem Python scripts og tilbyder stor fleksibilitet i brugerdefinerede DIY protokol design. Ved hjælp af tre in-house udviklede scripts dækker protokollerne nedenfor, der udfører en typisk shotgun proteomics prøveforberedelsesarbejdsgang på OT-2-stationen med en arketypisk proteinstandard (kvægserumalbumin; BSA) og en kompleks proteinprøve af et normalt humant hjertelysat (figur 1). Procedurerne for behandling (1) en BSA-prøve og (2) en kompleks hjertelyatprøve er beskrevet i protokolafsnit 1, 2, 5, 6 og 3, 4, 5, 6. Sera-Mag carboxylate-modificerede magnetiske perler anvendes i enkelt-pot solid-fase-forbedret prøve forberedelse (SP3) for at fjerne rengøringsmidler og salte i protein og peptid prøver. Tryptiske fordøjer fra kvæg serum albumin og menneskelige hjerte proteiner er yderligere renset af SP3 perler og forelagt til LC-MS / MS analyse. Massespektre analyseres derefter ved hjælp af MaxQuant-softwaren til peptid og proteinidentifikation. Repræsentative resultater udført af os viser, at protokollen opnår fremragende tekniske koefficienter for variation (CV), samtidig med at bænktid sparer tid og er ikke-ringere end håndfordøje.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

Massespektrometri-baserede shotgun proteomics eksperimenter kræver flere prøve forberedelse trin, herunder enzymatisk protein fordøjelse og oprydning, som kan tage op betydelige person-timer af bænk arbejdskraft og præsentere en kilde til batch-til-batch variabilitet. Lab automatisering med pipetter robotter kan reducere manuelt arbejde, maksimere gennemløbet, og øge forskning reproducerbarhed. Alligevel gør de stejle startpriser på standardautomatiseringsstationer dem uoverkommelige for mange akademiske laboratorier. I denne artikel beskrives en arbejdsproces for forberedelse af proteomics prøver ved hjælp af et prisbilligt automatiseringssystem (The Opentrons OT-2), herunder instruktioner til opsætning af halvautomatisk proteinreduktion, alkylering, fordøjelse og oprydningstrin. samt ledsagende open source Python scripts til at programmere OT-2-systemet gennem sin ansøgning programmering interface.

Her findes tre Python-scripts, der er kompatible med OT-2-robotten, og som udfører prøveforberedelse til massespektrometri proteomics med et enkelt proteinstandard kvægserumalbumin (teknisk replikerer n = 5 fordøjelser) og en vaskemiddelholdig prøve af menneskehjertelyat (n = 5 fordøjelser). Hvert fordøjeprodukt er opdelt i to peptidoprydningsreaktioner. Antallet af identificerede peptidspektrumsmatchs (PPM'er), peptider og proteiner i hver kørsel af BSA- og hjerteprøverne er vist i figur 4<...

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Detaljeret protokol og tre Python scripts er fastsat for drift af en open source robot væske håndtering system til at udføre semi-automatiseret protein prøve forberedelse til massespektrometri eksperimenter, der dækker fjernelse af vaskemiddel, protein fordøjelse, og peptid afsaltning trin.

