Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-awards F32-HL149191 aan YH; R00-HL144829 naar EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 naar MPL. Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3 zijn gemaakt met behulp van een webgebaseerde wetenschappelijke illustratietool, BioRender.com.

De ontwikkelde Python scripts zijn gedeponeerd op GitHub op: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Een kopie van de scripts wordt gegeven in Aanvullend Bestand 1. Raadpleeg de GitHub-repository voor de nieuwste versies.
1. Experimentele preparaten
<ol><li>Controleer de vereiste hardware voordat u het protocol start. OPMERKING: De volgende hardwarecomponenten zijn vereist: OT-2 pipetten, pipetpunten, 4-in-1 buisrekset, aluminium bl...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions.">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li><li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+reproducibility,+human+error,+and+public+policy.">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li><li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

Kritieke stappen binnen het protocol Voor de beste prestaties moeten Opentrons-geverifieerde labware, modules en verbruiksartikelen worden gebruikt die compatibel zijn met OT-2. Aangepaste labware kan worden gemaakt volgens de instructies van Opentrons op Reference14. Zorg ervoor dat u het OT-2-dek, de pipetten en de labware kalibreert wanneer u het voor de eerste keer gebruikt. Het is ook van cruciaal belang om de richtlijnen van de fabrikant van SP3-kralen te volgen om kralen...

Op massaspectrometrie gebaseerde shotgun proteomics is een krachtig hulpmiddel om de overvloed aan vele eiwitten in biologische monsters tegelijkertijd te meten. Proteomics-experimenten met bioinformatica-analyse worden routinematig gebruikt om biomarkers te identificeren en geassocieerde biologische complexen en paden te ontdekken die ten grondslag liggen aan pathologische mechanismen. Met zijn hoge analytspecificiteit en potentiële kwantitatieve nauwkeurigheid heeft shotgun proteomics ook een uitstekend potentieel om te worden overgenomen door onderzoeksfaciliteiten en diagnostische laboratoria voor klinische monsteranalyse zonder de noodzaak om te vertrouwen op antilichamen1,2.
Om eiwitmonsters voor te bereiden voor shotgun proteomics-analyse, moeten eiwitten geëxtraheerd uit biologische monsters (bijv. Cellen en weefsels) meestal eerst worden verwerkt met behulp van lange protocollen, waaronder het meten van de eiwitconcentratie van het monster, eiwitreductie en alkylering, en enzymatische spijsvertering tot peptiden. Bovendien vereisen eiwitten die worden geëxtraheerd in gewone lysisbuffers die detergentia bevatten, vaak extra stappen van bufferuitwisseling of verwijdering van detergentia vóór de analyse, omdat detergent de trypsinevertering kan verstoren en de prestaties van downstream vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) -analyse aanzienlijk kan verslechteren3. Peptiden worden meestal verder ontzout, gedroogd en gereconstitueerd in LC-MS / MS-compatibele oplosmiddelen na enzymatische spijsvertering. Deze eiwitbiochemische procedures kunnen arbeidsintensief en tijdrovend zijn. Zo blijven ze de doorvoer van proteomics-workflows beperken en dragen ze bij aan de variabiliteit van de verkregen gegevens4,5. Menselijke fouten en vooroordelen zijn erkend als cruciale factoren die van invloed zijn op de variantie en reproduceerbaarheid van gegevens6,7. Om menselijke fouten in de monstervoorbereidingsworkflows voor massaspectrometrie tot een minimum te beperken, zijn geautomatiseerde pipetteerrobotsystemen gebruikt om de doorvoer en reproduceerbaarheid van eiwitidentificatie en kwantificering van shotgun-proteomics en gerichte massaspectrometrie-analyse te verbeteren, waar dergelijke vooruitgang is geprezen als instrumenteel voor het voortzetten van de drang naar wijdverspreide acceptatie van proteomics-technologieën in kritisch onderzoek en klinische omgevingen8, 9,10,11,12,13. De meeste bestaande protocollen maken echter gebruik van robotachtige vloeistofbehandelingsplatforms die aanzienlijke investeringen en training vereisen, waardoor hun nut in veel laboratoria in de academische omgeving of anderszins met een beperkt budget wordt beperkt.
Dit artikel beschrijft een protocol dat gebruik maakt van een goedkoop, open-source robotisch vloeistofverwerkingssysteem, de OT-2, om een typische shotgun proteomics monstervoorbereidingsworkflow semi-automatiseren. De OT-2 heeft lagere kosten dan veel andere robotachtige vloeistofbehandelingssystemen en kost op het moment van schrijven ongeveer $ 5.000 Amerikaanse dollars. Wanneer rekening wordt gehouden met de prijzen van verschillende modules en labware, zijn de totale kosten voor het opzetten van experimenten in dit protocol op het moment van schrijven ongeveer $ 10.000, waardoor het betaalbaarder is voor een aanzienlijk bredere set laboratoria dan duurdere opties. De OT-2 is compatibel met open-source programmeren via Python-scripts en biedt grote flexibiliteit in door de gebruiker gedefinieerd DIY-protocolontwerp. Met behulp van drie in eigen huis ontwikkelde scripts, dekken de onderstaande protocollen het uitvoeren van een typische shotgun proteomics monstervoorbereidingsworkflow op het OT-2-station met een archetypische eiwitstandaard (runderserumalbumine; BSA) en een complex eiwitmonster van een normaal menselijk hartlysaat (figuur 1). De procedures voor de verwerking van (1) een BSA-monster en (2) een complex cardiaal lysaatmonster worden beschreven in respectievelijk protocolsecties 1, 2, 5, 6 en 3, 4, 5, 6. Sera-Mag carboxylaat-gemodificeerde magnetische kralen worden gebruikt in eenpotige vaste-fase-verbeterde monstervoorbereiding (SP3) om detergenten en zouten in de eiwit- en peptidemonsters te verwijderen. Tryptische digesten van runderserumalbumine en menselijke harteiwitten worden verder gereinigd door SP3-kralen en ingediend voor LC-MS /MS-analyse. Massaspectra worden vervolgens geanalyseerd met behulp van de MaxQuant-software voor peptide- en eiwitidentificatie. Representatieve resultaten die door ons worden uitgevoerd, tonen aan dat het protocol uitstekende technische variatiecoëfficiënten (CV) bereikt, terwijl het banktijd bespaart en niet inferieur is aan de handvertering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

