Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado en parte por los premios nih F32-HL149191 a YH; R00-HL144829 a EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 a MPL. La Figura 1, la Figura 2, la Figura 3 se crean con la ayuda de una herramienta de ilustración científica basada en la web, BioRender.com.

Los scripts de Python desarrollados se han depositado en GitHub en: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Una copia de los scripts se proporciona en el Archivo Suplementario 1. Consulte el repositorio de GitHub para obtener las últimas versiones.
1. Preparativos experimentales
<ol><li>Compruebe el hardware necesario antes de iniciar el protocolo. NOTA: Se requieren los siguientes componentes de hardware: pipetas OT-2, puntas de p...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions.">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li><li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+reproducibility,+human+error,+and+public+policy.">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li><li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

Pasos críticos dentro del protocolo Para obtener el mejor rendimiento, se deben utilizar utensilios de laboratorio, módulos y consumibles verificados por Opentrons compatibles con OT-2. Se puede crear material de laboratorio personalizado siguiendo las instrucciones de Opentrons en Reference14. Asegúrese de calibrar la cubierta OT-2, las pipetas y el material de laboratorio cuando se use por primera vez. También es fundamental seguir las pautas del fabricante de perlas SP3 ...

La proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas es una herramienta poderosa para medir la abundancia de muchas proteínas en muestras biológicas simultáneamente. Los experimentos de proteómica con análisis bioinformático se emplean rutinariamente para identificar biomarcadores y descubrir complejos biológicos asociados y vías que sustentan los mecanismos patológicos. Con su alta especificidad de analito y su potencial precisión cuantitativa, la proteómica de escopeta también tiene un excelente potencial para ser adoptada por instalaciones de investigación y laboratorios de diagnóstico para el análisis de muestras clínicas sin la necesidad de depender de anticuerpos1,2.
Para preparar muestras de proteínas para el análisis proteómico de escopeta, las proteínas extraídas de muestras biológicas (por ejemplo, células y tejidos) generalmente primero deben procesarse utilizando protocolos largos, incluida la medición de la concentración de proteínas de la muestra, la reducción y alquilación de proteínas, y la digestión enzimática en péptidos. Además, las proteínas extraídas en tampones de lisis comunes que contienen detergentes a menudo requieren pasos adicionales de intercambio de tampón o eliminación de detergente antes del análisis porque el detergente puede interferir con la digestión de tripsina y degradar significativamente el rendimiento del análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) aguas abajo3. Los péptidos generalmente se desalan, se secan y reconstituyen en disolventes compatibles con LC-MS / MS después de la digestión enzimática. Estos procedimientos de bioquímica de proteínas pueden ser laboriosos y llevar mucho tiempo. Por lo tanto, continúan limitando el rendimiento de los flujos de trabajo de proteómica y contribuyen a la variabilidad de los datos adquiridos4,5. Los errores y sesgos humanos han sido reconocidos como factores cruciales que afectan la varianza y reproducibilidad de los datos6,7. Para minimizar los errores humanos en los flujos de trabajo de preparación de muestras de espectrometría de masas, se han utilizado sistemas robóticos de pipeteo automatizados para mejorar el rendimiento y la reproducibilidad de la identificación y cuantificación de proteínas a partir de la proteómica de escopeta y el análisis de espectrometría de masas dirigida, donde tales avances han sido aclamados como instrumentales para continuar el impulso de la adopción generalizada de tecnologías proteómicas en entornos clínicos y de investigación críticos8, 9,10,11,12,13. Sin embargo, la mayoría de los protocolos existentes utilizan plataformas robóticas de manejo de líquidos que requieren una inversión y capacitación sustanciales, lo que limita su utilidad en muchos laboratorios en el entorno académico o con un presupuesto limitado.
Este artículo describe un protocolo que utiliza un sistema robótico de manejo de líquidos de bajo costo y código abierto, el OT-2, para semiautomatizar un flujo de trabajo típico de preparación de muestras de proteómica de escopeta. El OT-2 tiene un costo más bajo que muchos otros sistemas robóticos de manejo de líquidos, y en el momento de escribir este artículo, cuesta aproximadamente $ 5,000 dólares estadounidenses. Al tener en cuenta los precios de diferentes módulos y artículos de laboratorio, el costo total para establecer experimentos en este protocolo en el momento de escribir este artículo es de alrededor de $ 10,000, lo que lo hace más asequible para un conjunto considerablemente más amplio de laboratorios sobre opciones más caras. El OT-2 es compatible con la programación de código abierto a través de scripts Python y ofrece grandes flexibilidades en el diseño de protocolos de bricolaje definidos por el usuario. Utilizando tres scripts desarrollados internamente, los protocolos a continuación cubren la ejecución de un flujo de trabajo típico de preparación de muestras de proteómica de escopeta en la estación OT-2 con un estándar de proteína arquetípico (albúmina sérica bovina; BSA) y una muestra de proteína compleja de un lisado normal del corazón humano (Figura 1). Los procedimientos para procesar (1) una muestra de BSA y (2) una muestra de lisado cardíaco complejo se detallan en las secciones 1, 2, 5, 6 y 3, 4, 5, 6 del Protocolo, respectivamente. Las perlas magnéticas modificadas con carboxilato Sera-Mag se utilizan en la preparación de muestras mejoradas en fase sólida (SP3) de una sola olla para eliminar detergentes y sales en las muestras de proteínas y péptidos. Los resúmenes trípticos de la albúmina sérica bovina y las proteínas del corazón humano se limpian aún más con perlas SP3 y se envían para el análisis LC-MS / MS. Los espectros de masas se analizan utilizando el software MaxQuant para la identificación de péptidos y proteínas. Los resultados representativos realizados por nosotros muestran que el protocolo logra excelentes coeficientes técnicos de variación (CV) al tiempo que ahorra tiempo de banco y no es inferior al digesto manual.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

