Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרסי NIH F32-HL14919191 ל- YH; R00-HL144829 לאל על; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 ל- MPL. איור 1, איור 2, איור 3 נוצרים בעזרת כלי איור מדעי מבוסס אינטרנט, BioRender.com.

תסריטי פייתון המפותחים הופקדו ב- GitHub בכתובת: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. עותק של קבצי ה- Script ניתן בקובץ משלים 1. נא עיין במאגר GitHub עבור הגירסאות העדכניות ביותר.
1. הכנות ניסיוניות
<ol><li>בדוק את החומרה הדרושה לפני הפעלת הפרוטוקול. הערה: רכיבי החומרה הב?...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions.">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li><li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+reproducibility,+human+error,+and+public+policy.">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li><li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

שלבים קריטיים בפרוטוקול לקבלת הביצועים הטובים ביותר, יש להשתמש בתוכנות מעבדה מאומתות של Opentrons, מודולים וחומרים מתכלים התואמים ל- OT-2. תוכנות מעבדה מותאמות אישית ניתן ליצור בעקבות ההוראה של Opentrons ב Reference14. הקפד לכייל את סיפון OT-2, פיפטות, ו labware בעת שימוש בפעם הראשונה. זה...

פרוטאומיקה של רובה ציד מבוסס ספקטרומטריית מסה היא כלי רב עוצמה למדידת השפע של חלבונים רבים בדגימות ביולוגיות בו זמנית. ניסויי פרוטאומיקה בניתוח ביואינפורמטיקה משמשים באופן שגרתי לזיהוי סמנים ביולוגיים ולגלות מתחמים ביולוגיים ומסלולים הקשורים העומדים בבסיס מנגנונים פתולוגיים. עם הספציפיות האנליטית הגבוהה שלה ודיוק כמותי פוטנציאלי, פרוטאומיקה רובה ציד יש גם פוטנציאל מצוין להיות מאומץ על ידי מתקני מחקר ומעבדות אבחון לניתוח מדגם קליני ללא צורך להסתמך על נוגדנים1,2.
כדי להכין דגימות חלבון לניתוח פרוטאומיקה של רובה ציד, חלבונים המופקים מדגימות ביולוגיות (למשל, תאים ורקמות) בדרך כלל צריכים להיות מעובדים תחילה באמצעות פרוטוקולים ארוכים, כולל מדידת ריכוז החלבון לדוגמה, הפחתת חלבון ואלקלציה, ועיכול אנזימטי לפפטידים. יתר על כן, חלבונים המופקים במאגרי תמוגה נפוצים המכילים חומרי ניקוי דורשים לעתים קרובות שלבים נוספים של חילופי חוצץ או הסרת חומרי ניקוי לפני הניתוח מכיוון שדטרגנט יכול להפריע לעיכול טריפסין ולפגוע באופן משמעותי בביצועים של ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית במורד הזרם (ניתוח LC-MS /MS)3. פפטידים הם בדרך כלל מותפלים עוד יותר, מיובשים, ומחודשים בממסים תואמי LC-MS / MS בעקבות עיכול אנזימטי. הליכי ביוכימיה חלבונים אלה יכולים להיות עתירי עבודה וגוזלים זמן רב. לכן, הם ממשיכים להגביל את התפוקה של זרימות עבודה של פרוטאומיקה ולתרום לשונות של נתונים שנרכשו4,5. טעויות אנוש והטיות הוכרו כגורמים מכריעים המשפיעים על שונות הנתונים ועל רבייה6,7. כדי למזער טעויות אנוש בתהליכי עבודה של הכנת דגימת ספקטרומטריית מסה, נעשה שימוש במערכות רובוטיות אוטומטיות של צינורות כדי לשפר את התפוקה והשחזור של זיהוי חלבונים וכימות מפרוטאומיקה של רובה ציד וניתוח ספקטרומטריית מסה ממוקדת, שם התפתחויות כאלה הוכרזו כמסייעות להמשך הדחיפה לאימוץ נרחב של טכנולוגיות פרוטאומיקה במחקר קריטי ובהגדרות קליניות8, 9,10,11,12,13. עם זאת, רוב הפרוטוקולים הקיימים משתמשים בפלטפורמות רובוטיות לטיפול בנוזלים הדורשים השקעה והכשרה משמעותיות, ומגבילים את התועלת שלהם במעבדות רבות בסביבה האקדמית או בכל דרך אחרת עם תקציב מוגבל.
מאמר זה מתאר פרוטוקול המשתמש במערכת טיפול בנוזל רובוטי רובוטי בקוד פתוח בעלות נמוכה, OT-2, כדי להפוך חצי אוטומטית זרימת עבודה טיפוסית להכנת מדגם רובה ציד פרוטאומיקה. ל-OT-2 יש עלות נמוכה יותר ממערכות רבות אחרות לטיפול בנוזלים רובוטיים, ובזמן הכתיבה, הוא עולה כ-5,000 דולר אמריקאי. כאשר לוקחים בחשבון את המחירים של מודולים שונים ותוכנות מעבדה, העלות הכוללת להגדרת ניסויים בפרוטוקול זה בזמן הכתיבה היא סביב $10,000, מה שהופך אותו זול יותר לקבוצה רחבה בהרבה של מעבדות על פני אפשרויות יקרות יותר. ה- OT-2 תואם לתכנות קוד פתוח באמצעות סקריפטים של Python ומציע גמישות רבה בעיצוב פרוטוקול עשה זאת בעצמך המוגדר על-ידי המשתמש. באמצעות שלושה סקריפטים שפותחו בתוך הבית, הפרוטוקולים להלן מכסים ביצוע זרימת עבודה טיפוסית של הכנת דגימת פרוטאומיקה של רובה ציד בתחנת OT-2 עם תקן חלבון ארכיטיפי (אלבומין סרום בקר; BSA) ודגימת חלבון מורכבת של ליסט לב אנושי רגיל (איור 1). ההליכים לעיבוד (1) דגימת BSA ו-(2) דגימת ליסט לב מורכבת מפורטים בפרוטוקול סעיפים 1, 2, 5, 6 ו-3, 4, 5, 6, 6, בהתאמה. חרוזים מגנטיים שעברו שינוי קרבוקסילציה Sera-Mag מנוצלים בהכנת מדגם משופרת של שלב מוצק בסיר אחד (SP3) להסרת חומרי ניקוי ומלחים בדגימות החלבון והפפטיד. תקצירים טריפטיים מאלבומין בסרום בקר וחלבוני לב אנושיים מנוקים עוד יותר על ידי חרוזי SP3 ומוגשים לניתוח LC-MS/MS. ספקטרום המסה מנותח לאחר מכן באמצעות תוכנת MaxQuant לזיהוי פפטיד וחלבון. תוצאות מייצגות המבוצעות על ידינו מראות כי הפרוטוקול משיג מקדמים טכניים מצוינים של וריאציה (CV) תוך חיסכון בזמן הספסל ואינו נחות לעיכול ידני.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