Op massaspectrometrie gebaseerde shotgun proteomics-experimenten vereisen meerdere monstervoorbereidingsstappen, waaronder enzymatische eiwitvertering en -opruiming, die aanzienlijke persoonsuren bankarbeid kunnen kosten en een bron van batch-to-batch variabiliteit kunnen vormen. Laboratoriumautomatisering met pipetteerrobots kan handmatig werk verminderen, de doorvoer maximaliseren en de reproduceerbaarheid van onderzoek vergroten. Toch maken de hoge startprijzen van standaard automatiseringsstations ze onbetaalbaar voor veel academische laboratoria. Dit artikel beschrijft een proteomics monstervoorbereidingsworkflow met behulp van een betaalbaar, open-source automatiseringssysteem (The Opentrons OT-2), inclusief instructies voor het instellen van semi-geautomatiseerde eiwitreductie, alkylering, spijsvertering en opruimstappen; evenals bijbehorende open-source Python-scripts om het OT-2-systeem te programmeren via de application programming interface.

Hier worden drie Python-scripts geleverd die compatibel zijn met de OT-2-robot en die monstervoorbereiding uitvoeren voor massaspectrometrieproteomics met een standaard runderserumalbumine met één eiwit (technische replicaties n = 5 digesties) en een wasmiddelbevattend menselijk hartlysaatmonster (n = 5 digesties). Elk digestproduct is verdeeld in twee peptide-opruimreacties. Het aantal geïdentificeerde peptidespectrummatches (PSM's), peptiden en eiwitten in elke run van de BSA- en hartmonsters wordt weergegeven in <s...

