Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

이 작품은 NIH 상 F32-HL149191YH에 의해 부분적으로 지원되었다; R00-HL144829 - EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 - MPL. 도 1, 도 2, 도 3 은 웹 기반 과학 일러스트 도구인 BioRender.com 사용하여 만들어집니다.

개발 된 파이썬 스크립트는 GitHub에 입금되었습니다 : https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. 스크립트의 복사본은 보충 파일 1에 제공됩니다. 최신 버전의 GitHub 리포지토리를 참조하십시오.
1. 실험 적 준비
<ol><li>프로토콜을 시작하기 전에 필요한 하드웨어를 확인합니다. 참고: OT-2 파이펫, 파이펫 팁, 4-in-1 튜브 랙 세트, 알루미늄 블록 세?...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

프로토콜 내의 중요한 단계 최상의 성능을 위해 OT-2와 호환되는 Opentrons 검증 된 labware, 모듈 및 소모품을 사용해야합니다. 사용자 지정 랩웨어는 Reference14에서 Opentrons의 지시에 따라 만들 수 있습니다. 처음으로 사용할 때 OT-2 데크, 파이펫 및 랩웨어를 교정해야 합니다. 또한 펩티드와 단백질 정화를 위한 구슬을 준비하기 위해 SP3 구슬 제조업체의 지침을 따르는 ?...