ניסויי פרוטאומיקה של רובה ציד מבוססי ספקטרומטריה המונית דורשים מספר שלבי הכנה מדגם, כולל עיכול חלבון אנזימטי וניקוי, אשר יכול לקחת שעות אדם משמעותיות של עבודת ספסל ולהציג מקור של שונות אצווה לאצווה. אוטומציה של מעבדה עם רובוטים מקטרים יכולה להפחית את העבודה הידנית, למקסם את התפוקה ולהגדיל את יכולת הרבייה המחקרית. עם זאת, המחירים ההתחלתיים התלולים של תחנות אוטומציה סטנדרטיות הופכים אותם לבלתי ניתנים להפרדה עבור מעבדות אקדמיות רבות. מאמר זה מתאר זרימת עבודה של הכנת מדגם פרוטאומיקה באמצעות מערכת אוטומציה של קוד פתוח במחיר סביר (The Opentrons OT-2), כולל הוראות להגדרת הפחתת חלבון אוטומטית למחצה, אלקילציה, עיכול וניקוי; כמו גם נלווה סקריפטים Python קוד פתוח לתכנת את מערכת OT-2 באמצעות ממשק תכנות היישומים שלה.

שלושה סקריפטים Python מסופקים כאן התואמים לרובוט OT-2, ומבצעים הכנה מדגמית עבור פרוטאומיקה ספקטרומטרית מסה עם אלבומין סרום בקר סטנדרטי חלבון יחיד (טכני משכפל n = 5 עיכולים) ודגימת ליסט לב אנושי המכילה חומר ניקוי (n = 5 עיכולים). כל מוצר תקציר מחולק לשתי תגובות ניקוי פפטיד. מספר ההתאמות המזוהות בספק?...

