Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Ce travail a été soutenu en partie par les prix F32-HL149191 des NIH; R00-HL144829 à EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 à MPL. La figure 1, la figure 2 et la figure 3 sont créées à l’aide d’un outil d’illustration scientifique basé sur le Web, BioRender.com.

Les scripts Python développés ont été déposés sur GitHub à l’adresse : https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Une copie des scripts est remise dans le dossier supplémentaire 1. Veuillez vous référer au référentiel GitHub pour les dernières versions.
1. Préparations expérimentales
<ol><li>Vérifiez le matériel requis avant de démarrer le protocole. REMARQUE: Les composants matériels suivants sont requis: pipettes...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions.">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li><li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+reproducibility,+human+error,+and+public+policy.">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li><li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

Étapes critiques du protocole Pour de meilleures performances, des logiciels de laboratoire, des modules et des consommables compatibles avec OT-2 vérifiés par Opentrons doivent être utilisés. Des logiciels de laboratoire personnalisés peuvent être créés en suivant les instructions d’Opentrons à la référence 14. Assurez-vous de calibrer le pont OT-2, les pipettes et le matériel de laboratoire lorsqu’ils sont utilisés pour la première fois. Il est également e...

La protéomique au fusil de chasse basée sur la spectrométrie de masse est un outil puissant pour mesurer simultanément l’abondance de nombreuses protéines dans des échantillons biologiques. Les expériences protéomiques avec l’analyse bioinformatique sont couramment utilisées pour identifier les biomarqueurs et découvrir les complexes biologiques associés et les voies qui sous-tendent les mécanismes pathologiques. Avec sa grande spécificité d’analyte et sa précision quantitative potentielle, la protéomique des fusils de chasse a également un excellent potentiel pour être adoptée par les installations de recherche et les laboratoires de diagnostic pour l’analyse d’échantillons cliniques sans avoir besoin de s’appuyer sur des anticorps1,2.
Pour préparer des échantillons de protéines pour l’analyse protéomique au fusil de chasse, les protéines extraites d’échantillons biologiques (par exemple, les cellules et les tissus) doivent généralement d’abord être traitées à l’aide de longs protocoles, y compris la mesure de la concentration en protéines de l’échantillon, la réduction des protéines et l’alkylation, et la digestion enzymatique en peptides. De plus, les protéines extraites dans des tampons de lyse courants contenant des détergents nécessitent souvent des étapes supplémentaires d’échange de tampon ou d’élimination du détergent avant l’analyse, car le détergent peut interférer avec la digestion de la trypsine et dégrader considérablement les performances de l’analyse en aval par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS)3. Les peptides sont généralement dessalés, séchés et reconstitués dans des solvants compatibles LC-MS/MS après digestion enzymatique. Ces procédures de biochimie des protéines peuvent être laborieuses et prendre beaucoup de temps. Ainsi, ils continuent de limiter le débit des flux de travail protéomiques et contribuent à la variabilité des données acquises4,5. Les erreurs et les biais humains ont été reconnus comme des facteurs cruciaux affectant la variance et la reproductibilité des données6,7. Pour minimiser les erreurs humaines dans les flux de travail de préparation des échantillons par spectrométrie de masse, des systèmes robotiques de pipetage automatisés ont été utilisés pour améliorer le débit et la reproductibilité de l’identification et de la quantification des protéines à partir de la protéomique au fusil de chasse et de l’analyse ciblée par spectrométrie de masse, où de telles avancées ont été saluées comme essentielles pour poursuivre la poussée en faveur de l’adoption généralisée des technologies protéomiques dans les domaines critiques de la recherche et des milieux cliniques8, 9,10,11,12,13. Cependant, la plupart des protocoles existants utilisent des plates-formes robotiques de manipulation de liquides qui nécessitent des investissements et une formation substantiels, ce qui limite leur utilité dans de nombreux laboratoires dans l’environnement universitaire ou autrement avec un budget limité.
Cet article décrit un protocole qui utilise un système de manipulation robotique de liquides à faible coût et open source, l’OT-2, pour semi-automatiser un flux de travail typique de préparation d’échantillons protéomiques de fusil de chasse. L’OT-2 a un coût inférieur à celui de nombreux autres systèmes robotiques de manipulation de liquides et, au moment de la rédaction de cet article, coûte environ 5 000 dollars américains. Si l’on tient compte des prix des différents modules et logiciels de laboratoire, le coût total de la mise en place d’expériences dans ce protocole au moment de la rédaction est d’environ 10 000 $, ce qui le rend plus abordable pour un ensemble considérablement plus large de laboratoires par rapport à des options plus coûteuses. L’OT-2 est compatible avec la programmation open-source via des scripts Python et offre une grande flexibilité dans la conception de protocoles DIY définis par l’utilisateur. À l’aide de trois scripts développés en interne, les protocoles ci-dessous couvrent l’exécution d’un flux de travail typique de préparation d’échantillons protéomiques de fusil de chasse sur la station OT-2 avec un étalon protéique archétypique (albumine sérique bovine; BSA) et un échantillon de protéine complexe d’un lysat cardiaque humain normal (Figure 1). Les procédures de traitement (1) d’un échantillon de BSA et (2) d’un échantillon de lysat cardiaque complexe sont détaillées dans les sections 1, 2, 5, 6 et 3, 4, 5, 6 du Protocole, respectivement. Les billes magnétiques modifiées par le carboxylate sera-Mag sont utilisées dans la préparation d’échantillons améliorés en phase solide (SP3) pour éliminer les détergents et les sels dans les échantillons de protéines et de peptides. Les digestions tryptiques de l’albumine sérique bovine et des protéines cardiaques humaines sont ensuite nettoyées par des billes SP3 et soumises à l’analyse LC-MS/MS. Les spectres de masse sont ensuite analysés à l’aide du logiciel MaxQuant pour l’identification des peptides et des protéines. Les résultats représentatifs que nous avons réalisés montrent que le protocole atteint d’excellents coefficients techniques de variation (CV) tout en économisant du temps de banc et n’est pas inférieur à la digestion à la main.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

