Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado em parte pelos prêmios NIH F32-HL149191 para YH; R00-HL144829 para EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 para MPL. Figura 1, Figura 2, Figura 3 são criadas com o auxílio de uma ferramenta de ilustração científica baseada na Web, BioRender.com.

Os scripts Python desenvolvidos foram depositados no GitHub em: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Uma cópia dos scripts é dada no Arquivo Suplementar 1. Consulte o repositório do GitHub para obter as versões mais recentes.
1. Preparações experimentais
<ol><li>Verifique o hardware necessário antes de iniciar o protocolo. NOTA: Os seguintes componentes de hardware são necessários: pipetas OT-2, pontas de pipeta, conjunt...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions.">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li><li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+reproducibility,+human+error,+and+public+policy.">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li><li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

Passos críticos dentro do protocolo Para o melhor desempenho, devem ser utilizados labware, módulos e consumíveis compatíveis com OT-2. O labware personalizado pode ser criado seguindo as instruções do Opentrons no Reference14. Certifique-se de calibrar o deck OT-2, pipetas e labware quando usado pela primeira vez. Também é fundamental seguir as diretrizes do fabricante de contas SP3 para preparar contas para peptídeos e limpeza de proteínas. Notavelmente, durante a r...

A proteômica da espingarda baseada em espectrometria em massa é uma ferramenta poderosa para medir a abundância de muitas proteínas em amostras biológicas simultaneamente. Experimentos proteômicos com análise bioinformática são rotineiramente empregados para identificar biomarcadores e descobrir complexos biológicos associados e caminhos que sustentam mecanismos patológicos. Com sua alta especificidade de analito e potencial precisão quantitativa, a proteômica da espingarda também tem excelente potencial para ser adotada por instalações de pesquisa e laboratórios de diagnóstico para análise de amostras clínicas sem a necessidade de contar com anticorpos1,2.
Para preparar amostras proteicas para análise de proteômica de espingarda, proteínas extraídas de amostras biológicas (por exemplo, células e tecidos) normalmente precisam ser processadas usando protocolos longos, incluindo medir a concentração de proteínas amostrais, redução de proteínas e alquilação, e digestão enzimática em peptídeos. Além disso, proteínas extraídas em tampões de lise comuns contendo detergentes muitas vezes requerem etapas adicionais de troca de buffer ou remoção de detergente antes da análise, pois o detergente pode interferir na digestão de trippsina e degradar significativamente o desempenho da análise de espectrometria de massa líquida a jusante (LC-MS/MS). Os peptídeos são tipicamente mais dessacados, secos e reconstituídos em solventes compatíveis com LC-MS/MS após a digestão enzimática. Esses procedimentos de bioquímica proteica podem ser intensivos em mão-de-obra e demorados. Assim, continuam a limitar o throughput de fluxos de trabalho proteômicos e contribuem para a variabilidade dos dados adquiridos4,5. Erros e vieses humanos têm sido reconhecidos como fatores cruciais que afetam a variância e a reprodutibilidade dos dados6,7. Para minimizar os erros humanos nos fluxos de trabalho de preparação de amostras de espectrometria de massa, sistemas robóticos automatizados de pipetação têm sido utilizados para melhorar o throughput e a reprodutibilidade da identificação e quantificação de proteínas a partir de proteômica de espingarda e análise de espectrometria de massa direcionada, onde tais avanços têm sido saudados como instrumentais para a continuação da adoção generalizada de tecnologias de proteômica em pesquisas críticas e configurações clínicas8, 9,10,11,12,13. No entanto, a maioria dos protocolos existentes utiliza plataformas robóticas de manuseio de líquidos que requerem investimento e treinamento substanciais, limitando sua utilidade em muitos laboratórios no ambiente acadêmico ou de outra forma com um orçamento limitado.
Este artigo descreve um protocolo que utiliza um sistema de manuseio líquido robótico de baixo custo e de código aberto, o OT-2, para semi-automatizar um típico fluxo de trabalho de preparação de amostras de proteômica de espingarda. O OT-2 tem um custo menor do que muitos outros sistemas robóticos de manuseio líquido, e no momento da escrita, custa aproximadamente US $ 5.000 dólares americanos. Ao considerar os preços de diferentes módulos e labware, o custo total para configurar experimentos neste protocolo no momento da escrita é de cerca de US $ 10.000, o que o torna mais acessível a um conjunto consideravelmente mais amplo de laboratórios sobre opções mais caras. O OT-2 é compatível com a programação de código aberto através de scripts Python e oferece grandes flexibilidades no design do protocolo DIY definido pelo usuário. Usando três scripts desenvolvidos internamente, os protocolos abaixo cobrem a execução de um fluxo de trabalho típico de preparação de amostras de proteômica de espingarda na estação OT-2 com um padrão de proteína arquetípico (albumina de soro bovino; BSA) e uma amostra de proteína complexa de um liseto cardíaco humano normal (Figura 1). Os procedimentos de processamento (1) uma amostra de BSA e (2) uma amostra complexa de liseto cardíaco estão detalhados nas seções de Protocolo 1, 2, 5, 6 e 3, 4, 5, 6, respectivamente. As contas magnéticas modificadas por carboxilato sera-mag são utilizadas na preparação de amostras aprimoradas em fase sólida (SP3) para remover detergentes e sais nas amostras de proteína e peptídeo. Digestões trippticas da albumina de soro bovino e proteínas cardíacas humanas são ainda mais limpas por contas SP3 e submetidas à análise LC-MS/MS. Os espectros de massa são então analisados usando o software MaxQuant para identificação de peptídeos e proteínas. Os resultados representativos realizados por nós mostram que o protocolo alcança excelentes coeficientes técnicos de variação (CV) enquanto economiza tempo de bancada e não é inferior ao digestor manual.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

