Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato in parte dai premi NIH F32-HL149191 a YH; R00-HL144829 a EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 a MPL. La Figura 1, la Figura 2, la Figura 3 vengono create con l'ausilio di uno strumento di illustrazione scientifica basato sul Web, BioRender.com.

Gli script Python sviluppati sono stati depositati su GitHub all'indirizzo: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Una copia degli script è fornita nel file supplementare 1. Fare riferimento al repository GitHub per le versioni più recenti.
1. Preparazioni sperimentali
<ol><li>Controllare l'hardware richiesto prima di avviare il protocollo. NOTA: sono necessari i seguenti componenti hardware: pipette OT-2, punte per pipette, set ...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions.">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li><li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+reproducibility,+human+error,+and+public+policy.">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li><li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

Passaggi critici all'interno del protocollo Per ottenere le migliori prestazioni, è necessario utilizzare labware, moduli e materiali di consumo compatibili con OT-2 verificati da Opentrons. Il labware personalizzato può essere creato seguendo le istruzioni di Opentrons su Reference14. Assicurarsi di calibrare il deck OT-2, le pipette e il labware quando vengono utilizzati per la prima volta. È anche fondamentale seguire le linee guida del produttore di perline SP3 per prepa...

La proteomica del fucile a pompa basata sulla spettrometria di massa è un potente strumento per misurare l'abbondanza di molte proteine in campioni biologici contemporaneamente. Gli esperimenti di proteomica con l'analisi bioinformatica sono abitualmente impiegati per identificare i biomarcatori e scoprire complessi biologici associati e percorsi alla base dei meccanismi patologici. Con la sua elevata specificità analitica e la potenziale accuratezza quantitativa, la proteomica del fucile da caccia ha anche un eccellente potenziale per essere adottata da strutture di ricerca e laboratori diagnostici per l'analisi di campioni clinici senza la necessità di fare affidamento sugli anticorpi1,2.
Per preparare campioni proteici per l'analisi proteomica shotgun, le proteine estratte da campioni biologici (ad esempio, cellule e tessuti) in genere devono prima essere elaborate utilizzando protocolli lunghi, tra cui la misurazione della concentrazione proteica del campione, la riduzione delle proteine e l'alchilazione e la digestione enzimatica in peptidi. Inoltre, le proteine estratte in comuni tamponi di lisi contenenti detergenti spesso richiedono ulteriori fasi di scambio tampone o rimozione del detergente prima dell'analisi perché il detergente può interferire con la digestione della tripsina e degradare significativamente le prestazioni dell'analisi a valle della cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS)3. I peptidi sono in genere ulteriormente dissalati, essiccati e ricostituiti in solventi compatibili LC-MS/MS dopo la digestione enzimatica. Queste procedure di biochimica delle proteine possono essere laboriose e dispendiose in termini di tempo. Pertanto, continuano a limitare il throughput dei flussi di lavoro di proteomica e contribuiscono alla variabilità dei dati acquisiti4,5. Gli errori e i pregiudizi umani sono stati riconosciuti come fattori cruciali che influenzano la varianza e la riproducibilità dei dati6,7. Per ridurre al minimo gli errori umani nei flussi di lavoro di preparazione dei campioni di spettrometria di massa, sono stati utilizzati sistemi robotici di pipettaggio automatizzati per migliorare la produttività e la riproducibilità dell'identificazione e della quantificazione delle proteine dalla proteomica shotgun e dall'analisi mirata della spettrometria di massa, dove tali progressi sono stati salutati come strumentali per continuare la spinta verso l'adozione diffusa di tecnologie proteomiche nella ricerca critica e in contesti clinici8, 9,10,11,12,13. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli esistenti utilizza piattaforme robotiche di gestione dei liquidi che richiedono investimenti e formazione sostanziali, limitando la loro utilità in molti laboratori in ambiente accademico o altrimenti con un budget limitato.
Questo articolo descrive un protocollo che utilizza un sistema di gestione dei liquidi robotico open source a basso costo, l'OT-2, per semi-automatizzare un tipico flusso di lavoro di preparazione dei campioni di proteomica del fucile. L'OT-2 ha un costo inferiore rispetto a molti altri sistemi robotici di gestione dei liquidi e, al momento della scrittura, costa circa $ 5.000 dollari USA. Quando si tiene conto dei prezzi di diversi moduli e labware, il costo totale per impostare esperimenti in questo protocollo al momento della scrittura è di circa $ 10.000, il che lo rende più conveniente per un insieme considerevolmente più ampio di laboratori rispetto a opzioni più costose. L'OT-2 è compatibile con la programmazione open source tramite script Python e offre grandi flessibilità nella progettazione di protocolli fai-da-te definiti dall'utente. Utilizzando tre script sviluppati internamente, i protocolli sottostanti coprono l'esecuzione di un tipico flusso di lavoro di preparazione del campione di proteomica shotgun sulla stazione OT-2 con uno standard proteico archetipico (albumina sierica bovina; BSA) e un campione proteico complesso di un normale lisato cardiaco umano (Figura 1). Le procedure per l'elaborazione (1) di un campione BSA e (2) di un campione complesso di lisato cardiaco sono dettagliate rispettivamente nelle sezioni 1, 2, 5, 6 e 3, 4, 5, 6 del protocollo. Le perle magnetiche modificate con carbossilato Di Sera-Mag sono utilizzate nella preparazione di campioni a fase solida (SP3) a vaso singolo per rimuovere detergenti e sali nei campioni di proteine e peptidi. I digest triptici dell'albumina sierica bovina e delle proteine cardiache umane vengono ulteriormente puliti dalle perline SP3 e sottoposti all'analisi LC-MS/MS. Gli spettri di massa vengono quindi analizzati utilizzando il software MaxQuant per l'identificazione di peptidi e proteine. I risultati rappresentativi da noi eseguiti mostrano che il protocollo raggiunge eccellenti coefficienti tecnici di variazione (CV) risparmiando tempo al banco ed è non inferiore alla digestione manuale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