Shotgun Proteomics prøvebehandling automatiseret af en open source lab robot

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Denne protokol bruger automatisering til at udføre proteinbiokemipræparater forud for massespektrometriforsøg, hvilket giver mulighed for højere gennemløb og lavere variation for proteomiske undersøgelser. Denne protokol bruger et billigt, programmerbart væskehåndteringssystem, der er overkommeligt for flere laboratorier. Vi leverer open source Python scripts, der kan ændres til videre udvikling.Demonstrere proceduren vil være Milton Amaya, en kandidatstuderende i vores laboratorium. Til at begynde med skal du åbne noSP3_Digestion. py script i teksteditoren og angiv de eksperimentspecifikke variabler efter behov i afsnittet TILPAS KUN HER.Åbn derefter Opentrons-appen, og overfør scriptet til fanen Protokol i Opentrons-appen. Placer derefter de nødvendige labware og pipetter på det tilsvarende sted i OT2-dækket, der er angivet i Python-scriptet. Derefter placere ammonium bicarbonatopløsning i A1 brønd af fire-i-en rør rack med 15-milliliter plus 50-milliliter rørholder top og placere proteinprøven i A1 godt af fire-i-en rør rack med en to-milliliter rørholder top.Placer manuelt to milliliterprotein lavbindingsrør i brøndene i aluminiumsblokken placeret oven på temperaturmodulet, startende fra A1 og bevæger sig lodret ned. Placer derefter DTT-opløsningen i A6-brønden på den fire-i-en rørholder med en to milliliter rørholder top. Vær opmærksom, mens robotten overfører en passende mængde af ammoniumbicarbonatbufferen til prøverørene i aluminiumsblokken.Kontroller derefter manuelt, at robotprogrammet er sat på pause, og viser meddelelsen, Sørg for, at DTT er indlæst i A6 i det to milliliterrørsstativ, der er placeret i slot fire, før protokollen genoptages. Når du har bekræftet placeringen af DTT-røret og åbnet rørhætten, skal du klikke på knappen Fortsæt i Opentrons-appen for at fortsætte. Sørg for, at robotten overfører 10 mikroliter af DTT-opløsningen til hver prøvebønd efterfulgt af fem blandingsrunder.Kontroller derefter, at robotprogrammet er sat på pause, og viser meddelelsen Sørg for at lukke hætter på prøverør. Luk derefter rørenes hætter manuelt, og klik på Fortsæt for at fortsætte. Vent til robottens temperaturmodul begynder at opvarme aluminiumsblokken, og temperaturen når 55 grader Celsius, efterfulgt af en fem minutters inkubation for at give prøverne mulighed for at komme til 55 grader Celsius.Robotten vil derefter holde denne temperatur i 30 minutter for at tillade proteinreduktion ved DTT. Under inkubationen forberedes iodoacetamidopløsningen og pakkes manuelt med aluminiumsfolie for at undgå udsættelse for lys. Når robottens program er sat på pause, og advarselsmeddelelsen vises, skal du sørge for at åbne hætter på prøverør, tage prøverørene ud og klikke på Fortsæt for at fortsætte.Dernæst manuelt kontrollere, at robottens program er sat på pause med advarselsmeddelelsen, Sørg iodoacetamid er blevet indlæst i B6 af de to-milliliter rør rack placeret i slot fire før genoptage protokollen. Efter at have bekræftet rackplaceringen af iodoacetamidrøret og åbnet rørhætten, skal du klikke på Fortsæt og sikre, at robotten overfører 10 mikroliter af iodoacetamidopløsningen til hvert prøverør efterfulgt af fem blandingsrunder. Når robottens program er sat på pause og viser meddelelsen, Luk hætter på prøverør, hætter prøverørene og dæk dem med folie, dæk derefter hele aluminiumsblokken med et rent stykke folie og klik på Fortsæt for at fortsætte.Vent til prøverne inkuberes ved 22 grader Celsius i 30 minutter, og sørg for, at robottens temperaturmodul deaktiveres ved afslutningen af iodoacetamidinkubationen. Når robottens program er sat på pause og viser advarselsmeddelelsen, Sørg trypsin er blevet indlæst i C6 af to-milliliter rør rack placeret i slot fire forud for genoptagelse af protokollen, placere trypsin løsning i C6 godt af to-milliliter rør rack med rør hætten åben, og klik på Fortsæt for at fortsætte. Når robottens program derefter er sat på pause og viser advarselsmeddelelsen, åbnes hætter på prøverør på temperaturmodulet, udtag prøverørene og klik på Fortsæt for at fortsætte.Standby, mens robotten overfører 10 mikroliter trypsin til hvert prøverør, efterfulgt af fem blandingsrunder. Efter natten trypsin fordøjelse, kort spin prøverne ved hjælp af en bordplade mikrocentrifuge og placere prøverne på en magnetisk rør rack. Efter to minutter overføres supernatanten omhyggeligt med en pipette til et nyt sæt protein lavbindingsmikrocentrifugerør og opbevares prøverne i køleskab.