Experimentos de proteômica de espingarda à base de espectrometria em massa requerem múltiplas etapas de preparação de amostras, incluindo digestão e limpeza de proteínas enzimáticas, que podem ocupar horas significativas de trabalho de banco e apresentar uma fonte de variabilidade em lote. A automação de laboratório com robôs de pipetting pode reduzir o trabalho manual, maximizar o throughput e aumentar a reprodutibilidade da pesquisa. Ainda assim, os preços iniciais acentuados das estações de automação padrão as tornam inacessíveis para muitos laboratórios acadêmicos. Este artigo descreve um fluxo de trabalho de preparação de amostras de proteômica usando um sistema de automação de código aberto acessível (The Opentrons OT-2), incluindo instruções para a configuração de redução de proteínas semi-automatizadas, alquilação, digestão e etapas de limpeza; além de acompanhar scripts Python de código aberto para programar o sistema OT-2 através de sua interface de programação de aplicativos.

São fornecidos três scripts Python aqui compatíveis com o robô OT-2, e que realizam a preparação da amostra para proteômica de espectrometria de massa com uma única proteína padrão de soro bovino albumina (réplicas técnicas n = 5 digestões) e uma amostra de liseto cardíaco humano contendo detergente (n = 5 digestões). Cada produto digesto é particionado em duas reações de limpeza de peptídeos. O número de correspondências identificadas de espectro de peptídeos (PSMs), peptídeos e proteínas em cada...

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Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Protocolo detalhado e três scripts Python são fornecidos para operar um sistema de manuseio líquido robótico de código aberto para realizar a preparação semi-automatizada de amostras de proteína para experimentos de espectrometria de massa, cobrindo a remoção de detergentes, digestão de proteínas e etapas de desalização de peptídeos.

Processamento de amostras de proteômica de espingarda automatizada por um robô de laboratório de código aberto