Les expériences de protéomique au fusil de chasse basées sur la spectrométrie de masse nécessitent plusieurs étapes de préparation des échantillons, y compris la digestion et le nettoyage des protéines enzymatiques, ce qui peut prendre des heures importantes de travail de laboratoire et présenter une source de variabilité de lot à lot. L’automatisation des laboratoires avec des robots de pipetage peut réduire le travail manuel, maximiser le débit et augmenter la reproductibilité de la recherche. Pourtant, les prix de départ élevés des stations d’automatisation standard les rendent inabordables pour de nombreux laboratoires universitaires. Cet article décrit un flux de travail de préparation d’échantillons protéomiques à l’aide d’un système d’automatisation open source abordable (The Opentrons OT-2), y compris des instructions pour mettre en place des étapes semi-automatisées de réduction des protéines, d’alkylation, de digestion et de nettoyage; ainsi que des scripts Python open source pour programmer le système OT-2 via son interface de programmation d’applications.

Trois scripts Python sont fournis ici qui sont compatibles avec le robot OT-2, et qui effectuent la préparation d’échantillons pour la protéomique de spectrométrie de masse avec une seule protéine albumine sérique bovine standard (répliques techniques n = 5 digestions) et un échantillon de lysat cardiaque humain contenant un détergent (n = 5 digestions). Chaque produit de digestion est divisé en deux réactions de nettoyage peptidique. Le nombre de correspondances peptide-spectre (MSP), de peptides et de prot...

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Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Un protocole détaillé et trois scripts Python sont fournis pour l’exploitation d’un système de manipulation robotique de liquides open source permettant d’effectuer une préparation semi-automatisée d’échantillons de protéines pour des expériences de spectrométrie de masse, couvrant l’élimination des détergents, la digestion des protéines et les étapes de dessalement des peptides.