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

פרוטוקול מפורט ושלושה סקריפטים של פייתון מסופקים להפעלת מערכת טיפול בנוזל רובוטי בקוד פתוח לביצוע הכנת דגימת חלבון אוטומטית למחצה לניסויי ספקטרומטריית מסה, המכסים הסרת חומרי ניקוי, עיכול חלבונים ושלבי התפלת פפטידים.

רובה ציד Proteomics עיבוד מדגם אוטומטי על ידי רובוט מעבדה קוד פתוח

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

פרוטוקול זה משתמש באוטומציה כדי לבצע תכשירים לביוכימיה של חלבונים לפני ניסויי ספקטרומטריית מסה, המאפשרים תפוקה גבוהה יותר ושונות נמוכה יותר למחקרים פרוטאומיים. פרוטוקול זה משתמש במערכת טיפול בנוזלים זולה הניתנת לתכנות הניתנת לתכנות, הניתנת במחיר סביר למעבדות נוספות. אנו מספקים סקריפטים קוד פתוח של פייתון שניתן לשנות לפיתוח נוסף.מי שמדגים את ההליך יהיה מילטון אמאיה, סטודנט לתואר שני במעבדה שלנו. כדי להתחיל, פתח את noSP3_Digestion. קובץ Script py בעורך הטקסט וציין את המשתנים הספציפיים לניסוי לפי הצורך בסעיף התאמה אישית כאן בלבד.לאחר מכן, פתח את האפליקציה Opentrons והעלה את קובץ ה- Script לכרטיסיה פרוטוקול ביישום Opentrons. לאחר מכן, מקם את תוכנות המעבדה והפיפטות הנדרשות במיקום המתאים בחפיסת OT2 שצוינה בתסריט של פייתון. לאחר מכן, מניחים את תמיסת האמוניום ביקרבונט בבאר A1 של מתלה הצינורות 4 באחד עם מחזיק צינור 15 מיליליטר בתוספת 50 מיליליטר למעלה ומניחים את דגימת החלבון בבאר A1 של מתלה הצינור ארבעה באחד עם מחזיק צינור שני מיליליטר העליון.הניחו באופן ידני צינורות בעלי 2 מיליליטר בצינורות של בלוק האלומיניום המונחים על גבי מודול הטמפרטורה, החל מ- A1 ונעים למטה אנכית. לאחר מכן, מקם את פתרון DTT בבאר A6 של מתלה הצינור ארבעה באחד עם מחזיק צינור שני מיליליטר העליון. שימו לב בזמן שהרובוט מעביר נפח מתאים של מאגר האמוניום ביקרבונט לצינורות הדגימה בבלוק האלומיניום.לאחר מכן, ודא באופן ידני שתוכנית הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה, ודא ש- DTT נטען ל- A6 של ארון הצינורות של שני מיליליטר הממוקם בחריץ ארבע לפני חידוש הפרוטוקול. לאחר אישור המיקום של צינור DTT ופתיחת מכסה הצינור, לחץ על לחצן חדש באפליקציית Opentrons כדי להמשיך. ודא כי הרובוט מעביר 10 מיקרוליטרים של פתרון DTT לכל מדגם היטב, ואחריו חמישה סיבובי ערבוב.לאחר מכן, ודא שתוכנית הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה, הקפד לסגור כובעים בצינורות מדגם. לאחר מכן, סגור באופן ידני את המכסים של הצינורות ולחץ על Resume כדי להמשיך. חכו עד שמודול הטמפרטורה של הרובוט יתחיל לחמם את בלוק האלומיניום והטמפרטורה תגיע ל-55 מעלות צלזיוס, ואחריה דגירה של חמש דקות כדי לאפשר לדגימות להגיע ל-55 מעלות צלזיוס.לאחר מכן הרובוט יחזיק את הטמפרטורה הזו במשך 30 דקות כדי לאפשר הפחתת חלבון על ידי DTT. במהלך הדגירה, להכין פתרון iodoacetamide ולעטוף אותו באופן ידני עם רדיד אלומיניום, כדי למנוע חשיפה לאור. לאחר הדגירה, כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את הודעת האזהרה, הקפד לפתוח כובעים על צינורות מדגם, לפתוח את צינורות המדגם ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך.