Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH-priser F32-HL149191 til YH; R00-HL144829 til EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 til MPL. Figur 1, figur 2, figur 3 er opprettet ved hjelp av et nettbasert vitenskapsillustrasjonsverktøy, BioRender.com.

De utviklede Python-skriptene er deponert på GitHub på: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. En kopi av skriptene er gitt i Tilleggsfil 1. Se GitHub-repositoriet for de nyeste versjonene.
1. Eksperimentelle preparater
<ol><li>Kontroller den nødvendige maskinvaren før du starter protokollen. MERK: Følgende maskinvarekomponenter kreves: OT-2 pipetter, pipettespisser, 4-i-1 rørstativsett, aluminiumsblokksett, magnetisk modul, ...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions.">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li><li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+reproducibility,+human+error,+and+public+policy.">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li><li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

Kritiske trinn i protokollen For best ytelse bør Opentrons-verifisert labware, moduler og forbruksvarer som er kompatible med OT-2 brukes. Tilpasset labware kan opprettes etter Opentrons instruksjon på Reference14. Sørg for å kalibrere OT-2-decket, pipettene og labware når de brukes for første gang. Det er også viktig å følge retningslinjer fra SP3 perler produsent for å forberede perler for peptid og protein opprydding. Spesielt under perle- og peptidbindingsreaksjon...

Massespektrometribasert hagleproteomikk er et kraftig verktøy for å måle overflod av mange proteiner i biologiske prøver samtidig. Proteomiske eksperimenter med bioinformatikkanalyse brukes rutinemessig til å identifisere biomarkører og oppdage tilhørende biologiske komplekser og veier som ligger til grunn for patologiske mekanismer. Med sin høye analyttspifisitet og potensielle kvantitative nøyaktighet har hagleproteomikk også utmerket potensial til å bli vedtatt av forskningsfasiliteter og diagnostiske laboratorier for klinisk prøveanalyse uten å måtte stole på antistoffer1,2.
For å forberede proteinprøver for hagleproteomikkanalyse, må proteiner som ekstraheres fra biologiske prøver (f.eks. celler og vev) vanligvis først behandles ved hjelp av lange protokoller, inkludert måling av prøveproteinkonsentrasjon, proteinreduksjon og alkylering og enzymatisk fordøyelse i peptider. Videre krever proteiner ekstrahert i vanlige lysisbuffere som inneholder vaskemidler ofte ytterligere trinn for bufferutveksling eller fjerning av vaskemiddel før analyse fordi vaskemiddel kan forstyrre trypsin fordøyelsen og betydelig forringe ytelsen til nedstrøms væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) analyse3. Peptider blir vanligvis ytterligere desalted, tørket og rekonstituert i LC-MS/MS-kompatible løsningsmidler etter enzymatisk fordøyelse. Disse proteinbiokjemiprosedyrene kan være arbeidskrevende og tidkrevende. Dermed fortsetter de å begrense gjennomstrømningen av proteomiske arbeidsflyter og bidra til variasjonen av innsamlede data4,5. Menneskelige feil og skjevheter har blitt anerkjent som avgjørende faktorer som påvirker datavariasjon og reproduserbarhet6,7. For å minimere menneskelige feil i arbeidsflyter for prøvepreparering av massespektrometri, har automatiserte pipetteringsrobotsystemer blitt brukt til å forbedre gjennomstrømningen og reproduserbarheten av proteinidentifikasjon og kvantifisering fra hagleproteomikk og målrettet massespektrometrianalyse, der slike fremskritt har blitt hyllet som avgjørende for å fortsette presset for utbredt bruk av proteomikkteknologier i kritisk forskning og kliniske innstillinger8, 9,10,11,12,13. Imidlertid bruker de fleste eksisterende protokoller robotiserte væskehåndteringsplattformer som krever betydelige investeringer og opplæring, begrenser deres nytte i mange laboratorier i fagmiljøet eller på annen måte med et begrenset budsjett.
Denne artikkelen beskriver en protokoll som bruker et rimelig robotbasert væskehåndteringssystem med åpen kildekode, OT-2, for å halvautomatere en typisk arbeidsflyt for klargjøring av hagleproteomikk. OT-2 har en lavere kostnad enn mange andre robotiserte væskehåndteringssystemer, og koster i skrivende stund omtrent $ 5,000 amerikanske dollar. Når du tar hensyn til prisene på forskjellige moduler og labware, er den totale kostnaden for å sette opp eksperimenter i denne protokollen i skrivende stund rundt $ 10,000, noe som gjør det rimeligere for et betydelig bredere sett med laboratorier over dyrere alternativer. OT-2 er kompatibel med åpen kildekode-programmering gjennom Python-skript og gir stor fleksibilitet i brukerdefinert DIY-protokolldesign. Ved hjelp av tre interne utviklede skript, protokollene nedenfor dekke utføre en typisk hagle proteomics prøve forberedelse arbeidsflyt på OT-2 stasjonen med en arketypisk protein standard (bovine serum albumin; BSA) og en kompleks proteinprøve av et normalt menneskehjertelys (figur 1). Prosedyrene for behandling (1) en BSA-prøve og (2) en kompleks hjertelysprøve er beskrevet i protokolldelene henholdsvis 1, 2, 5, 6 og 3, 4, 5, 6. Sera-Mag karboksylatmodifiserte magnetiske perler brukes i en-pot solid-fase-forbedret prøvepreparering (SP3) for å fjerne vaskemidler og salter i protein- og peptidprøvene. Tryptiske fordøyer fra bovint serumalbumin og humane hjerteproteiner rengjøres ytterligere av SP3-perler og sendes inn for LC-MS /MS-analyse. Massespektra analyseres deretter ved hjelp av MaxQuant-programvaren for peptid og proteinidentifikasjon. Representative resultater utført av oss viser at protokollen oppnår gode tekniske variasjonskoeffisienter (CV) samtidig som benktiden spares og ikke er dårligere enn håndfordøyd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