Traitement des échantillons protéomiques Shotgun automatisé par un robot de laboratoire open source

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Ce protocole utilise l’automatisation pour effectuer des préparations de biochimie des protéines avant les expériences de spectrométrie de masse, permettant un débit plus élevé et une variabilité plus faible pour les études protéomiques. Ce protocole utilise un système de manipulation de liquide programmable à faible coût qui est abordable pour un plus grand nombre de laboratoires. Nous fournissons des scripts Python open source qui peuvent être modifiés pour un développement ultérieur.Milton Amaya, étudiant à la maîtrise dans notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, ouvrez le noSP3_Digestion. py script dans l’éditeur de texte et spécifiez les variables spécifiques à l’expérience si nécessaire dans la section PERSONNALISER ICI UNIQUEMENT.Ensuite, ouvrez l’application Opentrons et téléchargez le script dans l’onglet Protocole de l’application Opentrons. Ensuite, placez le matériel de laboratoire et les pipettes requis à l’emplacement correspondant dans le deck OT2 spécifié dans le script Python. Ensuite, placez la solution de bicarbonate d’ammonium dans le puits A1 du rack à tubes quatre en un avec le support de tube de 15 millilitres plus 50 millilitres et placez l’échantillon de protéines dans le puits A1 du rack de tubes quatre en un avec un support de tube de deux millilitres.Placez manuellement des tubes à faible liaison de protéines de deux millilitres dans les puits du bloc d’aluminium placé au-dessus du module de température, à partir de A1 et en descendant verticalement. Ensuite, placez la solution TNT dans le puits A6 du rack à tubes quatre en un avec un support de tube de deux millilitres. Observez pendant que le robot transfère un volume approprié du tampon de bicarbonate d’ammonium aux tubes d’échantillonnage dans le bloc d’aluminium.Ensuite, vérifiez manuellement que le programme du robot est mis en pause et affiche le message, Assurez-vous que la TNT a été chargée dans A6 du rack de tubes de deux millilitres situé dans l’emplacement quatre avant de reprendre le protocole. Après avoir confirmé l’emplacement du tube TNT et ouvert le capuchon du tube, cliquez sur le bouton Reprendre dans l’application Opentrons pour continuer. Assurez-vous que le robot transfère 10 microlitres de la solution TNT à chaque puits d’échantillonnage, suivi de cinq tours de mélange.Ensuite, vérifiez que le programme du robot est en pause et affiche le message, Assurez-vous de fermer les bouchons sur les tubes d’échantillonnage. Ensuite, fermez manuellement les capuchons des tubes et cliquez sur Reprendre pour continuer. Attendez que le module de température du robot commence à chauffer le bloc d’aluminium et que la température atteigne 55 degrés Celsius, suivie d’une incubation de cinq minutes pour permettre aux échantillons d’atteindre 55 degrés Celsius.Le robot maintiendra ensuite cette température pendant 30 minutes pour permettre la réduction des protéines par TNT. Pendant l’incubation, préparez une solution d’iodoacétamide et enveloppez-la manuellement avec du papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière. Après l’incubation, lorsque le programme du robot est mis en pause et affiche le message d’avertissement, assurez-vous d’ouvrir les bouchons sur les tubes d’échantillonnage, décapsulez les tubes d’échantillonnage et cliquez sur Reprendre pour continuer.Ensuite, vérifiez manuellement que le programme du robot est mis en pause avec le message d’avertissement, Assurez-vous que l’iodoacétamide a été chargé dans B6 du rack de tubes de deux millilitres situé dans l’emplacement quatre avant de reprendre le protocole. Après avoir confirmé l’emplacement du rack du tube d’iodoacétamide et ouvert le capuchon du tube, cliquez sur Reprendre et assurez-vous que le robot transfère 10 microlitres de la solution d’iodoacétamide à chaque tube d’échantillonnage, suivi de cinq tours de mélange. Lorsque le programme du robot est mis en pause et affiche le message, fermez les bouchons sur les tubes d’échantillonnage, recouvrez les tubes