לאחר מכן, ודא באופן ידני כי התוכנית של הרובוט מושהה עם הודעת האזהרה, ודא iodoacetamide נטען לתוך B6 של מתלה צינור שני מיליליטר הממוקם בחריץ ארבע לפני חידוש הפרוטוקול. לאחר אישור מיקום המדף של צינור iodoacetamide ופתיחת מכסה הצינור, לחץ על קורות חיים וודא כי הרובוט מעביר 10 מיקרוליטרים של פתרון iodoacetamide לכל צינור מדגם, ואחריו חמישה סיבובי ערבוב. כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה, סגור כובעים על צינורות מדגם, לכסות את צינורות המדגם ולכסות אותם בנייר כסף, ולאחר מכן לכסות את בלוק האלומיניום כולו עם חתיכת נייר אלומיניום נקי ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך.המתינו עד שהדגימות ידגרו ב-22 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, וודאו שמודול הטמפרטורה של הרובוט מתפרק עם השלמת הדגירה של האיאודו-אצטטמיד. כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את הודעת האזהרה, ודא טריפסין נטען לתוך C6 של ארון צינור שני מיליליטר הממוקם בחריץ ארבע לפני חידוש הפרוטוקול, למקם פתרון טריפסין בבאר C6 של מתלה צינור שני מיליליטר עם מכסה הצינור פתוח, ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך. לאחר מכן, כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את הודעת האזהרה, פתח כובעים על צינורות מדגם במודול הטמפרטורה, בטל את צינורות הדגימה ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך.המתנה בזמן שהרובוט מעביר 10 מיקרוליטרים של טריפסין לכל צינור דגימה, ואחריו חמישה סיבובי ערבוב. לאחר עיכול טריפסין בן לילה, לסובב בקצרה את הדגימות באמצעות microcentrifuge ספסל ומניחים את הדגימות על מתלה צינור מגנטי. לאחר שתי דקות, העבירו את הסופר-צינור בזהירות עם פיפטה לקבוצה חדשה של צינורות מיקרו-צנטריפוגה בעלי קיבולת נמוכה של חלבון, ושמרו את הדגימות במקרר.לאחר מכן, פתח את SP3_peptide_cleanup. סקריפט py Python בעורך טקסט, וציין את משתני הניסוי לפי הצורך בסעיף התאמה אישית כאן בלבד. לאחר מכן, העלה את קובץ ה- Script לכרטיסיה פרוטוקול ביישום Opentrons.מקם את תוכנות המעבדה והפיפטות הנדרשות במיקום המתאים בחפיסת OT2 שצוינה בתסריט פייתון, וודא שהמודול המגנטי מופעל ומחובר לרובוט. מניחים לוח באר חדש, שני מיליליטר, 96-well עמוק היטב על החלק העליון של המודול המגנטי. לאחר מכן, מקם את הדגימות המעוכלות בארון הצינורות של שני מיליליטר החל מ- A1 ותנועה למטה אנכית.לאחר מכן, ודאו שהרובוט מעביר 55 מיקרוליטרים של הדגימות המעוכלות לבארות בלוחות הבאר העמוקים במודול המגנטי. ודא שפרוטוקול הרובוט מושהה ומציג את ההודעה, ודא שחרוזים מוכנים נטענו לתוך A6 של מתלה צינור שני מיליליטר הממוקם בחריץ ארבע לפני חידוש הפרוטוקול. לאחר מכן, מערבולת לזמן קצר לסובב את חרוזי SP3 בצנטריפוגה מיני ספסל ומניחים אותם בבאר A6 של מתלה צינור שני מיליליטר עם הכובע פתוח.ודא שתוכנית הרובוטים מושהית ומציגה את ההודעה, ודא ש- 80% אתנול נטען ל- A4 של 15 מיליליטר בתוספת ארון אוורור של 50 מיליליטר הממוקם בחריץ חמש לפני חידוש הפרוטוקול. לאחר מכן, למקם פתרון 80% אתנול בבאר A4 בארון הצינור ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך. שימו לב בזמן שהרובוט משנה את מהירות הצנרת להאטה, שואף את הסופר-נרטיב מכל באר ומחלק אותו לצינור הפסולת.