Gli esperimenti di proteomica a fucile basati sulla spettrometria di massa richiedono più fasi di preparazione del campione, tra cui la digestione e la pulizia enzimatica delle proteine, che possono richiedere significative ore di lavoro al banco e presentare una fonte di variabilità da lotto a lotto. L'automazione di laboratorio con robot di pipettaggio può ridurre il lavoro manuale, massimizzare la produttività e aumentare la riproducibilità della ricerca. Tuttavia, i prezzi di partenza elevati delle stazioni di automazione standard le rendono inaccessibili per molti laboratori accademici. Questo articolo descrive un flusso di lavoro di preparazione dei campioni di proteomica utilizzando un conveniente sistema di automazione open source (The Opentrons OT-2), comprese le istruzioni per l'impostazione di passaggi semi-automatizzati di riduzione delle proteine, alchilazione, digestione e pulizia; così come gli script Python open source di accompagnamento per programmare il sistema OT-2 attraverso la sua interfaccia di programmazione delle applicazioni.

Qui vengono forniti tre script Python compatibili con il robot OT-2 e che eseguono la preparazione del campione per la proteomica della spettrometria di massa con una singola proteina standard di albumina sierica bovina (replica tecnicamente n = 5 digestioni) e un campione di lisato cardiaco umano contenente detergente (n = 5 digestioni). Ogni prodotto digestivo è suddiviso in due reazioni di pulizia peptidica. Il numero di corrispondenze peptidiche-spettro (PSM), peptidi e proteine identificati in ogni serie di campion...

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Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Protocollo dettagliato e tre script Python sono forniti per il funzionamento di un sistema di gestione dei liquidi robotico open source per eseguire la preparazione semi-automatizzata di campioni proteici per esperimenti di spettrometria di massa, che coprono la rimozione del detergente, la digestione delle proteine e le fasi di desalinizzazione dei peptidi.

Elaborazione dei campioni di Shotgun Proteomics automatizzata da un robot da laboratorio open source

