Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Diese Arbeit wurde zum Teil durch die NIH-Auszeichnungen F32-HL149191 an YH unterstützt; R00-HL144829 bis EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 zu MPL. Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3 werden mit Hilfe eines webbasierten Wissenschaftsillustrationstools erstellt, BioRender.com.

Die entwickelten Python-Skripte wurden auf GitHub hinterlegt unter: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Eine Kopie der Skripte finden Sie in Der Ergänzungsdatei 1. Die neuesten Versionen finden Sie im GitHub-Repository.
1. Versuchspräparate
<ol><li>Überprüfen Sie die erforderliche Hardware, bevor Sie das Protokoll starten. HINWEIS: Die folgenden Hardwarekomponenten werden benötigt: OT-2 Pipetten, Pipettenspitzen, 4-in-1-Roh...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls Für die beste Leistung sollten von Opentrons verifizierte Laborgeräte, Module und Verbrauchsmaterialien verwendet werden, die mit OT-2 kompatibel sind. Benutzerdefinierte Labware kann nach den Anweisungen von Opentrons unter Reference14 erstellt werden. Stellen Sie sicher, dass Sie das OT-2-Deck, die Pipetten und das Labormaterial kalibrieren, wenn Sie es zum ersten Mal verwenden. Es ist auch wichtig, die Richtlinien des Herstellers...

Die auf Massenspektrometrie basierende Shotgun-Proteomik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Häufigkeit vieler Proteine in biologischen Proben gleichzeitig zu messen. Proteomik-Experimente mit bioinformatischer Analyse werden routinemäßig eingesetzt, um Biomarker zu identifizieren und assoziierte biologische Komplexe und Signalwege zu entdecken, die pathologischen Mechanismen zugrunde liegen. Mit ihrer hohen Analytspezifität und potenziellen quantitativen Genauigkeit hat die Shotgun-Proteomik auch ein hervorragendes Potenzial, von Forschungseinrichtungen und diagnostischen Labors für die klinische Probenanalyse übernommen zu werden, ohne sich auf Antikörper verlassen zu müssen1,2.
Um Proteinproben für die Shotgun-Proteomik-Analyse vorzubereiten, müssen Proteine, die aus biologischen Proben (z. B. Zellen und Geweben) extrahiert werden, typischerweise zuerst unter Verwendung langwieriger Protokolle verarbeitet werden, einschließlich der Messung der Probenproteinkonzentration, der Proteinreduktion und -alkylierung sowie des enzymatischen Aufschlusses in Peptide. Darüber hinaus erfordern Proteine, die in herkömmlichen Lysepuffern extrahiert werden, die Detergenzien enthalten, vor der Analyse häufig zusätzliche Schritte des Pufferaustauschs oder der Reinigungsmittelentfernung, da Detergenzien die Trypsinaufschluss stören und die Leistung der nachgeschalteten Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) -Analyse erheblich beeinträchtigen können3. Peptide werden typischerweise nach enzymatischem Aufschluss weiter entsalzt, getrocknet und in LC-MS/MS-kompatiblen Lösungsmitteln rekonstituiert. Diese proteinbiochemischen Verfahren können arbeitsintensiv und zeitaufwendig sein. Somit begrenzen sie weiterhin den Durchsatz von Proteomik-Workflows und tragen zur Variabilität der erfassten Daten bei4,5. Menschliche Fehler und Verzerrungen wurden als entscheidende Faktoren erkannt, die die Datenvarianz und Reproduzierbarkeit beeinflussen6,7. Um menschliche Fehler bei der Massenspektrometrie-Probenvorbereitung zu minimieren, wurden automatisierte Pipettierrobotersysteme eingesetzt, um den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit der Proteinidentifizierung und -quantifizierung aus der Schrotflintenproteomik und der gezielten Massenspektrometrieanalyse zu verbessern, wo solche Fortschritte als entscheidend für die Fortsetzung des Vorstoßes für eine weit verbreitete Einführung von Proteomik-Technologien in kritischen Forschungs- und klinischen Umgebungen gefeiert wurden8. 9,10,11,12,13. Die meisten bestehenden Protokolle verwenden jedoch robotergestützte Liquid-Handling-Plattformen, die erhebliche Investitionen und Schulungen erfordern, was ihren Nutzen in vielen Labors im akademischen Umfeld oder anderweitig mit einem begrenzten Budget einschränkt.
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, das ein kostengünstiges Open-Source-Roboter-Liquid-Handling-System, das OT-2, verwendet, um einen typischen Shotgun-Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflow zu halbautomatisieren. Das OT-2 hat niedrigere Kosten als viele andere Roboter-Liquid-Handling-Systeme und kostet zum Zeitpunkt des Schreibens etwa 5.000 US-Dollar. Wenn man die Preise verschiedener Module und Laborgeräte berücksichtigt, betragen die Gesamtkosten für die Einrichtung von Experimenten in diesem Protokoll zum Zeitpunkt des Schreibens etwa 10.000 US-Dollar, was es für eine wesentlich breitere Gruppe von Labors erschwinglicher macht als teurere Optionen. Der OT-2 ist kompatibel mit Open-Source-Programmierung durch Python-Skripte und bietet große Flexibilitäten im benutzerdefinierten DIY-Protokolldesign. Unter Verwendung von drei intern entwickelten Skripten decken die folgenden Protokolle die Ausführung eines typischen Shotgun-Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflows auf der OT-2-Station mit einem archetypischen Proteinstandard (Rinderserumalbumin; BSA) und eine komplexe Proteinprobe eines normalen menschlichen Herzlysat (Abbildung 1). Die Verfahren zur Verarbeitung (1) einer BSA-Probe und (2) einer komplexen Herzlysatprobe sind in den Protokollabschnitten 1, 2, 5, 6 und 3, 4, 5, 6 beschrieben. Sera-Mag-Carboxylat-modifizierte Magnetperlen werden in der Eintopf-Festphasen-verstärkten Probenvorbereitung (SP3) verwendet, um Reinigungsmittel und Salze in den Protein- und Peptidproben zu entfernen. Tryptische Digests aus Rinderserumalbumin und menschlichen Herzproteinen werden durch SP3-Kügelchen weiter gereinigt und zur LC-MS/MS-Analyse eingereicht. Massenspektren werden dann mit der MaxQuant-Software zur Peptid- und Proteinidentifizierung analysiert. Repräsentative Ergebnisse, die von uns durchgeführt wurden, zeigen, dass das Protokoll hervorragende technische Variationskoeffizienten (CV) erreicht, gleichzeitig Bankzeit spart und der Handverdauung nicht unterlegen ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