질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스는 생물학적 시료에 많은 단백질의 풍부를 동시에 측정하는 강력한 도구입니다. 생물 정보학 분석을 사용한 프로테오믹스 실험은 일상적으로 생체 마커를 식별하고 병리학 적 메커니즘을 뒷받침하는 관련 생물학적 복합체 및 경로를 발견하기 위해 일상적으로 사용됩니다. 높은 분석 특이성 및 잠재적 정량적 정확도를 갖춘 산탄총 프로테오믹스는 항체에 의존할 필요 없이 임상 샘플 분석을 위한 연구 시설 및 진단 실험실에서 채택될 수 있는 우수한 잠재력을 가지고 있습니다1,2.
산탄총 프로테오믹스 분석을 위한 단백질 샘플을 준비하려면 생물학적 샘플(예: 세포 및 조직)에서 추출한 단백질은 일반적으로 시료 단백질 농도, 단백질 감소 및 알킬레이션 측정, 펩타이드로효소 소화 를 측정하는 것을 포함하여 긴 프로토콜을 사용하여 처리되어야 합니다. 더욱이, 세제를 함유하는 일반적인 용해 완충제에서 추출된 단백질은 종종 세제가 트립신 소화를 방해하고 다운스트림 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 분석3의 성능을 현저히 저하시킬 수 있기 때문에 분석 전에 완충교환 또는 세제 제거의 추가 단계가 필요합니다. 펩타이드는 전형적으로 효소 소화에 따른 LC-MS/MS 호환 용매에서 더 탈염, 건조 및 재구성된다. 이러한 단백질 생화학 절차는 노동 집약적이고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 따라서 프로테오믹스 워크플로우의 처리량을 계속 제한하고 획득한 data4,5의 가변성에 기여합니다. 인간의 오류와 편견은 데이터 분산 및 재현성에 영향을 미치는 중요한 요인으로 인식되어 왔습니다6,7. 대량 분광샘플 준비 워크플로우에서 인간의 오류를 최소화하기 위해, 자동화된 파이펫팅 로봇 시스템은 산탄총 프로테오믹스및 표적 질량 분광분석에서 단백질 식별 및 정량화의 처리량 과 재현성을 개선하기 위해 활용되었으며, 이러한 발전은 연구 및 임상 설정에서 중요한 프로테오믹스 기술의 광범위한 채택을 계속하는 데 중요한 역할을 해왔습니다. 9,10,11,12,13. 그러나 대부분의 기존 프로토콜은 상당한 투자와 교육이 필요한 로봇 액체 처리 플랫폼을 활용하여 학업 환경이나 제한된 예산으로 많은 실험실에서 유틸리티를 제한합니다.
이 문서에서는 일반적인 산탄총 프로테오믹스 샘플 준비 워크플로우를 반 자동화하기 위해 저렴한 오픈 소스 로봇 액체 처리 시스템인 OT-2를 사용하는 프로토콜을 설명합니다. OT-2는 다른 많은 로봇 액체 처리 시스템보다 비용이 낮으며 작성 시 약 5,000 달러의 비용이 듭니다. 다른 모듈 과 labware의 가격을 고려할 때, 쓰기 의 시간에이 프로토콜에 실험을 설정하는 총 비용은 약 $10,000, 이는 더 비싼 옵션을 통해 실험실의 상당히 넓은 세트에 더 저렴 렌더링. OT-2는 파이썬 스크립트를 통한 오픈 소스 프로그래밍과 호환되며 사용자 정의 DIY 프로토콜 설계에서 뛰어난 유연성을 제공합니다. 사내 개발된 3개의 스크립트를 사용하여, 아래 프로토콜은 정형 단백질 표준(소 혈청 알부민)을 가진 OT-2 스테이션에서 전형적인 산탄총 프로테오믹스 샘플 준비 워크플로우를 실행한다. BSA) 및 정상적인 인간 심장 리자테의 복잡한 단백질 샘플(도 1). (1) BSA 샘플 및 (2) 복잡한 심장 용해 샘플을 처리하는 절차는 각각 프로토콜 섹션 1, 2, 5, 6 및 3, 4, 5, 6에 상세합니다. 세라-매그 카복틸레이트 변형 마그네틱 비즈는 단백질 및 펩타이드 샘플에서 세제 및 염을 제거하기 위해 단일 냄비 고체 상 강화 시료 제제(SP3)에 활용된다. 소 세럼 알부민과 인간의 심장 단백질의 트립틱 소화는 SP3 구슬에 의해 더 세척되고 LC-MS/MS 분석을 위해 제출됩니다. 질량 스펙트럼은 펩티드 및 단백질 식별을 위한 MaxQuant 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 당사가 수행한 대표적인 결과는 프로토콜이 벤치 시간을 절약하면서 우수한 기술적 계수(CV)를 달성하고 손다이에 열등하지 않은 것으로 나타났습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스 실험은 효소 단백질 소화 및 정리를 포함한 여러 샘플 준비 단계가 필요하며, 이는 상당한 시간의 벤치 노동을 수용하고 배치 대 배치 가변성의 원천을 제시할 수 있습니다. 파이펫팅 로봇을 통한 실험실 자동화는 수동 작업을 줄이고, 처리량을 최대화하며, 연구 재현성을 높일 수 있습니다. 여전히, 표준 자동화 스테이션의 가파른 시작 가격은 많은 학술 실험실에 대한 저렴한 합니다. 이 문서에서는 반자동 단백질 감소, 알킬레이션, 소화 및 정화 단계를 설정하는 지침을 포함하여 저렴한 오픈 소스 자동화 시스템(Opentrons OT-2)을 사용하여 프로테오믹스 샘플 준비 워크플로우에 대해 설명합니다. 뿐만 아니라 응용 프로그램 프로그래밍 인터페이스를 통해 OT-2 시스템을 프로그래밍하는 오픈 소스 파이썬 스크립트를 동반.

3개의 파이썬 스크립트는 OT-2 로봇과 호환되며, 단일 단백질 표준 소 혈청 알부민(기술적으로 복제n = 5 소화)과 세제 함유 인간 심장 리자테 샘플(n= 5 소화)을 사용하여 질량 분광법 프로테오믹스에 대한 샘플 준비를 수행하는 여기에 제공됩니다. 각 다이제스트 제품은 두 개의 펩타이드 정리 반응으로 분할됩니다. BSA 및 심장 샘플의 각 실행에서 확인된 펩티드 스펙트럼 일치(PSM), 펩티드 및 단백질...