d’échantillonnage et recouvrez-les de papier d’aluminium, puis couvrez tout le bloc d’aluminium avec un morceau de papier d’aluminium propre et cliquez sur Reprendre pour continuer.Attendez que les échantillons soient incubés à 22 degrés Celsius pendant 30 minutes et assurez-vous que le module de température du robot se désactive à la fin de l’incubation de l’iodoacétamide. Lorsque le programme du robot est mis en pause et affiche le message d’avertissement, Assurez-vous que la trypsine a été chargée dans C6 du rack de tubes de deux millilitres situé dans la fente quatre avant la reprise du protocole, placez la solution de trypsine dans le puits C6 du rack de tubes de deux millilitres avec le capuchon du tube ouvert, puis cliquez sur Reprendre pour continuer. Ensuite, lorsque le programme du robot est mis en pause et affiche le message d’avertissement, Ouvrez les bouchons sur les tubes d’échantillonnage sur le module de température, décapsulez les tubes d’échantillon et cliquez sur Reprendre pour continuer.Veille pendant que le robot transfère 10 microlitres de trypsine à chaque tube d’échantillonnage, suivi de cinq tours de mélange. Après la digestion de la trypsine pendant la nuit, faites tourner brièvement les échantillons à l’aide d’une microcentrifugeuse de paillasse et placez les échantillons sur un support à tubes magnétiques. Après deux minutes, transférer soigneusement le surnageant avec une pipette dans un nouvel ensemble de tubes de microcentrifugation à faible liaison de protéines et conserver les échantillons au réfrigérateur.Ensuite, ouvrez le SP3_peptide_cleanup. py Python script dans un éditeur de texte, et spécifiez les variables d’expérience si nécessaire dans la section PERSONNALISER ICI UNIQUEMENT. Ensuite, téléchargez le script dans l’onglet Protocole de l’application Opentrons.Placez le matériel de laboratoire et les pipettes requis à l’emplacement correspondant dans le deck OT2 spécifié dans le script Python et assurez-vous que le module magnétique est allumé et connecté au robot. Placez une nouvelle plaque de puits de deux millilitres et de 96 puits de profondeur sur le dessus du module magnétique. Ensuite, placez les échantillons digérés dans le rack de tubes de deux millilitres à partir de A1 et en descendant verticalement.Ensuite, assurez-vous que le robot transfère 55 microlitres des échantillons digérés aux puits dans les plaques de puits profondes sur le module magnétique. Vérifiez que le protocole du robot est mis en pause et affiche le message , Assurez-vous que les billes préparées ont été chargées dans A6 du rack de tubes de deux millilitres situé dans l’emplacement quatre avant de reprendre le protocole. Ensuite, vortex et faites tourner brièvement les billes SP3 dans une mini centrifugeuse de paillasse et placez-les dans le puits A6 du rack à tubes de deux millilitres avec le capuchon ouvert.Vérifiez que le programme des robots est en pause et affiche le message , Assurez-vous que 80% d’éthanol a été chargé dans A4 du rack de tubes de 15 millilitres plus 50 millilitres situé dans l’emplacement cinq avant la reprise du protocole. Ensuite, placez une solution d’éthanol à 80% dans le puits A4 dans le rack à tubes et cliquez sur Reprendre pour continuer. Observez pendant que le robot modifie la vitesse de pipetage pour ralentir, aspire le surnageant de chaque puits et le distribue dans le tube à déchets.Attendez que le robot rétablisse la vitesse de pipetage par défaut et désengage le module magnétique. Lorsque le programme des robots est mis en pause et affiche le message, Ouvrez le capuchon sur le tube de bicarbonate d’ammonium, ouvrez le bouchon de la solution de bicarbonate d’ammonium, puis cliquez sur Reprendre pour continuer. En veille pendant que le robot désengage le module magnétique, transfère 250 microlitres du tampon de bicarbonate d’ammonium à chaque puits et mélange immédiatement 10 fois.Ensuite, observez pendant que le robot modifie la vitesse de pipetage pour ralentir et transfère le surnageant de chaque puits au tube de déchets. Attendez que le robot transfère 100 microlitres du tampon de bicarbonate d’ammonium à chaque puits et mélange