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Gedetailleerd protocol en drie Python-scripts zijn voorzien voor het bedienen van een open-source robotisch vloeistofverwerkingssysteem om semi-geautomatiseerde eiwitmonstervoorbereiding uit te voeren voor massaspectrometrie-experimenten, met betrekking tot wasmiddelverwijdering, eiwitvertering en peptide-ontzoutingsstappen.

Shotgun Proteomics Sample Processing geautomatiseerd door een open-source labrobot

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Dit protocol maakt gebruik van automatisering om eiwitbiochemische preparaten uit te voeren voorafgaand aan massaspectrometrie-experimenten, waardoor een hogere doorvoer en lagere variabiliteit voor proteomische studies mogelijk is. Dit protocol maakt gebruik van een goedkoop, programmeerbaar vloeistofbehandelingssysteem dat betaalbaar is voor meer laboratoria. Wij bieden open source Python scripts die kunnen worden aangepast voor verdere ontwikkeling.De procedure wordt gedemonstreerd door Milton Amaya, een masterstudent in ons laboratorium. Open om te beginnen de noSP3_Digestion. py script in de teksteditor en geef de experimentspecifieke variabelen op zoals nodig in de sectie ALLEEN AANPASSEN.Open vervolgens de Opentrons-app en upload het script naar het tabblad Protocol in de Opentrons-app. Plaats vervolgens de vereiste labware en pipetten op de overeenkomstige locatie in het OT2-deck dat is opgegeven in het Python-script. Plaats vervolgens de ammoniumbicarbonaatoplossing in de A1-put van het vier-in-één buizenrek met de 15-milliliter plus 50-milliliter buishouder bovenkant en plaats het eiwitmonster in de A1-put van het vier-in-één buizenrek met een buishouder van twee milliliter.Plaats handmatig twee milliliter eiwitarmbindende buizen in de putten van het aluminium blok dat bovenop de temperatuurmodule is geplaatst, beginnend bij A1 en verticaal naar beneden. Plaats vervolgens de DTT-oplossing in de A6-put van het vier-in-één buizenrek met een buishoudertop van twee milliliter. Observeer terwijl de robot een geschikt volume van de ammoniumbicarbonaatbuffer overbrengt naar de monsterbuizen in het aluminiumblok.Controleer vervolgens handmatig of het robotprogramma is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, zorg ervoor dat DTT is geladen in A6 van het buizenrek met twee milliliter in sleuf vier voordat het protocol wordt hervat. Nadat u de locatie van de DTT-buis hebt bevestigd en de buisdop hebt geopend, klikt u op de knop Hervatten in de Opentrons-app om door te gaan. Zorg ervoor dat de robot 10 microliter van de DTT-oplossing overbrengt naar elke monsterput, gevolgd door vijf mengrondes.Controleer vervolgens of het robotprogramma is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, Zorg ervoor dat u doppen op monsterbuizen sluit. Sluit vervolgens handmatig de doppen van de buizen en klik op Hervatten om door te gaan. Wacht tot de temperatuurmodule van de robot het aluminiumblok begint te verwarmen en de temperatuur 55 graden Celsius bereikt, gevolgd door een incubatie van vijf minuten om de monsters tot 55 graden Celsius te laten komen.De robot houdt deze temperatuur vervolgens 30 minuten vast om eiwitreductie door DTT mogelijk te maken. Bereid tijdens de incubatie de jodoacetamide-oplossing voor en wikkel deze handmatig in met aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Na de incubatie, wanneer het programma van de robot is gepauzeerd en het waarschuwingsbericht wordt weergegeven, zorgt u ervoor dat u doppen op monsterbuizen opent, de monsterbuizen losmaakt en op Hervatten klikt om door te gaan.Controleer vervolgens handmatig of het programma van de robot is gepauzeerd met het waarschuwingsbericht, Zorg ervoor dat jodoacetamide is geladen in B6 van het buizenrek