Massespektrometribaserte hagleproteomiske eksperimenter krever flere prøveprepareringstrinn, inkludert enzymatisk proteinfordøyetid og opprydding, som kan ta opp betydelige persontimer med benkarbeid og presentere en kilde til batch-til-batch-variasjon. Laboratorieautomatisering med pipetteringsroboter kan redusere manuelt arbeid, maksimere gjennomstrømningen og øke forskningens reproduserbarhet. Likevel gjør de bratte startprisene på standard automatiseringsstasjoner dem uoverkommelige for mange akademiske laboratorier. Denne artikkelen beskriver en arbeidsflyt for proteomikkprøveforberedelse ved hjelp av et rimelig automatiseringssystem med åpen kildekode (Opentrons OT-2), inkludert instruksjoner for å sette opp halvautomatisk proteinreduksjon, alkylering, fordøyelse og oppryddingstrinn; i tillegg til å følge open source Python-skript for å programmere OT-2-systemet gjennom applikasjonsprogrammeringsgrensesnittet.

Tre Python-skript er gitt her som er kompatible med OT-2-roboten, og som utfører prøvepreparering for massespektrometriproteomikk med et enkelt proteinstandard bovint serumalbumin (teknisk replikerer n = 5 fordøyelser) og en vaskemiddelholdig menneskelig hjertelysprøve (n = 5 fordøyelser). Hvert sammendragsprodukt er partisjonert i to peptidoppryddingsreaksjoner. Antall identifiserte peptidspektrumsamsvar (PSMs), peptider og proteiner i hver kjøring av BSA og hjerteprøver er vist i figur 4</st...

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Detaljert protokoll og tre Python-skript er gitt for å betjene et åpen kildekode robotisert væskehåndteringssystem for å utføre halvautomatisk proteinprøvepreparering for massespektrometriforsøk, som dekker fjerning av vaskemiddel, protein fordøyelse og peptidavsaltingstrinn.

