Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана наградами NIH F32-HL149191 YH; R00-HL144829 в EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 в MPL. Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3 создаются с помощью веб-инструмента научной иллюстрации, BioRender.com.

Разработанные скрипты Python были размещены на GitHub по адресу: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Копия скриптов приведена в дополнительном файле 1. Пожалуйста, обратитесь к репозиторию GitHub для получения последних версий.
1. Экспериментальные препараты
<ol><l...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions.">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li><li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+reproducibility,+human+error,+and+public+policy.">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li><li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

Критические шаги в рамках протокола Для достижения наилучшей производительности следует использовать проверенную Opentrons лабораторную посуду, модули и расходные материалы, совместимые с OT-2. Пользовательское лабораторное ПО может быть создано в соответствии с инструкцией Open...

Протеомика дробовика на основе масс-спектрометрии является мощным инструментом для измерения обилия многих белков в биологических образцах одновременно. Эксперименты по протеомике с анализом биоинформатики обычно используются для выявления биомаркеров и обнаружения связанных биологических комплексов и путей, лежащих в основе патологических механизмов. Обладая высокой аналитной специфичностью и потенциальной количественной точностью, протеомика дробовика также имеет отличный потенциал для принятия исследовательскими учреждениями и диагностическими лабораториями для анализа клинических образцов без необходимости полагаться на антитела1,2.
Чтобы подготовить образцы белка для анализа протеомики дробовика, белки, извлеченные из биологических образцов (например, клеток и тканей), обычно сначала должны быть обработаны с использованием длительных протоколов, включая измерение концентрации белка в образце, снижение белка и алкилирование, а также ферментативное переваривание в пептиды. Кроме того, белки, извлеченные в общих буферах лизиса, содержащих моющие средства, часто требуют дополнительных этапов буферного обмена или удаления моющего средства перед анализом, поскольку моющее средство может мешать пищеварению трипсина и значительно ухудшать производительность последующего анализа жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS)3. Пептиды обычно дополнительно обессолены, высушены и восстановлены в LC-MS/MS совместимых растворителях после ферментативного сбраживания. Эти процедуры биохимии белка могут быть трудоемкими и трудоемкими. Таким образом, они продолжают ограничивать пропускную способность рабочих процессов протеомики и способствуют изменчивости получаемых данных4,5. Человеческие ошибки и предубеждения были признаны в качестве решающих факторов, влияющих на дисперсию и воспроизводимость данных6,7. Чтобы свести к минимуму человеческие ошибки в рабочих процессах масс-спектрометрической пробоподготовки, автоматизированные роботизированные системы пипетирования были использованы для повышения пропускной способности и воспроизводимости идентификации и количественной оценки белка с помощью протеомики дробовика и целевого масс-спектрометрического анализа, где такие достижения были высоко оценены как инструменты для продолжения стремления к широкому внедрению технологий протеомики в критических исследованиях и клинических условиях8, 9,10,11,12,13. Тем не менее, большинство существующих протоколов используют роботизированные платформы обработки жидкостей, которые требуют значительных инвестиций и обучения, ограничивая их полезность во многих лабораториях в академической среде или иным образом с ограниченным бюджетом.
В этой статье описывается протокол, который использует недорогую роботизированную систему обработки жидкостей с открытым исходным кодом, OT-2, для полуавтоматизации типичного рабочего процесса пробоподготовки протеомики дробовика. OT-2 имеет более низкую стоимость, чем многие другие роботизированные системы обработки жидкостей, и на момент написания статьи стоил примерно 5000 долларов США. Если учесть цены на различные модули и лабораторное полотно, общая стоимость проведения экспериментов по этому протоколу на момент написания статьи составляет около 10 000 долларов США, что делает его более доступным для значительно более широкого круга лабораторий по сравнению с более дорогими вариантами. OT-2 совместим с программированием с открытым исходным кодом с помощью скриптов Python и предлагает большую гибкость в разработке пользовательского протокола DIY. Используя три собственных сценария, приведенные ниже протоколы охватывают выполнение типичного рабочего процесса пробоподготовки протеомики дробовика на станции OT-2 с архетипичным стандартом белка (бычий сывороточный альбумин; BSA) и сложный образец белка нормального лизата сердца человека (рисунок 1). Процедуры обработки (1) образца BSA и (2) сложного образца лизата сердца подробно описаны в разделах Протокола 1, 2, 5, 6 и 3, 4, 5, 6 соответственно. Модифицированные карбоксилатом магнитные шарики Sera-Mag используются в однофазной твердофазной пробоподготовке (SP3) для удаления моющих средств и солей из белковых и пептидных образцов. Триптические дигесты из бычьего сывороточного альбумина и сердечных белков человека дополнительно очищаются шариками SP3 и представляются для анализа LC-MS / MS. Затем масс-спектры анализируются с использованием программного обеспечения MaxQuant для идентификации пептидов и белков. Репрезентативные результаты, выполненные нами, показывают, что протокол достигает отличных технических коэффициентов вариации (CV) при экономии времени стенда и не уступает ручному дайджесту.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