van twee milliliter in sleuf vier voordat het protocol wordt hervat. Nadat u de racklocatie van de jodoacetamidebuis hebt bevestigd en de buisdop hebt geopend, klikt u op Hervatten en zorgt u ervoor dat de robot 10 microliter van de jodoacetamide-oplossing naar elke monsterbuis overbrengt, gevolgd door vijf mengrondes. Wanneer het programma van de robot wordt gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, sluit u de doppen op monsterbuizen, dop u de monsterbuizen en bedekt u ze met folie, bedekt u vervolgens het hele aluminiumblok met een schoon stuk folie en klikt u op Hervatten om door te gaan.Wacht tot de monsters gedurende 30 minuten bij 22 graden Celsius zijn geïncubeerd en zorg ervoor dat de temperatuurmodule van de robot wordt gedeactiveerd na voltooiing van de iodoacetamide-incubatie. Wanneer het programma van de robot wordt gepauzeerd en het waarschuwingsbericht wordt weergegeven, zorgt u ervoor dat trypsine is geladen in C6 van het buisrek met twee milliliter in sleuf vier voordat het protocol wordt hervat, plaatst u trypsine-oplossing in de C6-put van het buisrek met twee milliliter met de buisdop open en klikt u op Hervatten om door te gaan. Wanneer vervolgens het programma van de robot is gepauzeerd en het waarschuwingsbericht wordt weergegeven, opent u doppen op monsterbuizen op de temperatuurmodule, maakt u de monsterbuizen los en klikt u op Hervatten om door te gaan.Stand-by terwijl de robot 10 microliter trypsine overbrengt naar elke monsterbuis, gevolgd door vijf mengrondes. Na een nachtelijke trypsinevertering draait u de monsters kort met behulp van een benchtop microcentrifuge en plaatst u de monsters op een magnetisch buizenrek. Breng het supernatant na twee minuten voorzichtig met een pipet over in een nieuwe set eiwitarmbindende microcentrifugebuizen en bewaar de monsters in een koelkast.Open vervolgens de SP3_peptide_cleanup. py Python-script in een teksteditor en geef de experimentvariabelen indien nodig op in de sectie ALLEEN AANPASSEN. Upload vervolgens het script naar het tabblad Protocol in de Opentrons-app.Plaats de vereiste labware en pipetten op de overeenkomstige locatie in het OT2-deck dat is opgegeven in het Python-script en zorg ervoor dat de magnetische module is ingeschakeld en verbonden met de robot. Plaats een nieuwe, twee milliliter, 96-well diepe putplaat op de bovenkant van de magnetische module. Plaats vervolgens de verteerde monsters in het buizenrek van twee milliliter, beginnend bij A1 en verticaal naar beneden.Zorg er vervolgens voor dat de robot 55 microliter van de verteerde monsters overbrengt naar de putten in de diepe putplaten op de magnetische module. Controleer of het robotprotocol is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, Zorg ervoor dat voorbereide kralen zijn geladen in A6 van het buizenrek met twee milliliter in sleuf vier voordat het protocol wordt hervat. Draai vervolgens de SP3-kralen kort in een mini-benchtopcentrifuge en plaats ze in de A6-put van het buizenrek van twee milliliter met de dop open.Controleer of het robotsprogramma is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, Zorg ervoor dat 80% ethanol is geladen in A4 van het 15-milliliter plus 50-milliliter buizenrek in sleuf vijf voorafgaand aan het hervatten van het protocol. Plaats vervolgens een 80% ethanoloplossing in de A4-put in het buizenrek en klik op Hervatten om door te gaan. Observeer terwijl de robot de pipetteersnelheid verandert in langzaam, zuigt het supernatant uit elke put en doseert het in de afvalbuis.Wacht tot de robot de pipetteersnelheid weer op de standaardsnelheid zet en de magnetische module uitschakelt. Wanneer het robotprogramma is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, opent u de dop op de ammoniumbicarbonaatbuis, opent