Hagle proteomics prøvebehandling automatisert av en åpen kildekode lab robot

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Denne protokollen bruker automatisering for å utføre proteinbiokjemipreparater før massespektrometrieksperimenter, noe som gir høyere gjennomstrømning og lavere variasjon for proteomiske studier. Denne protokollen bruker et rimelig, programmerbart væskehåndteringssystem som er rimelig for flere laboratorier. Vi tilbyr open source Python skript som kan endres for videre utvikling.Å demonstrere prosedyren vil være Milton Amaya, en masterstudent i vårt laboratorium. Åpne noSP3_Digestion for å begynne. py-skriptet i tekstredigeringsprogrammet, og angi de eksperimentspesifikke variablene etter behov i delen TILPASS BARE HER.Deretter åpner du Opentrons-appen og laster opp skriptet til Protokoll-fanen i Opentrons-appen. Deretter plasserer du det nødvendige labware og pipetter på tilsvarende sted i OT2-decket som er angitt i Python-skriptet. Plasser deretter ammoniumbikarbonatløsningen i A1-brønnen på fire-i-ett-rørstativet med 15 milliliter pluss 50 milliliter rørholder topp og plasser proteinprøven i A1-brønnen på fire-i-ett rørstativet med en to milliliter rørholder topp.Plasser to milliliterprotein lavbindingsrør manuelt i brønnene i aluminiumsblokken plassert på toppen av temperaturmodulen, fra A1 og flytt ned vertikalt. Plasser deretter DTT-løsningen i A6-brønnen på fire-i-ett-rørstativet med en to milliliter rørholder topp. Vær oppmerksom mens roboten overfører et passende volum av ammoniumbikarbonatbufferen til prøverørene i aluminiumsblokken.Kontroller deretter manuelt at robotprogrammet er satt på pause og viser meldingen, Forsikre deg om at DTT er lastet inn i A6 på det to milliliter rørstativet som ligger i spor fire før du gjenopptar protokollen. Etter å ha bekreftet plasseringen av DTT-røret og åpnet rørdekselet, klikker du på Fortsett-knappen i Opentrons-appen for å fortsette. Forsikre deg om at roboten overfører 10 mikroliter av DTT-løsningen til hver prøvebrønn, etterfulgt av fem blanderunder.Kontroller deretter at robotprogrammet er satt på pause og viser meldingen, Sørg for å lukke hettene på prøverørene. Lukk deretter hettene på rørene manuelt og klikk på Fortsett for å fortsette. Vent til robotens temperaturmodul begynner å varme opp aluminiumsblokken og temperaturen når 55 grader Celsius, etterfulgt av en fem minutters inkubasjon for å la prøvene komme til 55 grader Celsius.Roboten vil deretter holde denne temperaturen i 30 minutter for å tillate proteinreduksjon med DTT. Under inkubasjonen, lag iodoacetamidoppløsning og pakk den manuelt med aluminiumsfolie for å unngå eksponering for lys. Etter inkubasjonen, når robotens program er satt på pause og viser advarselsmeldingen, Sørg for å åpne hetter på prøverør, løsne prøverørene og klikk på Fortsett for å fortsette.Deretter må du manuelt kontrollere at robotens program er satt på pause med advarselen, Forsikre deg om at iodoacetamid er lastet inn i B6 av det to milliliter rørstativet som ligger i spor fire før du gjenopptar protokollen. Etter å ha bekreftet rackplasseringen til iodoacetamidrøret og åpnet rørhetten, klikker du på Fortsett og sørger for at roboten overfører 10 mikroliter av iodoacetamidløsningen til hvert prøverør, etterfulgt av fem blanderunder. Når robotens program er satt på pause og viser meldingen, Lukk hettene på prøverørene, hette prøverørene og dekk dem med folie, dekk deretter hele aluminiumsblokken med et rent stykke folie og klikk på Fortsett for å fortsette.Vent til prøvene inkuberes ved 22 grader Celsius i 30 minutter, og sørg for at robotens temperaturmodul deaktiveres når iodoacetamid-inkubasjonen er fullført. Når robotens program er satt på pause og viser advarselsmeldingen, Må du kontrollere at trypsin er lastet inn i C6 på det to milliliter rørstativet som ligger i spor fire før du gjenopptar protokollen, plasser trypsin-løsningen i C6-brønnen på det to milliliter rørstativet med rørdekselet åpent, og klikk på Fortsett for å fortsette. Deretter, når robotens program er satt på pause og viser advarselsmeldingen, Åpne hetter på prøverør på temperaturmodulen, fjern avbelyste prøverørene og klikk på Fortsett for å fortsette.Standby mens roboten overfører 10 mikroliter trypsin til hvert prøverør, etterfulgt av fem blanderunder. Etter nattlig trypsin fordøyelse, spinn kort prøvene ved hjelp av en stasjonær mikrosenter og plasser prøvene på et magnetisk rørstativ. Etter to minutter, overfør supernatanten forsiktig med en pipette til et nytt sett med protein lavt bindende mikrosenterrør, og hold prøvene i kjøleskap.Deretter åpner du SP3_peptide_cleanup. py Python-skriptet i et tekstredigeringsprogram, og angi eksperimentvariablene etter behov i delen TILPASS BARE HER. Deretter laster du opp skriptet til Protokoll-fanen i Opentrons-appen.Plasser de nødvendige labware og pipetter på tilsvarende sted i OT2-decket som er angitt i Python-skriptet, og sørg for at den magnetiske modulen er slått på og koblet til roboten. Plasser en ny, to