Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

この作品は、YHに対するNIH賞F32-HL149191によって部分的にサポートされました。R00-HL144829 から EL;R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 to MPL. 図1、 図2、 図3 は、ウェブベースの科学イラストレーションツールの助けを借りて作成された、BioRender.com。

開発された Python スクリプトは GitHub に入金されました: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons。スクリプトのコピーは 、補足ファイル 1 に記載されています。最新バージョンについては、GitHub リポジトリを参照してください。
1. 実験準備
<ol><li>プロトコルを開始する前に、必要なハードウェアを確認してください。 注:次のハードウ?...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions.">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li><li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+reproducibility,+human+error,+and+public+policy.">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li><li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

プロトコル内の重要なステップ 最高のパフォーマンスを得るため、OT-2と互換性のあるOpentrons検証済みのラボウェア、モジュール、および消耗品を使用する必要があります。カスタムラボウェアは、Reference14でのOpentronsの指示に従って作成できます。OT-2デッキ、ピペット、ラボウェアを初めて使用する場合は必ず調整してください。また、ペプチドおよびタン...

質量分析ベースの散弾銃プロテオミクスは、生物学的サンプル中の多くのタンパク質の存在量を同時に測定する強力なツールです。バイオインフォマティクス解析を用いたプロテオミクス実験は、バイオマーカーを同定し、病理学的メカニズムを支える関連する生物学的複合体および経路を発見するために日常的に使用されています。高い分析物特異性と潜在的な定量精度により、ショットガンプロテオミクスは、抗体に頼ることなく臨床サンプル分析のための研究施設や診断ラボで採用される優れた可能性を秘めています1,2。
ショットガンプロテオミクス分析用のタンパク質サンプルを調製するには、通常、生体サンプルから抽出したタンパク質(細胞や組織)は、サンプルタンパク質濃度の測定、タンパク質還元、アルキル化、ペプチドへの酵素消化など、長いプロトコルを使用して処理する必要があります。さらに、洗剤を含む一般的な溶解バッファーで抽出されたタンパク質は、多くの場合、分析の前にバッファー交換または洗剤除去の追加のステップを必要とするため、洗剤はトリプシン消化を妨げ、下流の液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)分析の性能を著しく低下させる可能性があります3.ペプチドは、典型的には、さらに脱塩、乾燥、および酵素消化に続くLC-MS/MS適合溶媒で再構成される。これらのタンパク質の生化学手順は、労働集約的で時間がかかる場合があります。したがって、彼らはプロテオミクスワークフローのスループットを制限し続け、取得したデータ4,5の変動に貢献します。人為的ミスとバイアスは、データの分散と再現性に影響を与える重要な要因として認識されてきました 6,7.質量分析サンプル調製ワークフローにおける人為的ミスを最小限に抑えるために、自動ピペットロボットシステムは、ショットガンプロテオミクスおよび標的質量分析によるタンパク質同定と定量のスループットと再現性を向上させるために利用され、そのような進歩は重要な研究および臨床現場でのプロテオミクス技術の普及を続けるためのインストゥルメンタルとして賞賛されている8 9,10,11,12,13.しかし、ほとんどの既存のプロトコルは、多額の投資とトレーニングを必要とするロボット液体処理プラットフォームを利用しており、学術環境の多くの研究室での有用性を制限したり、予算が限られているりします。
この記事では、低コストのオープンソースのロボット液体処理システムOT-2を利用して、典型的なショットガンプロテオミクスサンプル調製ワークフローを半自動化するプロトコルについて説明します。OT-2は他の多くのロボット液体ハンドリングシステムよりも低コストで、執筆時点では約5,000米ドルの費用がかかります。異なるモジュールやラボウェアの価格を考慮すると、執筆時点でこのプロトコルで実験を設定するための総コストは約$ 10,000であり、より高価なオプションよりもかなり広範なラボセットに手頃な価格になります。OT-2はPythonスクリプトを通したオープンソースプログラミングと互換性があり、ユーザー定義のDIYプロトコル設計に大きな柔軟性を提供します。3つの社内開発スクリプトを使用して、以下のプロトコルは、典型的なショットガンプロテオミクスサンプル調製ワークフローを、典型的なタンパク質標準(ウシ血清アルブミン)でOT-2ステーションで実行することをカバーしています。BSA)と正常なヒト心臓のタンパク質サンプルをライセート(図1)とした。(1)BSAサンプルおよび(2)複雑な心臓ライセートサンプルを処理する手順は、それぞれプロトコルセクション1、2、5、6および4、5、6で詳述されている。Sera-Magカルボキシレート変性磁気ビーズは、タンパク質およびペプチドサンプル中の洗剤および塩を除去するために、単一ポット固相強化サンプル調製(SP3)で利用されます。ウシ血清アルブミンおよびヒト心臓タンパク質からのトリプティック消化は、SP3ビーズによってさらに洗浄され、LC-MS/MS分析のために提出される。質量スペクトルは、ペプチドおよびタンパク質同定のためのMaxQuantソフトウェアを使用して分析されます。我々が行う代表的な結果は、プロトコルがベンチ時間を節約しながら、変動の優れた技術的係数(CV)を達成し、手の消化に劣り、示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