Massenspektrometrie-basierte Shotgun-Proteomik-Experimente erfordern mehrere Probenvorbereitungsschritte, einschließlich enzymatischer Proteinverdauung und -reinigung, die erhebliche Arbeitsstunden am Labor in Anspruch nehmen und eine Quelle der Variabilität von Charge zu Charge darstellen können. Die Laborautomatisierung mit Pipettierrobotern kann die manuelle Arbeit reduzieren, den Durchsatz maximieren und die Reproduzierbarkeit der Forschung erhöhen. Dennoch machen die hohen Startpreise von Standard-Automatisierungsstationen sie für viele akademische Labore unerschwinglich. Dieser Artikel beschreibt einen Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflow unter Verwendung eines erschwinglichen Open-Source-Automatisierungssystems (The Opentrons OT-2), einschließlich Anweisungen zum Einrichten von halbautomatischen Proteinreduktions-, Alkylierungs-, Verdauungs- und Reinigungsschritten; sowie begleitende Open-Source-Python-Skripte zur Programmierung des OT-2-Systems über seine Anwendungsprogrammierschnittstelle.

Hier werden drei Python-Skripte bereitgestellt, die mit dem OT-2-Roboter kompatibel sind und die Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie-Proteomik mit einem einzigen Proteinstandard-Rinderserumalbumin (technische Replikate n = 5 Aufschlüsse) und einer waschmittelhaltigen menschlichen Herzlysatprobe (n = 5 Verdauungen) durchführen. Jedes Verdauungsprodukt ist in zwei Peptidreinigungsreaktionen unterteilt. Die Anzahl der identifizierten Peptidspektrumübereinstimmungen (PSMs), Peptide und Proteine in jedem Durchl...

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Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Detailliertes Protokoll und drei Python-Skripte werden für den Betrieb eines Open-Source-Roboter-Liquid-Handling-Systems bereitgestellt, um eine halbautomatische Proteinprobenvorbereitung für Massenspektrometrie-Experimente durchzuführen, die die Entfernung von Reinigungsmitteln, die Proteinverdauung und die Peptidentsalzungsschritte abdecken.