Эксперименты по протеомике дробовика на основе масс-спектрометрии требуют нескольких этапов подготовки образцов, включая ферментативное переваривание и очистку белка, что может занять значительные человеко-часы труда на скамейке и представлять собой источник изменчивости от партии к партии. Автоматизация лабораторий с помощью роботов-пипеток может сократить ручную работу, максимизировать пропускную способность и повысить воспроизводимость исследований. Тем не менее, высокие стартовые цены на стандартные станции автоматизации делают их недоступными для многих академических лабораторий. В этой статье описывается рабочий процесс пробоподготовки протеомики с использованием доступной системы автоматизации с открытым исходным кодом (The Opentrons OT-2), включая инструкции по настройке полуавтоматических этапов восстановления белка, алкилирования, пищеварения и очистки; а также сопутствующие скрипты Python с открытым исходным кодом для программирования системы OT-2 через интерфейс прикладного программирования.

Здесь представлены три скрипта Python, совместимые с роботом OT-2 и выполняющие пробоподготовку для протеомики масс-спектрометрии с одним белком стандартного бычьего сывороточного альбумина (технические реплики n = 5 диверсий) и моющим средством, содержащим образец лизата сердца человека (n...

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Подробный протокол и три скрипта Python предоставляются для работы роботизированной системы обработки жидкостей с открытым исходным кодом для выполнения полуавтоматизированной подготовки образцов белка для экспериментов масс-спектрометрии, охватывающих удаление моющих средств, переваривание белка и этапы обессоливания пептидов.

Обработка образцов протеомики дробовика автоматизирована лабораторным роботом с открытым исходным кодом