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Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

상세한 프로토콜과 3개의 Python 스크립트는 광원 로봇 액체 처리 시스템을 운영하여 세제 제거, 단백질 소화 및 펩타이드 탈염 단계를 포함하는 대량 분광 실험에 대한 반자동 단백질 샘플 준비를 수행하기 위해 제공됩니다.

오픈 소스 실험실 로봇에 의해 자동화 된 산탄총 프로테오믹스 샘플 처리

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

이 프로토콜은 대량 분광 실험 전에 단백질 생화학 제제를 수행하기 위해 자동화를 사용하여 프로테오믹 연구에 대한 더 높은 처리량과 낮은 가변성을 허용합니다. 이 프로토콜은 더 많은 실험실에 저렴한 저비용 프로그래밍 가능한 액체 처리 시스템을 사용합니다. 우리는 추가 개발을 위해 수정 할 수있는 오픈 소스 Python 스크립트를 제공합니다.절차를 시연하는 것은 밀턴 아마야, 우리의 실험실에서 석사 학생이 될 것입니다. 시작하려면 noSP3_Digestion 엽니다. 텍스트 편집기의 py 스크립트를 지정하고 사용자 지정 여기만 지정 섹션에서 필요에 따라 실험별 변수를 지정합니다.그런 다음 Opentrons 앱을 열고 Opentrons 앱의 프로토콜 탭에 스크립트를 업로드합니다. 다음으로 파이썬 스크립트에 지정된 OT2 데크의 해당 위치에 필요한 랩웨어와 파이펫을 배치합니다. 그런 다음, 15밀리리터 플러스 50 밀리리터 튜브 홀더 상단을 가진 4-in-one 튜브 랙의 A1 웰에 암모늄 중탄산염 용액을 배치하고 2밀리리터 튜브 홀더 상단이 있는 4-in-1 튜브 랙의 A1 웰에 단백질 샘플을 배치합니다.A1에서 시작하여 수직으로 아래로 이동, 온도 모듈의 상단에 배치 알루미늄 블록의 우물에 2 밀리리터 단백질 저결합 튜브를 수동으로 배치합니다. 그런 다음 DTT 용액을 4-in-one 튜브 랙의 A6 웰에 2밀리리터 튜브 홀더 상단을 배치합니다. 로봇이 알루미늄 블록의 샘플 튜브에 중탄산염 버퍼의 적절한 부피를 전송하는 동안 관찰한다.그런 다음 로봇 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하는지 수동으로 확인하여 프로토콜을 다시 시작하기 전에 슬롯 4에 있는 2밀리리터 튜브 랙의 A6에 DTT가 로드되었는지 확인합니다. DTT 튜브의 위치를 확인하고 튜브 캡을 연 후 Opentrons 앱의 이력서 버튼을 클릭하여 계속합니다. 로봇이 DTT 솔루션의 10마이크로리터를 각 샘플에 잘 전송하고 5개의 혼합 라운드를 전달합니다.그런 다음 로봇 프로그램이 일시 중지되어 메시지를 표시하고 샘플 튜브에서 캡을 닫아야 합니다. 그런 다음 튜브의 캡을 수동으로 닫고 다시 시작하려면 클릭합니다. 로봇의 온도 모듈이 알루미늄 블록을 가열하기 시작하고 온도가 섭씨 55도에 도달하고 5 분 배양하여 샘플이 섭씨 55도까지 얻을 수 있도록 기다립니다.로봇은 DTT에 의한 단백질 감소를 허용하기 위해 30 분 동안이 온도를 유지합니다. 인큐베이션 중에 요오도아세타미드 용액을 준비하고 알루미늄 호일로 수동으로 감싸빛에 노출되지 않도록 하십시오. 인큐베이션 후 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 경고 메시지가 표시되면 샘플 튜브에서 캡을 열고 샘플 튜브를 제한 해제하고 다시 시작하려면 클릭하십시오.다음으로, 로봇의 프로그램이 경고 메시지와 함께 일시 중지되었는지 수동으로 확인하고, 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 4에 있는 2밀리리터 튜브 랙의 B6에 요오도아세타미드가 로드되었는지 확인합니다. 