המתן עד שהרובוט ישנה את מהירות הצנרת בחזרה לברירת המחדל וינתק את המודול המגנטי. כאשר תוכנית הרובוטים מושהית ומציגה את ההודעה, פתח את המכסה על צינור אמוניום ביקרבונט, פתח את המכסה של פתרון אמוניום ביקרבונט ולאחר מכן לחץ על קורות חיים כדי להמשיך. המתנה בזמן שהרובוט מנתק את המודול המגנטי, מעביר 250 מיקרוליטרים של חיץ האמוניום ביקרבונט לכל באר, ומיד מתערבב במשך 10 פעמים.לאחר מכן, התבונן בזמן שהרובוט משנה את מהירות הצנרת להאטה, ומעביר את הסופר-נרטיב מכל באר לצינור הפסולת. המתינו עד שהרובוט יעביר 100 מיקרוליטרים של מאגר האמוניום ביקרבונט לכל באר ומיד יתערבבו 10 פעמים. ודא שתוכנית הרובוטים מושהית ומציגה את ההודעה, ודא שצינורות איסוף חדשים הוצבו בבלוק האלומיניום של שני מיליליטר לפני חידוש הפרוטוקול.לאחר מכן, מקם קבוצה חדשה של צינורות מיקרו-צנטריפוגה עם שימור חלבון נמוך בבלוק האלומיניום מיד לאחר צינור הדגימה האחרון בתחילה בבלוק, ולחץ על חדש כדי להמשיך. המתנה בזמן שהרובוט מעביר כל דגימה במאגר האמוניום ביקרבונט לצינורות שני המיליליטר החדשים. כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה, ודא טריפסין נטען לתוך C6 של מתלה צינור שני מיליליטר הממוקם בחריץ ארבע לפני חידוש הפרוטוקול, למקם את פתרון טריפסין בבאר C6 של מתלה צינור שני מיליליטר עם מכסה הצינור פתוח, ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך.לאחר שהתוכנית מסתיימת לרוץ, לעטוף את כובעי צינור מדגם עם סרט פרפין, להעביר את כל הדגימות למיקסר מבוקר טמפרטורה, ודגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 20 שעות עם 1, 000 סל"ד רועד. עם מדגם BSA, זוהה מדיום של 728 התאמות ספקטרום פפטיד ו 65 פפטידים זוהו, עם 5.2% ו 3.2% מקדמי וריאציה, בהתאמה. עם דגימת לב מורכבת, זוהה מדיום של 9, 526 התאמות בספקטרום פפטידים, 7, 558 פפטידים ו-1, 336 חלבונים ב-10 ריצות עם 7.6%5.9% ו-3.6% מקדמי וריאציה, בהתאמה.כדי לקבוע את השונות בכימות פפטיד, מקדמי וריאציה של עוצמות כרומטוגרמה יון שחולצו חושבו עבור 10 פפטידים הממפים לחלבון ייחודי. כאשר השונות של תוצאות ניסוי אנושיות לעומת רובוטיות במדידת ריכוז החלבון הושוו עוד יותר לבדיקת BCA, המקדם הממוצע של וריאציה של בדיקת הרובוט BCA היה נמוך יותר מאשר בדיקת BCA הידנית האנושית. פרוטוקול זה מקטין את זמן הספסל לעיבוד כל דגימה.זה סולל לנו את הדרך לחקור את ההבדלים בפרוטאומיקה בפאנל של קווי תאים בין טיפולים תרופתיים מרובים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS עבור אפיון מעמיק וכימות של גלוטמין ו asparagine Deamidation ב פרוטאומיקה Shotgun

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

הכנת כלורופלסט תאי המשנה של תודרנית לניתוח של חלבון לוקליזציה Immunoblotting או פרוטאומיקס

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

באמצעות מקור פתוח MALDI תוף-MS IDBac הניתוח של חלבון מיקרוביאלית ונתונים מיוחדים מטבוליט

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

מחזיק מדגם All-in-one עבור קריסטלוגרפיה Macromolecular X-ray עם פיזור רקע מינימלי

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

הכנה לדוגמא להגשת מתקנים פרוטאומניקס וניתוח נתונים שלאחר מכן

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

ביצוע מדידות FRET מדויקות ומדויקות באמצעות smfBox קוד פתוח

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...