milliliter, 96-brønns dyp brønnplate på toppen av magnetmodulen. Deretter plasserer du de fordøyde prøvene i stativet med to milliliter fra A1 og beveger seg vertikalt ned.Deretter må du sørge for at roboten overfører 55 mikroliter av de fordøyde prøvene til brønnene i de dype brønnplatene på magnetmodulen. Kontroller at robotprotokollen er satt på pause og viser meldingen, Kontroller at klargjorte perler er lastet inn i A6 på stativet med to milliliterrør plassert i spor fire før du gjenopptar protokollen. Deretter virvel og kort spinn SP3 perler i en mini-benk topp sentrifuge og plassere dem i A6 brønnen på to milliliter rør rack med hetten åpen.Kontroller at robotprogrammet er satt på pause og viser meldingen, Kontroller at 80 % etanol er lastet inn i A4 på 15 milliliter pluss 50 milliliter rørstativ plassert i spor fem før du gjenopptar protokollen. Plasser deretter en 80% etanolløsning i A4-brønnen i rørstativet og klikk på Fortsett for å fortsette. Vær oppmerksom mens roboten endrer pipetteringshastigheten for å bremse, aspirerer supernatanten fra hver brønn og dispenserer den inn i avfallsrøret.Vent til roboten endrer pipetteringshastigheten tilbake til standard og kobler fra magnetmodulen. Når robotprogrammet er satt på pause og viser meldingen, Åpne hetten på ammoniumbikarbonatrøret, åpne hetten på ammoniumbikarbonatløsningen, og klikk deretter på Fortsett for å fortsette. Standby mens roboten kobler ut den magnetiske modulen, overfører 250 mikroliter av ammoniumbikarbonatbufferen til hver brønn, og blandes umiddelbart i 10 ganger.Følg deretter mens roboten endrer pipetteringshastigheten til å avta, og overfører supernatanten fra hver brønn til avfallsrøret. Vent til roboten overfører 100 mikroliter av ammoniumbikarbonatbufferen til hver brønn og blandes umiddelbart i 10 ganger. Kontroller at robotprogrammet er satt på pause og viser meldingen, Forsikre deg om at nye oppsamlingsrør er plassert i to milliliter aluminiumsblokken før du gjenopptar protokollen.Plasser deretter et nytt sett med mikrocentrifugerør med lavt proteinretensjon i aluminiumsblokken umiddelbart etter det siste prøverøret som først var i blokken, og klikk på Fortsett for å fortsette. Standby mens roboten overfører hver prøve i ammoniumbikarbonatbufferen til de nye to milliliterrørene. Når robotens program er satt på pause og viser meldingen, Forsikre deg om at trypsin er lastet inn i C6 på det to milliliter rørstativet som ligger i spor fire før du gjenopptar protokollen, plasser trypsinløsningen i C6-brønnen på det to milliliter rørstativet med rørdekselet åpent, og klikk på Fortsett for å fortsette.Når programmet er ferdig med å kjøre, pakk prøverørhettene med parafinfilm, overfør alle prøvene til en temperaturkontrollert mikser og inkuber ved 37 grader Celsius i 16 til 20 timer med 1000 RPM risting. Med BSA-prøven ble et medium på 728 peptidspektrumkamper og 65 peptider identifisert, med henholdsvis 5,2% og 3,2% variasjonskoeffisienter. Med en kompleks hjerteprøve ble et medium på 9 526 peptidspektrumkamper, 7 558 peptider og 1336 proteiner identifisert i 10 løp med henholdsvis 7,6% 5,9% og 3,6% variasjonskoeffisienter.For å bestemme variasjonen i peptid kvantifisering, ble koeffisientene for variasjon av de ekstraherte ionkromatogramintensitetene beregnet for 10 peptider som kartlegger til et unikt protein. Når variasjonene i eksperimentelle resultater fra menneske kontra robot i måling av proteinkonsentrasjon ble ytterligere sammenlignet med BCA-analysen, var den gjennomsnittlige variasjonskoeffisienten til robotens BCA-analyse lavere enn den menneskelige manuelle BCA-analysen. Denne protokollen reduserer benketiden for behandling av hver prøve.Det baner vei for oss å utforske proteomiske forskjeller i et panel av cellelinjer mellom flere narkotikabehandlinger.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatisert Acoustic Doserings for serie Fortynning av Peptide agonister i Potens Fastsettelse Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS for inngående karakterisering og kvantifisering av glutamin og asparagin Deamidering i hagle Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Utarbeidelse av Chloroplast sub deler fra Arabidopsis for analyse av Protein lokalisering av Immunoblotting eller Proteomikk

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Ved hjelp av Open-Source MALDI TOF-MS IDBac rørledning for analyse av mikrobiell protein og spesialiserte metabolitten data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En alt-i-ett sample holder for makro molekylære X-ray Crystallography med minimal bakgrunn spredning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

En plasmaprøve forberedelse for massespektrometri ved hjelp av en automatisert arbeidsstasjon

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse for proteomics facility innsending og påfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Foreta presise og nøyaktige FRET-målinger med ett molekyl ved hjelp av åpen kildekode-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...