質量分析ベースの散弾銃プロテオミクス実験では、酵素タンパク質消化やクリーンアップなど、複数のサンプル調製ステップが必要であり、ベンチ労働の時間を要し、バッチ間の変動の原因を提示することができます。ピペットロボットによるラボの自動化により、手作業を削減し、スループットを最大化し、研究の再現性を向上させることができます。それでも、標準的なオートメーションステーションの急激な開始価格は、多くの学術研究所にとって手頃な価格ではありません。この記事では、半自動タンパク質還元、アルキル化、消化、およびクリーンアップ手順を設定するための指示を含む、手頃な価格のオープンソースオートメーションシステム(Opentrons OT-2)を使用したプロテオミクスサンプル調製ワークフローについて説明します。OT-2システムをアプリケーションプログラミングインタフェースでプログラミングするためのオープンソースのPythonスクリプトを伴います。

OT-2ロボットと互換性があり、単一のタンパク質標準ウシ血清アルブミン(技術的複製n = 5消化)と洗剤含有ヒト心臓ライセートサンプル(n = 5消化)を用いた質量分析プロテオミクスのサンプル調製を行う3つのPythonスクリプトが提供されています。各消化産物は、2つのペプチドのクリーンアップ反応に分割されます。BSAおよび心臓サンプルの各ランにおける同定されたペプチドスペクトルマッチ(P...

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Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

オープンソースのロボット液体処理システムを操作して、半自動タンパク質サンプル調製を行い、洗剤の除去、タンパク質消化、ペプチド脱塩のステップをカバーするための詳細なプロトコルと3つのPythonスクリプトが提供されています。