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Questo protocollo utilizza l'automazione per eseguire preparazioni di biochimica proteica prima degli esperimenti di spettrometria di massa, consentendo una maggiore produttività e una minore variabilità per gli studi proteomici. Questo protocollo utilizza un sistema di gestione dei liquidi programmabile a basso costo che è conveniente per più laboratori. Forniamo script Python open source che possono essere modificati per ulteriori sviluppi.A dimostrare la procedura sarà Milton Amaya, studente di un master nel nostro laboratorio. Per iniziare, apri il noSP3_Digestion. py nell'editor di testo e specificare le variabili specifiche dell'esperimento secondo necessità nella sezione PERSONALIZZA SOLO QUI.Quindi, apri l'app Opentrons e carica lo script nella scheda Protocollo nell'app Opentrons. Quindi, posizionare il labware e le pipette richiesti nella posizione corrispondente nel deck OT2 specificato nello script Python. Quindi, posizionare la soluzione di bicarbonato di ammonio nel pozzetto A1 del rack a tubi quattro in uno con la parte superiore portatubi da 15 millilitri più 50 millilitri e posizionare il campione proteico nel pozzetto A1 del rack per tubi quattro in uno con un piano portatubi da due millilitri.Posizionare manualmente tubi a basso legame proteico da due millilitri nei pozzetti del blocco di alluminio posto sopra il modulo di temperatura, partendo da A1 e spostandosi verso il basso verticalmente. Quindi, posizionare la soluzione DTT nel pozzetto A6 del rack tubolare quattro in uno con un supporto per tubi da due millilitri. Osservare mentre il robot trasferisce un volume appropriato del tampone di bicarbonato di ammonio alle provette campione nel blocco di alluminio.Quindi, verificare manualmente che il programma robot sia in pausa e visualizzi il messaggio, Assicurarsi che DTT sia stato caricato in A6 del rack tubolare a due millilitri situato nello slot quattro prima di riprendere il protocollo. Dopo aver confermato la posizione del tubo DTT e aver aperto il tappo del tubo, fare clic sul pulsante Riprendi nell'app Opentrons per continuare. Assicurarsi che il robot trasferisca 10 microlitri della soluzione DTT a ciascun pozzo campione, seguito da cinque cicli di miscelazione.Quindi, verificare che il programma robot sia in pausa e visualizzi il messaggio, Assicurarsi di chiudere i tappi sulle provette campione. Quindi, chiudi manualmente i tappi dei tubi e fai clic su Riprendi per continuare. Attendere che il modulo di temperatura del robot inizi a riscaldare il blocco di alluminio e la temperatura raggiunga i 55 gradi Celsius, seguita da un'incubazione di cinque minuti per consentire ai campioni di arrivare a 55 gradi Celsius.Il robot manterrà quindi questa temperatura per 30 minuti per consentire la riduzione delle proteine tramite DTT. Durante l'incubazione, preparare la soluzione di iodoacetammide e avvolgerla manualmente con un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Dopo l'incubazione, quando il programma del robot viene messo in pausa e viene visualizzato il messaggio di avviso, assicurarsi di aprire i tappi sulle provette campione, aprire le provette del campione e fare clic su Riprendi per continuare.Quindi, verificare manualmente che il programma del robot sia in pausa con il messaggio di avviso, Assicurarsi che la iodoacetammide sia stata caricata in B6 del rack tubolare da due millilitri situato nello slot quattro prima di riprendere il protocollo. Dopo aver confermato la posizione del rack del tubo di iodoacetamide e aver aperto il tappo del tubo, fare clic su Riprendi e assicurarsi che il robot trasferisca 10 microlitri della soluzione di iodoacetammide a ciascun tubo campione, seguito da cinque cicli di miscelazione. Quando il programma del robot viene messo in pausa e visualizza il messaggio, chiudi i tappi sulle provette del campione, copri i tubi del campione e coprili con un foglio, quindi copri l'intero blocco di alluminio con un foglio pulito e fai clic su Riprendi per continuare.Attendere che i campioni vengano incubati a 22 gradi Celsius per 30 minuti e assicurarsi che il modulo di temperatura del robot si disattivi al termine dell'incubazione di iodoacetammide. Quando il programma del robot viene messo in pausa e visualizza il messaggio di avviso, assicurarsi che la tripsina sia stata caricata in C6 del rack tubolare da due millilitri situato nello slot quattro prima di riprendere il protocollo, posizionare la soluzione di tripsina nel pozzetto C6 del rack tubolare a due millilitri con il tappo del tubo aperto e fare clic su Riprendi per continuare. Quindi, quando il programma del robot viene messo in pausa e visualizza il messaggio di avviso, aprire i tappi sulle provette del campione sul modulo di temperatura, aprire le provette del campione e fare clic su Riprendi per continuare.Standby mentre il robot trasferisce 10 microlitri di tripsina a ciascun tubo campione, seguiti da cinque cicli di miscelazione. Dopo la digestione notturna della tripsina, ruotare brevemente i campioni utilizzando una microcentrifuga da banco e posizionare i campioni su un rack magnetico. Dopo due minuti, trasferire il surnatante con attenzione con una pipetta in un nuovo set di tubi microcentrifuga proteici a basso legame e conservare i campioni in frigorifero.Quindi, apri il SP3_peptide_cleanup. py Python in un editor di testo e specificare le variabili dell'esperimento secondo necessità nella sezione PERSONALIZZA SOLO QUI. Quindi, carica lo script nella scheda Protocollo nell'app Opentrons.Posizionare il labware e le pipette richiesti nella posizione corrispondente nel deck OT2 specificato nello script Python e assicurarsi che il modulo magnetico sia acceso e collegato al robot. Posizionare una nuova piastra profonda 96 pozzetti