Shotgun Proteomics Probenverarbeitung automatisiert durch einen Open-Source-Laborroboter

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Dieses Protokoll verwendet Automatisierung, um proteinbiochemische Vorbereitungen vor Massenspektrometrie-Experimenten durchzuführen, was einen höheren Durchsatz und eine geringere Variabilität für Proteomstudien ermöglicht. Dieses Protokoll verwendet ein kostengünstiges, programmierbares Liquid-Handling-System, das für mehr Labore erschwinglich ist. Wir bieten Open-Source-Python-Skripte, die für die weitere Entwicklung modifiziert werden können.Das Verfahren wird Milton Amaya, ein Masterstudent in unserem Labor, demonstrieren. Öffnen Sie zunächst die noSP3_Digestion. py-Skript im Texteditor und geben Sie die experimentspezifischen Variablen nach Bedarf im Abschnitt NUR HIER ANPASSEN an.Öffnen Sie dann die Opentrons-App und laden Sie das Skript auf die Registerkarte Protokoll in der Opentrons-App hoch. Als nächstes platzieren Sie die erforderliche Labware und Pipetten an der entsprechenden Stelle im OT2-Deck, das im Python-Skript angegeben ist. Legen Sie dann die Ammoniumbicarbonatlösung in die A1-Vertiefung des Vier-in-Eins-Röhrchengestells mit der 15-Milliliter plus 50-Milliliter-Röhrchenhalterplatte und legen Sie die Proteinprobe in die A1-Vertiefung des Vier-in-Eins-Röhrchengestells mit einer Zwei-Milliliter-Röhrchenhalterplatte.Legen Sie manuell zwei Milliliter Protein Low-Bind-Röhrchen in die Vertiefungen des Aluminiumblocks, der oben auf dem Temperaturmodul platziert ist, beginnend mit A1 und vertikal nach unten. Platzieren Sie dann die DTT-Lösung in der A6-Vertiefung des Vier-in-Eins-Rohrgestells mit einer Zwei-Milliliter-Rohrhalterplatte. Beobachten Sie, wie der Roboter ein entsprechendes Volumen des Ammoniumbicarbonatpuffers auf die Probenröhrchen im Aluminiumblock überträgt.Überprüfen Sie dann manuell, ob das Roboterprogramm angehalten ist und die Meldung "Sicherstellen, dass DTT in A6 des Zwei-Milliliter-Rohrracks in Steckplatz vier geladen wurde" anzeigt, bevor Sie das Protokoll fortsetzen. Nachdem Sie die Position der DTT-Röhre bestätigt und die Röhrenkappe geöffnet haben, klicken Sie in der Opentrons-App auf die Schaltfläche Fortsetzen, um fortzufahren. Stellen Sie sicher, dass der Roboter 10 Mikroliter der DVB-T-Lösung in jede Probenbohrung überträgt, gefolgt von fünf Mischrunden.Überprüfen Sie als Nächstes, ob das Roboterprogramm angehalten ist und die Meldung Sicherstellen, dass Kappen auf Probenröhrchen geschlossen werden angezeigt wird. Schließen Sie dann manuell die Kappen der Röhren und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren. Warten Sie, bis das Temperaturmodul des Roboters beginnt, den Aluminiumblock zu erwärmen und die Temperatur 55 Grad Celsius erreicht, gefolgt von einer fünfminütigen Inkubation, damit die Proben auf 55 Grad Celsius kommen können.Der Roboter hält diese Temperatur dann 30 Minuten lang, um eine Proteinreduktion per DVB-T zu ermöglichen. Bereiten Sie während der Inkubation eine Iodoacetamidlösung vor und wickeln Sie sie manuell mit Aluminiumfolie ein, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Nach der Inkubation, wenn das Programm des Roboters angehalten ist und die Warnmeldung anzeigt, Stellen Sie sicher, dass die Kappen auf den Probenröhrchen geöffnet werden, heben Sie die Kappen der Probenröhrchen auf und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren.Überprüfen Sie als Nächstes manuell, ob das Programm des Roboters mit der Warnmeldung "Sicherstellen, dass Iodoacetamid in B6 des Zwei-Milliliter-Rohrracks in Steckplatz vier geladen wurde" angehalten ist, bevor Sie das Protokoll fortsetzen. Nachdem Sie die Rack-Position des Iodoacetamid-Röhrchens bestätigt und die Röhrchenkappe geöffnet haben, klicken Sie auf Fortsetzen und stellen Sie sicher, dass der Roboter 10 Mikroliter der Iodoacetamid-Lösung in jedes Probenröhrchen überträgt, gefolgt von fünf Mischrunden. Wenn das Programm des Roboters angehalten ist und die Meldung "Kappen auf Probenröhrchen schließen", die Probenröhrchen verschließen und mit Folie abdecken, dann den gesamten Aluminiumblock mit einem sauberen Stück Folie abdecken und auf Fortsetzen klicken, um fortzufahren.Warten Sie 30 Minuten, bis die Proben bei 22 Grad Celsius inkubiert sind, und stellen Sie sicher, dass das Temperaturmodul des Roboters nach Abschluss der Iodoacetamid-Inkubation deaktiviert wird. Wenn das Programm des Roboters angehalten ist und die Warnmeldung anzeigt, Stellen Sie sicher, dass Trypsin in C6 des Zwei-Milliliter-Rohrracks in Steckplatz vier geladen wurde, bevor Sie das Protokoll wieder aufnehmen, legen Sie die Trypsin-Lösung in die C6-Vertiefung des Zwei-Milliliter-Rohrgestells mit geöffneter Rohrkappe und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren. Wenn dann das Programm des Roboters angehalten wird und die Warnmeldung angezeigt wird, Öffnen Sie die Kappen auf den Probenröhrchen auf dem Temperaturmodul, heben Sie die Probenröhrchen auf und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren.Standby, während der Roboter 10 Mikroliter Trypsin in jedes Probenröhrchen überträgt, gefolgt von fünf Mischrunden. Nach dem Trypsin-Aufschluss über Nacht die Proben mit einer Tischmikrozentrifuge kurz drehen und die Proben auf ein magnetisches Röhrchengestell legen. Nach zwei Minuten den Überstand vorsichtig mit einer Pipette in einen neuen Satz proteinarmer Mikrozentrifugenröhrchen geben und die Proben im Kühlschrank aufbewahren.Öffnen Sie als Nächstes die SP3_peptide_cleanup. py Python-Skript in einem Texteditor und geben Sie die Experimentvariablen nach Bedarf im Abschnitt NUR HIER ANPASSEN an. Laden Sie dann das Skript auf die Registerkarte Protokoll in der Opentrons-App hoch.Platzieren Sie die erforderlichen Laborgeräte und Pipetten an der entsprechenden Stelle im OT2-Deck, das im Python-Skript angegeben ist, und stellen Sie sicher, dass das Magnetmodul eingeschaltet und mit dem Roboter verbunden ist. Legen Sie eine neue, zwei Milliliter, 96-Well tiefe Vertiefungsplatte auf die Oberseite des Magnetmoduls. Als nächstes legen Sie die verdauten Proben in das Zwei-Milliliter-Röhrchengestell, beginnend bei A1 und vertikal nach unten.Stellen Sie dann sicher, dass der Roboter 55 Mikroliter der verdauten Proben zu den Vertiefungen in den Tiefbrunnenplatten auf dem Magnetmodul überträgt. Stellen Sie sicher, dass das Roboterprotokoll angehalten ist und die Meldung "Stellen Sie sicher, dass vorbereitete Perlen in A6 des Zwei-Milliliter-Rohrracks in Steckplatz vier geladen wurden" anzeigt, bevor Sie das Protokoll fortsetzen. Dann die SP3-Perlen in einer Mini-Tischzentrifuge wirbeln und kurz drehen und bei geöffneter Kappe in den A6-Brunnen des Zwei-Milliliter-Rohrgestells legen.Stellen Sie sicher, dass das Roboterprogramm angehalten ist und die Meldung "Stellen Sie sicher, dass 80 % Ethanol in A4 des 15-Milliliter plus 50-Milliliter-Röhrenracks geladen wurde, das sich in Steckplatz fünf befindet, vor der Wiederaufnahme des Protokolls" anzeigt. Legen Sie dann eine 80% ige Ethanollösung in die A4-Vertiefung im Röhrengestell und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren. Beobachten Sie, während der Roboter die Pipettiergeschwindigkeit auf langsam ändert, den Überstand aus jeder Vertiefung absaugt und in das Abfallrohr abgibt.Warten Sie, bis der Roboter die Pipettiergeschwindigkeit wieder auf standardisiert und das Magnetmodul abschaltet. Wenn das Roboterprogramm angehalten ist und die Meldung "Kappe auf Ammoniumbicarbonatrohr