요오도아세타미드 튜브의 랙 위치를 확인하고 튜브 캡을 연 후, Resume를 클릭하고 로봇이 각 샘플 튜브에 요도아세타미드 용액의 10 마이크로리터를 전송하고 5개의 혼합 라운드를 전송하도록 합니다. 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 메시지가 표시되면 샘플 튜브의 캡을 닫고 샘플 튜브를 캡으로 덮은 다음 깨끗한 호일로 알루미늄 블록 전체를 덮고 Resume를 클릭하여 계속합니다.샘플이 섭씨 22도에서 30분 동안 배양될 때까지 기다린 후, 이오도아세아미드 인큐베이션이 완료되면 로봇의 온도 모듈이 비활성화되도록 하십시오. 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 경고 메시지가 표시되면 트립신이 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 4에 있는 2 밀리리터 튜브 랙의 C6에 로드되었는지 확인하고 튜브 캡이 열려있는 2 밀리리터 튜브 랙의 C6 웰에 트립신 솔루션을 배치하고 이력서를 클릭하여 계속하십시오. 그런 다음 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 경고 메시지가 표시되면 온도 모듈의 샘플 튜브에 캡을 열고 샘플 튜브를 뚜껑을 열고 다시 시작하려면 다시 시작합니다.로봇이 트립신 10마이크로리터를 각 샘플 튜브로 옮기고 5개의 혼합 라운드를 전송하는 동안 대기합니다. 하룻밤 동안 트립신 소화 후 벤치탑 미세 원심 분리기를 사용하여 샘플을 잠시 회전시키고 샘플을 자기 튜브 랙에 놓습니다. 2분 후, 피펫으로 상체를 새로운 단백질 저결합 미세원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮기고 샘플을 냉장고에 보관합니다.다음으로 SP3_peptide_cleanup 엽니다. 텍스트 편집기의 py Python 스크립트를 지정하고 사용자 지정 여기만 하는 섹션에서 필요에 따라 실험 변수를 지정합니다. 그런 다음 Opentrons 앱의 프로토콜 탭에 스크립트를 업로드합니다.파이썬 스크립트에 지정된 OT2 데크의 해당 위치에 필요한 랩웨어와 파이펫을 배치하고 자기 모듈이 켜져 있고 로봇에 연결되어 있는지 확인합니다. 마그네틱 모듈 상단에 새로운 2밀리리터, 96웰 의 깊은 웰 플레이트를 놓습니다. 다음으로, 소화된 샘플을 A1에서 시작하여 세로로 아래로 이동하는 2밀리리터 튜브 랙에 놓습니다.그런 다음, 로봇이 소화된 시료의 55마이크로리터를 자기 모듈의 깊은 우물판의 우물로 전송합니다. 로봇 프로토콜이 일시 중지되고 메시지를 표시하는지 확인하고, 준비된 구슬이 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 4에 있는 2밀리리터 튜브 랙의 A6에 로드되었는지 확인합니다. 그런 다음, 소용돌이와 잠시 미니 벤치 탑 원심 분리기에서 SP3 구슬을 회전하고 캡을 열고 2 밀리리터 튜브 랙의 A6 우물에 배치합니다.로봇 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하는지 확인하면 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 5에 위치한 15 밀리리터 의 A4에 80 %의 에탄올이 로드되었는지 확인하십시오. 그런 다음 튜브 랙에 A4에 80% 에탄올 용액을 잘 배치하고 Resume를 클릭하여 계속합니다. 로봇이 파이프팅 속도를 느리게 바꾸고, 각 우물에서 상퍼를 흡인하고, 폐튜브에 분배하는 동안 관찰한다.로봇이 파이펫팅 속도를 다시 기본값으로 변경하고 자기 모듈을 분리할 때까지 기다립니다. 로봇 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하면, 심모늄 중탄산 튜브에 캡을 열고, 암모늄 중탄산염 용액의 캡을 열고, 이력서를 클릭하여 계속합니다. 로봇이 자기 모듈을 분리하는 동안 대기, 각 우물에 암모늄 중탄산염 버퍼의 250 마이크로 리터를 전송하고, 즉시 10 시간 동안 혼합.