u de dop van de ammoniumbicarbonaatoplossing en klikt u vervolgens op Hervatten om door te gaan. Stand-by terwijl de robot de magnetische module uitschakelt, 250 microliter van de ammoniumbicarbonaatbuffer naar elke put overbrengt en onmiddellijk 10 keer mengt.Observeer vervolgens terwijl de robot de pipetteersnelheid verandert in langzaam en het supernatant van elke put naar de afvalbuis overbrengt. Wacht tot de robot 100 microliter van de ammoniumbicarbonaatbuffer naar elke put overbrengt en onmiddellijk 10 keer mengt. Controleer of het robotsprogramma is gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, Zorg ervoor dat nieuwe verzamelbuizen in het aluminiumblok van twee milliliter zijn geplaatst voordat het protocol wordt hervat.Plaats vervolgens een nieuwe set microcentrifugebuizen met een laag eiwitgehalte in het aluminiumblok onmiddellijk na de laatste monsterbuis die aanvankelijk in het blok zat en klik op Hervatten om door te gaan. Stand-by terwijl de robot elk monster in de ammoniumbicarbonaatbuffer overbrengt naar de nieuwe buizen van twee milliliter. Wanneer het programma van de robot wordt gepauzeerd en het bericht wordt weergegeven, zorgt u ervoor dat trypsine is geladen in C6 van het buizenrek met twee milliliter in sleuf vier voordat het protocol wordt hervat, plaatst u de trypsine-oplossing in de C6-put van het buisrek met twee milliliter met de buisdop open en klikt u op Hervatten om door te gaan.Zodra het programma is voltooid, wikkelt u de monsterbuisdoppen met paraffinefilm, brengt u alle monsters over naar een temperatuurgecontroleerde mixer en incubeert u gedurende 16 tot 20 uur bij 37 graden Celsius met 1.000 RPM schudden. Met het BSA-monster werd een medium van 728 peptidespectrummatches en 65 peptiden geïdentificeerd, met respectievelijk 5,2% en 3,2% variatiecoëfficiënten. Met een complex hartmonster werd een medium van 9, 526 peptidespectrummatches, 7, 558 peptiden en 1.336 eiwitten geïdentificeerd in 10 runs met respectievelijk 7,6% 5,9% en 3,6% variatiecoëfficiënten.Om de variabiliteit in peptidekwantificering te bepalen, werden de variatiecoëfficiënten van de geëxtraheerde ionchromatogramintensiteiten berekend voor 10 peptiden die zich in kaart brengen met een uniek eiwit. Wanneer de variabiliteit van menselijke versus robot experimentele resultaten bij het meten van eiwitconcentratie verder werd vergeleken met de BCA-test, was de gemiddelde variatiecoëfficiënt van de robot BCA-assay lager dan de menselijke handmatige BCA-assay. Dit protocol verkort de bench-tijd voor het verwerken van elk monster.Het maakt de weg vrij voor ons om proteomics-verschillen te onderzoeken in een panel van cellijnen tussen meerdere medicamenteuze behandelingen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS Gedetailleerde karakterisering en kwantificering van glutamine en asparagine Deamidatie in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Voorbereiding van Chloroplast sub compartimenten van Arabidopsis voor de analyse van eiwit lokalisatie door Immunoblotting of Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Met behulp van de open-source MALDI TOF-MS IDBac pijpleiding voor analyse van microbiële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet gegevens

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Een alles-in-een monsterhouder voor macromoleculaire X-Ray kristallografie met minimale achtergrond verstrooiing

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Een plasmamonstervoorbereiding voor massaspectrometrie met behulp van een geautomatiseerd werkstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Nauwkeurige en nauwkeurige FRET-metingen met één molecuul uitvoeren met behulp van de Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...