öffnen" anzeigt, öffnen Sie die Kappe der Ammoniumbicarbonatlösung und klicken Sie dann auf Fortsetzen, um fortzufahren. Standby, während der Roboter das Magnetmodul ausschaltet, 250 Mikroliter des Ammoniumbicarbonatpuffers in jede Vertiefung überträgt und sofort 10 Mal mischt.Beobachten Sie dann, während der Roboter die Pipettiergeschwindigkeit auf langsam ändert und den Überstand von jedem Bohrloch in das Abfallrohr überträgt. Warten Sie, bis der Roboter 100 Mikroliter des Ammoniumbicarbonatpuffers in jede Vertiefung überträgt und sofort 10 Mal mischt. Stellen Sie sicher, dass das Roboterprogramm angehalten ist und die Meldung "Stellen Sie sicher, dass neue Sammelrohre in den Zwei-Milliliter-Aluminiumblock gelegt wurden, bevor sie das Protokoll fortsetzen" anzeigt.Legen Sie dann unmittelbar nach dem letzten Probenröhrchen, das sich zunächst im Block befand, einen neuen Satz proteinretenarmer Mikrozentrifugenröhrchen in den Aluminiumblock und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren. Standby, während der Roboter jede Probe im Ammoniumbicarbonat-Puffer in die neuen Zwei-Milliliter-Röhrchen umgibt. Wenn das Programm des Roboters angehalten ist und die Meldung "Stellen Sie sicher, dass Trypsin in C6 des Zwei-Milliliter-Röhrenracks in Steckplatz vier geladen wurde, bevor das Protokoll fortgesetzt wird", legen Sie die Trypsinlösung in die C6-Vertiefung des Zwei-Milliliter-Rohrgestells mit geöffneter Rohrkappe und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren.Sobald das Programm abgeschlossen ist, wickeln Sie die Probenröhrchenkappen mit Paraffinfolie ein, geben Sie alle Proben in einen temperaturgesteuerten Mischer und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 16 bis 20 Stunden mit 1.000 U / min Schütteln. Mit der BSA-Probe wurde ein Medium von 728 Peptidspektrumübereinstimmungen und 65 Peptiden mit Variationskoeffizienten von 5,2% bzw. 3,2% identifiziert. Mit einer komplexen Herzprobe wurde ein Medium von 9.526 Peptidspektrum-Übereinstimmungen, 7.558 Peptiden und 1.336 Proteinen in 10 Durchläufen mit 7,6% 5,9% bzw. 3,6% Variationskoeffizienten identifiziert.Um die Variabilität bei der Peptidquantifizierung zu bestimmen, wurden die Variationskoeffizienten der extrahierten Ionenchromatogrammintensitäten für 10 Peptide berechnet, die einem einzigartigen Protein zugeordnet sind. Wenn die Variabilitäten der experimentellen Ergebnisse von Mensch und Roboter bei der Messung der Proteinkonzentration weiter mit dem BCA-Assay verglichen wurden, war der durchschnittliche Variationskoeffizient des Roboter-BCA-Assays niedriger als der manuelle BCA-Assay für den Menschen. Dieses Protokoll reduziert die Laborzeit für die Verarbeitung jeder Probe.Es ebnet uns den Weg, Proteomik-Unterschiede in einem Panel von Zelllinien zwischen mehreren medikamentösen Behandlungen zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Forschung

Biochemie

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS für eingehende Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin und Asparagin Desamidierung in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Verwendung der Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline zur Analyse von mikrobiellen Protein- und Spezialisierten Metabolitendaten

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Ein All-in-One-Probenhalter für makromolekulare Röntgenkristallographie mit minimaler Hintergrundstreuung

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Eine Plasma-Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie mit einer automatisierten Workstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Präzise und genaue Einzelmolekül-FRET-Messungen mit der Open-Source-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...