그런 다음, 로봇이 파이프팅 속도를 느리게 변경하는 동안 관찰하고, 각 우물에서 폐기물 튜브로 상수체를 전송합니다. 로봇이 각 우물에 암모늄 중탄산염 버퍼의 100 마이크로 리터를 전송하고 즉시 10 번 혼합 될 때까지 기다립니다. 로봇 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하는지 확인하고 프로토콜을 다시 시작하기 전에 새로운 수집 튜브가 2밀리리터 알루미늄 블록에 배치되었는지 확인합니다.그런 다음, 마지막 샘플 튜브 직후 알루미늄 블록에 저단백질 보존 마이크로센심분리기 튜브의 새로운 세트를 배치하고, 계속하려면 Resume를 클릭합니다. 로봇이 심모늄 중탄산염 버퍼의 각 샘플을 새로운 2 밀리리터 튜브로 전송하는 동안 대기합니다. 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하면 트립신이 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 4에 있는 2 밀리리터 튜브 랙의 C6에 로드되었는지 확인하고 튜브 캡이 열려있는 2 밀리리터 튜브 랙의 C6 웰에 트립신 솔루션을 배치하고 이력서를 클릭하여 계속합니다.프로그램이 실행완료되면, 파라핀 필름으로 샘플 튜브 캡을 감싸고, 모든 샘플을 온도 제어 믹서로 옮기고, 1, 000 RPM 흔들림으로 16~20시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. BSA 샘플을 사용하면 728펩타이드 스펙트럼 일치 및 65펩타이드의 배지가 각각 5.2%와 3.2%의 변이계로 확인되었다. 복잡한 심장 샘플을 통해 9, 526 펩티드 스펙트럼 일치, 7, 558 펩타이드 및 1, 336 단백질의 배지가 각각 7.6%5.9%와 3.6%의 변이계로 10런에서 확인되었다.펩티드 정량화의 가변성을 결정하기 위해, 추출된 이온 크로마토그램 강도의 변이계는 독특한 단백질을 매핑하는 10개의 펩타이드에 대해 계산되었다. 인간 대 로봇 실험 결과의 가변이 BCA 분석과 비교했을 때, 로봇 BCA 분석의 평균 계수는 인간 매뉴얼 BCA 분석보다 낮았다. 이 프로토콜은 각 샘플을 처리하는 벤치 시간을 줄입니다.그것은 우리가 다중 약물 치료 사이 세포주 패널에 있는 proteomics 다름을 탐구하는 쪽을 포장합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

연구

생화학

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

산탄 프로테오믹스 자세하게 특성화 LERLIC-MS / MS 및 글루타민 정량 아스파라긴 탈 아미드

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

단백질 지 방화 Immunoblotting 또는 단백질의 분석에 대 한 애기에서 엽록체 하위 구획의 준비

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

미생물 단백질 및 특수 대사 산물 데이터 분석을 위한 오픈 소스 MALDI TOF-MS IDBac 파이프라인 사용

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

최소한의 배경 산란을 갖춘 거대 분자 X선 결정학을 위한 올인원 샘플 홀더

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

자동화된 워크스테이션을 사용한 질량 분석법을 위한 플라즈마 시료 준비

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

오픈 소스 smfBox를 사용하여 정확하고 정확한 단일 분자 FRET 측정

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...