オープンソースのラボロボットによるショットガンプロテオミクスサンプル処理

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

このプロトコルは、質量分析の実験の前にタンパク質の生化学の準備を実行するために自動化を使用し、より高いスループットとプロテオミクス研究のためのより低い変動性を可能にします。このプロトコルは、より多くの実験室に手頃な価格である低コスト、プログラム可能な液体処理システムを使用しています。私たちは、さらなる開発のために変更することができるオープンソースのPythonスクリプトを提供します。この手順のデモンストレーションは、当研究室の修士課程の学生であるミルトン・アマヤです。開始するには、noSP3_Digestionを開きます。py スクリプトをテキストエディタで実行し、必要に応じて「ここでのみカスタマイズ」セクションで実験固有の変数を指定します。次に、Opentrons アプリを開き、Opentrons アプリの [プロトコル] タブにスクリプトをアップロードします。次に、Python スクリプトで指定された OT2 デッキの対応する場所に、必要なラボウェアとピペットを配置します。次に、15ミリリットルプラス50ミリリットルチューブホルダートップを備えた4インワンチューブラックのA1ウェルに炭酸水素アンモニウム溶液を置き、2ミリリットルチューブホルダートップを備えた4インワンチューブラックのA1ウェルにタンパク質サンプルを配置します。温度モジュールの上に置かれたアルミニウムブロックの井戸に2ミリリットルのタンパク質低結合チューブを手動で配置し、A1から垂直に下に移動します。次に、DTT溶液を2ミリリットルチューブホルダートップを備えた4インワンチューブラックのA6ウェルに入れます。ロボットがアルミニウムブロック内のサンプルチューブに適量の重炭酸アンモネートバッファーを転送している間に観察します。次に、手動でロボットプログラムが一時停止していることを確認し、プロトコルを再開する前にスロット4にある2ミリリットルチューブラックのA6にDTTがロードされていることを確認するメッセージを表示します。DTTチューブの位置を確認し、チューブキャップを開けた後、Opentronsアプリの再開ボタンをクリックして続行します。ロボットがDTT溶液の10マイクロリットルを各サンプルにうまく転送し、その後に5回の混合ラウンドを行うことを確認します。次に、ロボットプログラムが一時停止していることを確認し、「サンプルチューブのキャップを閉じるようにする」というメッセージが表示されます。次に、チューブのキャップを手動で閉じ、[再開]をクリックして続行します。ロボットの温度モジュールがアルミニウムブロックを加熱し始め、温度が摂氏55度に達するまで待ち、その後5分間のインキュベーションを行い、サンプルを摂氏55度にします。ロボットはこの温度を30分間保持し、DTTによるタンパク質還元を可能にします。インキュベーション中に、ヨドアセトアミド溶液を調製し、手動でアルミニウム箔で包み、光への暴露を避けます。インキュベーションの後、ロボットのプログラムが一時停止し、警告メッセージが表示されたら、サンプルチューブのキャップを開き、サンプルチューブのキャップを解除し、再開をクリックして続行します。次に、手動でロボットのプログラムが警告メッセージで一時停止されていることを確認し、プロトコルを再開する前に、スロット4にある2ミリリットルチューブラックのB6にIodoacetamideがロードされていることを確認します。ヨウアセトアセトアミドチューブのラック位置を確認し、チューブキャップを開けた後、Resumeをクリックして、ロボットが各サンプルチューブに10マイクロリットルのヨードアセトアセトアミド溶液を転送し、その後5回の混合ラウンドを確実に行います。ロボットのプログラムが一時停止し、メッセージを表示すると、サンプルチューブのキャップを閉じて、サンプルチューブをキャップし、ホイルでそれらをカバーし、きれいな箔でアルミニウムブロック全体をカバーし、続行するために再開をクリックします。サンプルが摂氏22度で30分間インキュベートされるまで待ち、ヨウドアセトアミドインキュベートが完了するとロボットの温度モジュールが非活性化することを確認します。ロボットのプログラムが一時停止し、警告メッセージが表示されたら、プロトコルを再開する前にスロット4に配置された2ミリリットルチューブラックのC6にトリプシンがロードされていることを確認し、チューブキャップを開いた状態で2ミリリットルチューブラックのC6ウェルにトリプシン溶液を配置し、再開をクリックして続行します。次に、ロボットのプログラムが一時停止し、警告メッセージが表示されたら、温度モジュールのサンプルチューブのキャップを開き、サンプルチューブのキャップを解除し、再開をクリックして続行します。スタンバイしながら、ロボットは各サンプルチューブにトリプシンの10マイクロリットルを転送し、その後5つの混合ラウンドが続きます。一晩トリプシン消化した後、ベンチトップマイクロ遠心分離機を使用してサンプルを簡単に回転させ、サンプルを磁気チューブラックに置きます。2分後、上清をピペットで慎重に低結合マイクロ遠心チューブの新しいセットに移し、サンプルを冷蔵庫に保管します。次に、SP3_peptide_cleanupを開きます。py Python スクリプトをテキスト エディタで実行し、必要に応じて「ここでのみカスタマイズ」セクションで実験変数を指定します。次に、Opentrons アプリの [プロトコル] タブにスクリプトをアップロードします。必要なラボウェアとピペットを、Python スクリプトで指定された OT2 デッキの対応する場所に配置し、磁気モジュールの電源がオンになって、ロボットに接続されていることを確認します。磁気モジュールの上部に、新しい2ミリリットル、96ウェルの深いウェルプレートを置きます。次に、消化したサンプルをA1から始めて垂直に下に移動する2ミリリットルのチューブラックに入れます。