immédiatement 10 fois. Vérifiez que le programme des robots est mis en pause et affiche le message, Assurez-vous que de nouveaux tubes de collecte ont été placés dans le bloc d’aluminium de deux millilitres avant de reprendre le protocole.Ensuite, placez un nouvel ensemble de tubes de microcentrifugation à faible rétention de protéines dans le bloc d’aluminium immédiatement après le dernier tube d’échantillon initialement dans le bloc, puis cliquez sur Reprendre pour continuer. Veille pendant que le robot transfère chaque échantillon dans le tampon de bicarbonate d’ammonium vers les nouveaux tubes de deux millilitres. Lorsque le programme du robot est mis en pause et affiche le message, Assurez-vous que la trypsine a été chargée dans C6 du rack de tubes de deux millilitres situé dans l’emplacement quatre avant la reprise du protocole, placez la solution de trypsine dans le puits C6 du rack de tubes de deux millilitres avec le capuchon du tube ouvert, puis cliquez sur Reprendre pour continuer.Une fois le programme terminé, enveloppez les bouchons du tube d’échantillonnage avec un film de paraffine, transférez tous les échantillons dans un mélangeur à température contrôlée et incubez à 37 degrés Celsius pendant 16 à 20 heures avec des secousses à 1 000 tr / min. Avec l’échantillon BSA, un milieu de 728 correspondances de spectre peptidique et 65 peptides ont été identifiés, avec des coefficients de variation de 5,2% et 3,2%, respectivement. Avec un échantillon cardiaque complexe, un milieu de 9 526 correspondances de spectre peptidique, 7 558 peptides et 1 336 protéines a été identifié en 10 séries avec des coefficients de variation de 7,6%, 5,9% et 3,6%, respectivement.Pour déterminer la variabilité de la quantification peptidique, les coefficients de variation des intensités du chromatogramme ionique extrait ont été calculés pour 10 peptides qui correspondent à une protéine unique. Lorsque les variabilités des résultats expérimentaux humains par rapport aux résultats expérimentaux du robot dans la mesure de la concentration en protéines ont été comparées au test BCA, le coefficient de variation moyen du test BCA robotisé était inférieur au test BCA manuel humain. Ce protocole réduit le temps de banc pour le traitement de chaque échantillon.Cela nous ouvre la voie pour explorer les différences protéomiques dans un panel de lignées cellulaires entre plusieurs traitements médicamenteux.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automated acoustique de distribution pour la Dilution série de Peptide Agonistes dans Potency Détermination Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Recherche

Biochimie

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS pour la caractérisation en profondeur et Quantification de Glutamine et asparagine désamidation dans Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Exempt de calibration In Vitro la Quantification des protéines Homo-oligomérisation à l’aide d’instruments commerciaux et Open Source gratuit, logiciel d’analyse de luminosité

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Préparation des compartiments des chloroplastes d’Arabidopsis pour l’analyse de la localisation de la protéine par immunotransfert ou protéomique

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Utilisation du pipeline Open-Source MALDI TOF-MS IDBac pour l'analyse des protéines microbiennes et des données spécialisées sur les métabolites

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Un porte-échantillon tout-en-un pour la cristallographie macromoléculaire de rayon X avec la diffusion minimale de fond

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Préparation d’un échantillon de plasma pour la spectrométrie de masse à l’aide d’un poste de travail automatisé

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Préparation de l’échantillon TMT pour la soumission des installations de protéomique et l’analyse subséquente des données

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Effectuer des mesures FRET à molécule unique précises et précises à l’aide de la smfBox open source

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...