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Este protocolo utiliza a automação para realizar preparações de bioquímica proteica antes de experimentos de espectrometria de massa, permitindo maior rendimento e menor variabilidade para estudos proteômicos. Este protocolo usa um sistema de manuseio líquido programável de baixo custo que é acessível a mais laboratórios. Fornecemos scripts Python de código aberto que podem ser modificados para desenvolvimento posterior.Demonstrando o procedimento estará Milton Amaya, um estudante de mestrado em nosso laboratório. Para começar, abra o noSP3_Digestion. py script no editor de texto e especifique as variáveis específicas do experimento conforme necessário na seção PERSONALIZAR AQUI SOMENTE.Em seguida, abra o aplicativo Opentrons e carregue o script para a guia Protocolo no aplicativo Opentrons. Em seguida, coloque os labware e pipetas necessários no local correspondente no deck OT2 especificado no script Python. Em seguida, coloque a solução de bicarbonato de amônio no poço A1 do rack de tubo quatro em um com o suporte de tubo de 15 mililitros mais 50 mililitros e coloque a amostra de proteína no poço A1 do rack de tubo quatro em um com um topo superior de porta-tubos de dois mililitros.Coloque manualmente tubos de baixa ligação de proteína de dois mililitros nos poços do bloco de alumínio colocados em cima do módulo de temperatura, começando a partir de A1 e movendo-se verticalmente para baixo. Em seguida, coloque a solução DTT no poço A6 do rack de tubo quatro em um com um topo de tubo de dois mililitros. Observe enquanto o robô transfere um volume apropriado do tampão de bicarbonato de amônio para os tubos de amostra no bloco de alumínio.Em seguida, verifique manualmente se o programa do robô está pausado e exibe a mensagem, certifique-se de que o DTT tenha sido carregado em A6 do rack de tubo de dois mililitros localizado no slot quatro antes de retomar o protocolo. Depois de confirmar a localização do tubo DTT e abrir a tampa do tubo, clique no botão Retomar no aplicativo Opentrons para continuar. Certifique-se de que o robô transfira 10 microliters da solução DTT para cada amostra bem, seguido por cinco rodadas de mistura.Em seguida, verifique se o programa robô está pausado e exibe a mensagem, Certifique-se de fechar tampas em tubos de amostra. Em seguida, feche manualmente as tampas dos tubos e clique em Retomar para continuar. Espere até que o módulo de temperatura do robô comece a aquecer o bloco de alumínio e a temperatura atinja 55 graus Celsius, seguido de uma incubação de cinco minutos para permitir que as amostras cheguem a 55 graus Celsius.O robô então manterá esta temperatura por 30 minutos para permitir a redução de proteínas por DTT. Durante a incubação, prepare a solução de iodoacetamida e enrole-a manualmente com papel alumínio para evitar exposição à luz. Após a incubação, quando o programa do robô é pausado e exibe a mensagem de aviso, Certifique-se de abrir tampas em tubos de amostra, deslecotar os tubos de amostra e clicar em Retomar para continuar.Em seguida, verifique manualmente se o programa do robô está pausado com a mensagem de aviso, Certifique-se de que a iodoacetamida tenha sido carregada em B6 do rack de tubo de dois mililitros localizado no slot quatro antes de retomar o protocolo. Depois de confirmar a localização do rack do tubo de iodoacetamida e abrir a tampa do tubo, clique em Retomar e certifique-se de que o robô transfira 10 microliters da solução de iodoacetamida para cada tubo de amostra, seguido por cinco rodadas de mistura. Quando o programa do robô é pausado e exibe a mensagem, feche as tampas nos tubos de amostra, cubra os tubos de amostra e cubra-os com papel alumínio, em seguida, cubra todo o bloco de alumínio com um pedaço limpo de papel alumínio e clique em Retomar para continuar.Aguarde até que as amostras sejam incubadas a 22 graus Celsius por 30 minutos e certifique-se de que o módulo de temperatura do robô desativa após a conclusão da incubação da iodoacetamida. Quando o programa do robô é pausado e exibe a mensagem de aviso, certifique-se de que a trippsina tenha sido carregada em C6 do rack de tubo de dois mililitros localizado na ranhura quatro antes de retomar o protocolo, coloque a solução de trippsina no poço C6 do rack de tubo de dois mililitros com a tampa do tubo aberta e clique em Retomar para continuar. Em seguida, quando o programa do robô é pausado e exibe a mensagem de aviso, abra as tampas nos tubos de amostra no módulo de temperatura, desleule os tubos de amostra e clique em Retomar para continuar.Espera enquanto o robô transfere 10 microliters de trippsina para cada tubo de amostra, seguido por cinco rodadas de mistura. Após a digestão da trippsina durante a noite, gire brevemente as amostras usando um microcentrifuuge benchtop e coloque as amostras em um rack de tubo magnético. Após dois minutos, transfira o supernatante cuidadosamente com uma pipeta para um novo conjunto de tubos de microcentrifuge de baixa ligação proteica, e mantenha as amostras em uma geladeira.Em seguida, abra o SP3_peptide_cleanup. py Python script em um editor de texto e especifique as variáveis de experimento conforme necessário na seção PERSONALIZAR AQUI SOMENTE. Em seguida, carregue o script na guia Protocolo no aplicativo Opentrons.Coloque os labware e pipetas necessários no local correspondente