Åbn derefter SP3_peptide_cleanup. py Python script i en tekst editor, og angiv eksperiment variabler efter behov i tilpas her kun sektion. Overfør derefter scriptet til fanen Protokol i Opentrons-appen.Placer de nødvendige labware og pipetter på det tilsvarende sted i OT2-dækket, der er angivet i Python-scriptet, og sørg for, at det magnetiske modul er tændt og tilsluttet robotten. Placer en ny, to-milliliter, 96-godt dyb brønd plade på toppen af det magnetiske modul. Placer derefter de fordøjede prøver i to milliliterrørsstativet, der starter fra A1 og bevæger sig lodret ned.Derefter skal du sikre robotten overfører 55 mikroliter af de fordøjede prøver til brøndene i de dybe brøndplader på det magnetiske modul. Kontroller, at robotprotokollen er sat på pause og viser meddelelsen, Sørg for, at forberedte perler er blevet indlæst i A6 i det to milliliter rørstativ, der er placeret i slot fire, før protokollen genoptages. Derefter hvirvle og kort spin SP3 perler i en mini-benchtop centrifuge og placere dem i A6 godt af to-milliliter rør rack med hætten åben.Kontroller, at robotter programmet er sat på pause og viser meddelelsen, Sørg for 80% ethanol er blevet indlæst i A4 af 15-milliliter plus 50-milliliter rør rack placeret i slot fem før genoptagelse af protokollen. Derefter placere en 80% ethanol løsning i A4 godt i røret rack og klik på Fortsæt for at fortsætte. Vær opmærksom på, mens robotten ændrer pipetterhastigheden for at bremse, aspirerer supernatanten fra hver brønd og dispenserer den ind i affaldsrøret.Vent, indtil robotten ændrer pipetterhastigheden tilbage til standard og frigør det magnetiske modul. Når robotter programmet er sat på pause og viser budskabet, Open cap på ammonium bicarbonat rør, åbne hætten af ammonium bicarbonat løsning, og derefter klikke på Fortsæt for at fortsætte. Standby, mens robotten frakobler det magnetiske modul, overfører 250 mikroliter af ammoniumbicarbonatbufferen til hver brønd og blandes straks 10 gange.Derefter observere, mens robotten ændrer pipetteringshastigheden til langsom og overfører supernatanten fra hver brønd til affaldsrøret. Vent til robotten overfører 100 mikroliter af ammoniumbicarbonatbufferen til hver brønd og blandes straks 10 gange. Kontroller, at robotter programmet er sat på pause og viser meddelelsen, Sørg for nye indsamling rør er blevet placeret i to-milliliter aluminium blok forud for genoptagelse af protokollen.Derefter placere et nyt sæt af lav-protein-retention mikrocentrifuge rør i aluminium blok umiddelbart efter den sidste prøve rør i første omgang i blokken, og klik på Fortsæt for at fortsætte. Standby, mens robotten overfører hver prøve i ammoniumbicarbonatbufferen til de nye to milliliterrør. Når robottens program er sat på pause og viser meddelelsen, Sørg trypsin er blevet indlæst i C6 af to-milliliter rør rack placeret i slot fire forud for genoptagelse af protokollen, placere trypsin løsning i C6 godt af to-milliliter rør rack med rør hætten åben, og klik på Fortsæt for at fortsætte.Når programmet er færdig med at køre, wrap prøven rør hætter med paraffin film, overføre alle prøverne til en temperatur-kontrolleret mixer, og inkubere ved 37 grader Celsius i 16 til 20 timer med 1.000 RPM ryste. Med BSA-prøven blev der identificeret et medium på 728 peptidspektrumsmatch og 65 peptider med henholdsvis 5,2 % og 3,2 % variationskoefficienter. Med en kompleks hjerteprøve blev der identificeret et medium på 9. 526 peptidspektrumsmatch, 7.558 peptider og 1.336 proteiner i 10 kørsler med henholdsvis 7,6%5,9% og 3,6%variationskoefficienter.For at bestemme variabiliteten i peptid kvantificering blev variationskoefficienterne for de ekstraherede ionkromatogramintensiteter beregnet for 10 peptider, der kortlægger til et unikt protein. Når variationen i human versus robot eksperimentelle resultater i måling af proteinkoncentration blev yderligere sammenlignet med BCA-analysen, var den gennemsnitlige variationskoefficient for robot BCA-analysen lavere end den menneskelige manuelle BCA-analyse. Denne protokol reducerer bænkens tid til behandling af hver prøve.Det baner vejen for os at udforske proteomics forskelle i et panel af cellelinjer i mellem flere lægemiddelbehandlinger.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiseret Akustisk Udlevering til seriel fortynding af peptid agonister i Potens Bestemmelse assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS for Indgående Karakterisering og Kvantificering af glutamin og asparagin deamidering i Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantificering af Protein Homo-oligomerisering ved hjælp af kommercielle instrumentering og gratis, Open Source lysstyrke analyse Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Forberedelse af grønkorn sub rum fra Arabidopsis til analyse af Protein lokalisering af Immunoblotting eller Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning af proteinubiquitinationssteder ved peptidberigelse og massespektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Brug af open source-MALDI TOF-MS IDBac-rørledningen til analyse af mikrobiel protein og specialiserede metabolit data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En all-in-One-prøve holder til makromolekylær røntgenkrystallografi med minimal baggrunds spredning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

En forberedelse til plasmaprøve til massespektrometri ved hjælp af en automatiseret arbejdsstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse til Proteomics Facility Indsendelse og efterfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Præcis og præcis enkeltmolekyle FRET-målinger ved hjælp af Open Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...