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Этот протокол использует автоматизацию для выполнения препаратов биохимии белка до экспериментов масс-спектрометрии, что обеспечивает более высокую пропускную способность и более низкую вариабельность для протеомных исследований. Этот протокол использует недорогую, программируемую систему обработки жидкостей, которая доступна большему количеству лабораторий. Мы предоставляем скрипты Python с открытым исходным кодом, которые могут быть изменены для дальнейшей разработки.Продемонстрировать процедуру будет Милтон Амайя, студент магистратуры в нашей лаборатории. Для начала откройте noSP3_Digestion. скрипт py в текстовом редакторе и укажите переменные, специфичные для эксперимента, по мере необходимости в разделе НАСТРОИТЬ ЗДЕСЬ ТОЛЬКО.Затем откройте приложение Opentrons и загрузите сценарий на вкладку Протокол в приложении Opentrons. Затем поместите необходимые лабораторные изделия и пипетки в соответствующее место в колоде OT2, указанной в скрипте Python. Затем поместите раствор бикарбоната аммония в скважину А1 трубчатой стойки «четыре в одном» с верхней частью держателя трубки объемом 15 миллилитров плюс 50 миллилитров и поместите образец белка в колодец формата А1 стойки для трубок «четыре в одном» с двухмиллилитровой крышкой держателя трубки.Вручную поместите двухмиллилитрные белковые трубки с низким связыванием в колодцы алюминиевого блока, размещенного поверх температурного модуля, начиная с А1 и двигаясь вниз по вертикали. Затем поместите раствор DTT в колодец A6 трубчатой стойки «четыре в одном» с двухмиллилитровой крышкой держателя трубки. Наблюдайте, как робот передает соответствующий объем буфера бикарбоната аммония в пробоотборники в алюминиевом блоке.Затем вручную убедитесь, что программа робота приостановлена, и отобразите сообщение: Убедитесь, что DTT был загружен в A6 двухмиллилитровой трубчатой стойки, расположенной в четвертом слоте, прежде чем возобновить протокол. После подтверждения местоположения трубки DTT и открытия крышки трубки нажмите кнопку «Возобновить» в приложении Opentrons, чтобы продолжить. Убедитесь, что робот передает 10 микролитров раствора DTT в каждую пробную скважину, а затем пять раундов смешивания.Затем убедитесь, что программа робота приостановлена и отображает сообщение: Убедитесь, что крышки закрыты на пробках. Затем вручную закройте крышки трубок и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить. Подождите, пока температурный модуль робота не начнет нагревать алюминиевый блок, и температура достигнет 55 градусов по Цельсию, а затем пятиминутная инкубация, чтобы позволить образцам достичь 55 градусов по Цельсию.Затем робот будет удерживать эту температуру в течение 30 минут, чтобы обеспечить снижение белка с помощью DTT. Во время инкубации приготовьте раствор йодоацетамида и вручную оберните его алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света. После инкубации, когда программа робота приостановлена и отображает предупреждающее сообщение, убедитесь, что вы открыли колпачки на пробках, снимите крышку пробирок и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить.Затем вручную убедитесь, что программа робота приостановлена с предупреждающим сообщением, убедитесь, что йодоацетамид был загружен в B6 двухмиллилитровой трубчатой стойки, расположенной в четвертом слоте, прежде чем возобновить протокол. После подтверждения местоположения в стойке трубки йодоацетамида и открытия крышки трубки нажмите «Возобновить» и убедитесь, что робот передает 10 микролитров раствора йодоацетамида в каждую пробирку для образцов, а затем пять раундов смешивания. Когда программа робота приостановлена и отображает сообщение, закройте крышки на пробках, закройте пробки и накройте их фольгой, затем накройте весь алюминиевый блок чистым куском фольги и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить.Подождите, пока образцы не будут инкубированы при температуре 22 градуса Цельсия в течение 30 минут, и убедитесь, что температурный модуль робота деактивируется по завершении инкубации йодоацетамида. Когда программа робота приостановлена и отображает предупреждающее сообщение, убедитесь, что трипсин был загружен в C6 двухмиллилитровой трубчатой стойки, расположенной в четвертом слоте, перед возобновлением протокола, поместите раствор трипсина в колодец C6 двухмиллилитровой трубчатой стойки с открытой крышкой трубки и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить. Затем, когда программа робота приостанавливается и отображает предупреждающее сообщение, откройте колпачки на пробках на температурном модуле, снимите крышку пробирок и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить.В режиме ожидания робот передает 10 микролитров трипсина в каждую пробку, а затем пять раундов смешивания. После ночного переваривания трипсина кратковременно раскрутите образцы с помощью настольной микроцентрифуги и поместите образцы на стойку с магнитной трубкой. Через две минуты аккуратно перенесите супернатант пипеткой в новый набор белковых микроцентрифуг с низким связыванием и храните образцы в холодильнике.Затем откройте SP3_peptide_cleanup. скрипт py Python в текстовом редакторе и укажите переменные эксперимента по мере необходимости в разделе НАСТРОИТЬ ЗДЕСЬ ТОЛЬКО. Затем загрузите скрипт на вкладку Протокол в приложении Opentrons.Поместите необходимую лабораторную посуду и пипетки в соответствующее место в колоде OT2, указанной в скрипте Python, и убедитесь, что магнитный модуль включен и подключен к роботу. Поместите новую двухмиллилитровую пластину скважины глубиной 96 лунок на верхнюю часть магнитного модуля. Затем поместите переваренные образцы в двухмиллилитровую трубчатую стойку, начиная с формата А1 и двигаясь вниз по вертикали.