a due millilitri sulla parte superiore del modulo magnetico. Quindi, posizionare i campioni digeriti nel rack del tubo a due millilitri a partire da A1 e spostandosi verso il basso verticalmente.Quindi, assicurati che il robot trasferisca 55 microlitri dei campioni digeriti ai pozzetti nelle piastre profonde del pozzo sul modulo magnetico. Verificare che il protocollo robot sia in pausa e visualizzi il messaggio, Assicurarsi che le perline preparate siano state caricate in A6 del rack tubolare a due millilitri situato nello slot quattro prima di riprendere il protocollo. Quindi, ruotare e ruotare brevemente le perline SP3 in una mini-centrifuga da banco e posizionarle nel pozzetto A6 del rack tubolare da due millilitri con il tappo aperto.Verificare che il programma robot sia in pausa e visualizzi il messaggio, Assicurarsi che l'80% di etanolo sia stato caricato in A4 del rack tubolare da 15 millilitri più 50 millilitri situato nello slot cinque prima di riprendere il protocollo. Quindi, posizionare una soluzione di etanolo all'80% nel pozzetto A4 nel rack del tubo e fare clic su Riprendi per continuare. Osservare mentre il robot cambia la velocità di pipettaggio per rallentare, aspira il surnatante da ciascun pozzo e lo eroga nel tubo di scarico.Attendere che il robot riporti la velocità di pipettaggio ai valori predefiniti e disinnesti il modulo magnetico. Quando il programma dei robot viene messo in pausa e visualizza il messaggio, Apri il tappo sul tubo di bicarbonato di ammonio, apri il cappuccio della soluzione di bicarbonato di ammonio, quindi fai clic su Riprendi per continuare. Standby mentre il robot disinnesta il modulo magnetico, trasferisce 250 microlitri del tampone di bicarbonato di ammonio a ciascun pozzetto e si mescola immediatamente per 10 volte.Quindi, osserva mentre il robot cambia la velocità di pipettaggio per rallentare e trasferisce il surnatante da ciascun pozzo al tubo di scarico. Attendere che il robot trasferisca 100 microlitri del tampone di bicarbonato di ammonio a ciascun pozzetto e si mescoli immediatamente per 10 volte. Verificare che il programma robot sia in pausa e visualizzi il messaggio, Assicurarsi che i nuovi tubi di raccolta siano stati inseriti nel blocco di alluminio da due millilitri prima di riprendere il protocollo.Quindi, posizionare un nuovo set di tubi microcentrifuga a bassa ritenzione proteica nel blocco di alluminio immediatamente dopo l'ultima provetta campione inizialmente nel blocco e fare clic su Resume per continuare. Standby mentre il robot trasferisce ogni campione nel tampone di bicarbonato di ammonio ai nuovi tubi da due millilitri. Quando il programma del robot viene messo in pausa e visualizza il messaggio, assicurarsi che la tripsina sia stata caricata in C6 del rack tubolare da due millilitri situato nello slot quattro prima di riprendere il protocollo, posizionare la soluzione di tripsina nel pozzetto C6 del rack tubolare da due millilitri con il tappo del tubo aperto e fare clic su Riprendi per continuare.Una volta terminato il programma, avvolgere i tappi del tubo campione con pellicola di paraffina, trasferire tutti i campioni in un miscelatore a temperatura controllata e incubare a 37 gradi Celsius per 16-20 ore con 1.000 RPM scuotendo. Con il campione BSA, sono stati identificati un mezzo di 728 corrispondenze dello spettro peptidico e 65 peptidi, con coefficienti di variazione rispettivamente del 5,2% e del 3,2%. Con un campione cardiaco complesso, un mezzo di 9.526 corrispondenze dello spettro peptidico, 7.558 peptidi e 1.336 proteine è stato identificato in 10 cicli con coefficienti di variazione del 7,6% 5,9% e del 3,6%.Per determinare la variabilità nella quantificazione peptidica, i coefficienti di variazione delle intensità del cromatogramma ionico estratto sono stati calcolati per 10 peptidi che mappano a una proteina unica. Quando le variabilità dei risultati sperimentali umani rispetto a quelli robot nella misurazione della concentrazione proteica sono state ulteriormente confrontate con il test BCA, il coefficiente medio di variazione del test BCA robot era inferiore al test BCA manuale umano. Questo protocollo riduce il tempo di banco per l'elaborazione di ciascun campione.Ci apre la strada per esplorare le differenze proteomiche in un pannello di linee cellulari tra più trattamenti farmacologici.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automated acustico di erogazione per la diluizione seriale di Peptide Agonisti in potenza Determinazione Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Ricerca

Biochimica

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS per approfondita caratterizzazione e quantificazione di glutammina e asparagina deamidazione in Fucile Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Preparazione del cloroplasto Sub-compartimenti da Arabidopsis per l'analisi di localizzazione della proteina di Immunoblotting o proteomica

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Utilizzo della pipeline OPEN-Source MALDI TOF-MS IDBac per l'analisi dei dati sulle proteine microbiche e sui metaboliti specializzati

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Un portacampioni all-in-one per la cristallografia a raggi X macromolecolare con una dispersione minima dello sfondo

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Preparazione di un campione di plasma per la spettrometria di massa mediante una workstation automatizzata

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparazione del campione TMT per l'invio di strutture proteomiche e la successiva analisi dei dati

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Effettuare misurazioni FRET a singola molecola precise e accurate utilizzando l'smfBox open source

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...