次に、ロボットが磁性モジュールの深い井戸プレートのウェルに消化されたサンプルの55マイクロリットルを転送することを確認します。ロボットプロトコルが一時停止され、メッセージが表示されていることを確認し、プロトコルを再開する前にスロット4にある2ミリリットルチューブラックのA6に準備されたビーズがロードされていることを確認します。その後、渦を巻き、SP3ビーズをミニベンチトップ遠心分離機で短時間回転させ、キャップを開けた2ミリリットルチューブラックのA6ウェルに置きます。ロボットプログラムが一時停止され、メッセージが表示されていることを確認し、80%エタノールがプロトコルを再開する前にスロット5にある15ミリリットルプラス50ミリリットルのチューブラックのA4にロードされていることを確認します。その後、80%エタノール溶液をチューブラックのA4ウェルに入れ、再開ボタンをクリックして続行します。ロボットがピペット速度を遅くしながら観察し、各井戸から上澄み物を吸引し、それを廃管に分配します。ロボットがピペットの速度をデフォルトに戻し、磁気モジュールを外すまで待ちます。ロボットプログラムが一時停止し、メッセージを表示すると、メッセージ、重炭酸アンモニウムチューブのオープンキャップ、重炭酸アンモニウム溶液のキャップを開き、続行するために再開をクリックします。ロボットが磁気モジュールを外している間にスタンバイ、各ウェルに炭酸アンモニウムバッファーの250マイクロリットルを転送し、すぐに10回混合します。次に、ロボットがピペット速度を遅くしながら観察し、各ウェルから上澄み液を廃棄物管に移します。ロボットが各井戸に炭酸アンモニウムバッファーの 100 マイクロリットルを転送し、すぐに 10 回混合するまで待ちます。ロボットプログラムが一時停止され、メッセージが表示されていることを確認します, 新しいコレクションチューブがプロトコルを再開する前に2ミリリットルアルミニウムブロックに配置されていることを確認します.次に、最後のサンプルチューブの直後にアルミニウムブロックに低タンパク質保持マイクロ遠心チューブの新しいセットを配置し、再開をクリックして続行します。ロボットが重炭酸アンモニウムバッファー内の各サンプルを新しい 2 ミリリットルチューブに移す間スタンバイ。ロボットのプログラムが一時停止し、メッセージを表示すると、プロトコルを再開する前にスロット4に配置された2ミリリットルチューブラックのC6にトリプシンがロードされていることを確認し、チューブキャップを開いた2ミリリットルチューブラックのC6ウェルにトリプシン溶液を配置し、再開をクリックして続行します。プログラムの実行が完了したら、サンプルチューブキャップをパラフィンフィルムで包み、すべてのサンプルを温度制御ミキサーに移し、1,000 RPMの揺れで摂氏37度で16〜20時間インキュベートします。BSAサンプルでは、それぞれ5.2%と3.2%の変動係数を持つ728ペプチドスペクトルマッチと65ペプチドの培地が同定されました。複合心臓サンプルでは、9、526個のペプチドスペクトルが一致する培地、7、558ペプチド、1、336個のタンパク質がそれぞれ7.6%5.9%と3.6%の変動係数で10回で同定されました。ペプチド定量のばらつきを決定するために、抽出されたイオンクロマトグラム強度の変動係数を、ユニークなタンパク質にマッピングする10個のペプチドについて計算した。ヒト対ロボット実験結果の変動性がBCAアッセイと比較してさらに比較された場合、ロボットBCAアッセイの変動係数の平均は、ヒトマニュアルBCAアッセイよりも低かった。このプロトコルは、各サンプルを処理するためのベンチ時間を短縮します。これは、複数の薬物治療の間の細胞株のパネルにおけるプロテオミクスの違いを探求する道を開きます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

効力決意アッセイにおけるペプチドアゴニストの連続希釈のために調剤自動アコースティック

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

ショットガンプロテオミクスにある深さの特徴付けのためLERLIC-MS / MSおよびグルタミンの定量化およびアスパラギン脱アミド

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

多量ホモ測定器と無料、フリー、オープン ソースの明るさ解析ソフトウェアを使用しての体外校正無料定量化

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

免疫ブロットやプロテオミクスによるタンパク質局在の解析シロイヌナズナから葉緑体小班の準備

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

微生物タンパク質および特殊代謝産物データの分析にオープンソースのMALDI TOF-MS IDBacパイプラインを使用

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

背景散乱を最小限に抑えた高分子X線結晶学用オールインワンサンプルホルダー

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

自動ワークステーションを用いた質量分析のためのプラズマサンプル調製

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

プロテオミクス施設提出のためのTMTサンプル調製とその後のデータ分析

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

オープンソースsmfBoxを使用して、正確で正確な単一分子フレット測定を行う

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...