Затем обеспечить передачу роботом 55 микролитров переваренных образцов в скважины в глубоких пластинах скважин на магнитном модуле. Убедитесь, что протокол робота приостановлен и отображает сообщение, Убедитесь, что подготовленные бусины были загружены в A6 двухмиллилитровой трубчатой стойки, расположенной в четвертом слоте, прежде чем возобновить протокол. Затем вихрь и кратковременно раскрутите бусины SP3 в мини-настольной центрифуге и поместите их в колодец A6 двухмиллилитровой трубчатой стойки с открытой крышкой.Убедитесь, что программа роботов приостановлена и отображает сообщение: Убедитесь, что 80% этанола было загружено в A4 15-миллилитра плюс 50-миллилитровая трубчатая стойка, расположенная в пятом слоте, до возобновления протокола. Затем поместите 80%-ный раствор этанола в скважину A4 в стойке трубки и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить. Наблюдайте, как робот изменяет скорость пипетки на медленную, аспирирует супернатант из каждой скважины и распределяет его в отработанную трубу.Подождите, пока робот не изменит скорость пипетки обратно на стандартную и отключит магнитный модуль. Когда программа роботов приостановлена и отображает сообщение, откройте крышку на бикарбонатной трубке аммония, откройте крышку раствора бикарбоната аммония, затем нажмите «Возобновить», чтобы продолжить. В режиме ожидания робот отключает магнитный модуль, передает 250 микролитров буфера бикарбоната аммония в каждую скважину и сразу же перемешивается в течение 10 раз.Затем наблюдайте, как робот изменяет скорость пипетки на медленную и переносит супернатант из каждой скважины в отработанную трубу. Подождите, пока робот перенесет 100 микролитров буфера бикарбоната аммония в каждую скважину и сразу же перемешает 10 раз. Убедитесь, что программа роботов приостановлена и отображает сообщение, Убедитесь, что новые трубки сбора были помещены в двухмиллилитровой алюминиевый блок перед возобновлением протокола.Затем поместите новый набор микроцентрифужных трубок с низким удержанием белка в алюминиевый блок сразу после последней пробы, первоначально находящейся в блоке, и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить. В режиме ожидания робот передает каждый образец в буфере бикарбоната аммония в новые двухмиллилитрные трубки. Когда программа робота приостановлена и отображает сообщение, убедитесь, что трипсин был загружен в C6 двухмиллилитровой трубчатой стойки, расположенной в четвертом слоте, перед возобновлением протокола, поместите раствор трипсина в колодец C6 двухмиллилитровой трубчатой стойки с открытой крышкой трубки и нажмите «Возобновить», чтобы продолжить.Как только программа будет завершена, оберните крышки пробирки парафиновой пленкой, перенесите все образцы в смеситель с контролируемой температурой и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 16-20 часов с встряхиванием 1000 оборотов в минуту. С образцом BSA была идентифицирована среда из 728 совпадений пептидного спектра и 65 пептидов с коэффициентами вариации 5,2% и 3,2% соответственно. Со сложным образцом сердца среда из 9 526 совпадений пептидного спектра, 7 558 пептидов и 1 336 белков была идентифицирована в 10 прогонах с коэффициентами вариации 7,6% 5,9% и 3,6% соответственно.Для определения изменчивости количественной оценки пептидов были рассчитаны коэффициенты вариации интенсивности экстрагированной ионной хроматограммы для 10 пептидов, которые сопоставляются с уникальным белком. Когда вариации экспериментальных результатов человека и робота в измерении концентрации белка были дополнительно сопоставлены с анализом BCA, средний коэффициент вариации анализа BCA робота был ниже, чем ручной анализ BCA человека. Этот протокол сокращает время стенда для обработки каждого образца.Это прокладывает нам путь к изучению протеомических различий в панели клеточных линий между несколькими лекарственными препаратами.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Автоматизированная Акустическая дозирования для серийного разведения пептидные агонисты в Potency Определение Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-МС / МС для углубленной характеризации и Количественный глутамин и аспарагин Дезамидирование в Shotgun протеомике

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Подготовка хлоропласта суб отсеков от Arabidopsis для анализа белка локализации Immunoblotting или протеомики

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Обнаружение мест убиквитирования белка путем обогащения пептида и масс-спектрометрии

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Использование трубопровода MALDI TOF-MS IDBac с открытым исходным кодом для анализа микробного белка и специализированных метаболитных данных

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Универсальный выборочный держатель для макромолекулярной рентгеновской кристаллографии с минимальным рассеянием фона

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Подготовка образца плазмы для масс-спектрометрии с использованием автоматизированной рабочей станции

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Пример ы подготовки к протеомики объекта представления и последующего анализа данных

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Проведение точных и точных одномолекулярных измерений FRET с помощью smfBox с открытым исходным кодом

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...