no deck OT2 especificado no script Python e certifique-se de que o módulo magnético esteja ligado e conectado ao robô. Coloque uma nova placa de dois mililitros, 96 bem fundo no topo do módulo magnético. Em seguida, coloque as amostras digeridas no rack de tubo de dois mililitros a partir de A1 e movendo-se verticalmente para baixo.Em seguida, certifique-se de que o robô transfira 55 microliters das amostras digeridas para os poços nas placas profundas do poço no módulo magnético. Verifique se o protocolo do robô está pausado e exibe a mensagem, certifique-se de que as contas preparadas tenham sido carregadas em A6 do rack de tubo de dois mililitros localizado na ranhura quatro antes de retomar o protocolo. Em seguida, o vórtice e gire brevemente as contas SP3 em uma centrífuga mini-bancada e coloque-as no poço A6 do rack de tubo de dois mililitros com a tampa aberta.Verifique se o programa de robôs é pausado e exibe a mensagem, certifique-se de que 80% de etanol tenha sido carregado em A4 do rack de tubo de 15 mililitros mais 50 mililitros localizado no slot cinco antes de retomar o protocolo. Em seguida, coloque uma solução de 80% de etanol no poço A4 no rack do tubo e clique em Retomar para continuar. Observe enquanto o robô muda a velocidade de pipetação para diminuir, aspira o supernatante de cada poço e o distribui para o tubo de resíduo.Aguarde até que o robô mude a velocidade de pipetação de volta ao padrão e desengaja o módulo magnético. Quando o programa de robôs é pausado e exibe a mensagem, abra a tampa no tubo de bicarbonato de amônio, abra a tampa da solução de bicarbonato de amônio e clique em Retomar para continuar. Em espera enquanto o robô desengata o módulo magnético, transfere 250 microliters do tampão de bicarbonato de amônio para cada poço, e imediatamente se mistura por 10 vezes.Em seguida, observe enquanto o robô muda a velocidade de pipetação para diminuir, e transfere o supernatante de cada poço para o tubo de resíduo. Espere até que o robô transfira 100 microliters do tampão de bicarbonato de amônio para cada poço e se misture imediatamente por 10 vezes. Verifique se o programa de robôs está pausado e exibe a mensagem, certifique-se de que novos tubos de coleta tenham sido colocados no bloco de alumínio de dois mililitros antes de retomar o protocolo.Em seguida, coloque um novo conjunto de tubos de microcentrifusagem de baixa retenção de proteínas no bloco de alumínio imediatamente após o último tubo de amostra inicialmente no bloco, e clique em Retomar para continuar. Espera enquanto o robô transfere cada amostra no tampão de bicarbonato de amônio para os novos tubos de dois mililitros. Quando o programa do robô é pausado e exibe a mensagem, certifique-se de que a trippsina tenha sido carregada em C6 do rack de tubo de dois mililitros localizado na ranhura quatro antes de retomar o protocolo, coloque a solução de trippsina no poço C6 do rack de tubo de dois mililitros com a tampa do tubo aberta e clique em Retomar para continuar.Uma vez que o programa termine de funcionar, enrole as tampas do tubo de amostra com filme de parafina, transfira todas as amostras para uma batedeira controlada pela temperatura e incubar a 37 graus Celsius por 16 a 20 horas com 1.000 RPM tremendo. Com a amostra BSA, foram identificados 728 fósforos de espectro de peptídeos e 65 peptídeos, com coeficientes de variação de 5,2% e 3,2%, respectivamente. Com amostra cardíaca complexa, médio de 9.526 fósforos de espectro de peptídeos, 7.558 peptídeos e 1, 336 proteínas foram identificadas em 10 corridas com 7,6%5,9% e 3,6% de variação, respectivamente.Para determinar a variabilidade na quantificação do peptídeo, os coeficientes de variação das intensidades de cromatograma de íon extraído foram calculados para 10 peptídeos que mapeiam para uma proteína única. Quando as variabilidades dos resultados experimentais humanos versus robôs na medição da concentração proteica foram ainda mais comparadas com o ensaio do BCA, o coeficiente médio de variação do ensaio BCA robô foi menor do que o ensaio bca manual humano. Este protocolo reduz o tempo de banco para o processamento de cada amostra.Abre o caminho para explorarmos diferenças proteômicas em um painel de linhas celulares entre múltiplos tratamentos medicamentosos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Bioquímica

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Preparação de cloroplasto sub compartimentos de Arabidopsis para a análise da localização da proteína pelo Immunoblotting ou Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Usando o pipeline de código aberto MALDI TOF-MS IDBac para análise de proteína microbiana e dados metabólito especializados

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Um suporte de amostra tudo-em-um para a cristalografia macromolecular do raio X com espalhamento mínimo do fundo

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Uma preparação de amostra de plasma para espectrometria de massa usando uma estação de trabalho automatizada

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparação da amostra TMT para envio de instalações proteômicas e análise de dados subsequentes

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Fazendo medições de FRET de molécula única precisas e precisas usando o smfBox de código aberto

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...