Los experimentos de proteómica de escopeta basados en espectrometría de masas requieren múltiples pasos de preparación de muestras, incluida la digestión enzimática de proteínas y la limpieza, que pueden ocupar horas-persona significativas de trabajo de banco y presentar una fuente de variabilidad de lote a lote. La automatización de laboratorio con robots pipeteadores puede reducir el trabajo manual, maximizar el rendimiento y aumentar la reproducibilidad de la investigación. Aún así, los altos precios iniciales de las estaciones de automatización estándar las hacen inasequibles para muchos laboratorios académicos. Este artículo describe un flujo de trabajo de preparación de muestras de proteómica utilizando un sistema de automatización de código abierto asequible (The Opentrons OT-2), que incluye instrucciones para configurar pasos semiautomatizados de reducción de proteínas, alquilación, digestión y limpieza; así como acompañar scripts Python de código abierto para programar el sistema OT-2 a través de su interfaz de programación de aplicaciones.

Aquí se proporcionan tres scripts de Python que son compatibles con el robot OT-2, y que realizan la preparación de muestras para la proteómica de espectrometría de masas con una albúmina sérica bovina estándar de una sola proteína (réplicas técnicas n = 5 digestiones) y una muestra de lisado cardíaco humano que contiene detergente (n = 5 digestiones). Cada producto de digestión se divide en dos reacciones de limpieza de péptidos. El número de coincidencias de espectro peptídico (PSM), péptidos y proteín...

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Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Se proporciona un protocolo detallado y tres scripts de Python para operar un sistema robótico de manejo de líquidos de código abierto para realizar la preparación semiautomatizada de muestras de proteínas para experimentos de espectrometría de masas, que cubren la eliminación de detergentes, la digestión de proteínas y los pasos de desalinización de péptidos.

Procesamiento de muestras de proteómica de escopeta automatizado por un robot de laboratorio de código abierto

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Este protocolo utiliza la automatización para realizar preparaciones de bioquímica de proteínas antes de los experimentos de espectrometría de masas, lo que permite un mayor rendimiento y una menor variabilidad para los estudios proteómicos. Este protocolo utiliza un sistema de manejo de líquidos programable y de bajo costo que es asequible para más laboratorios. Proporcionamos scripts Python de código abierto que se pueden modificar para un mayor desarrollo.Demostrando el procedimiento estará Milton Amaya, un estudiante de maestría en nuestro laboratorio. Para comenzar, abra el noSP3_Digestion. py script en el editor de texto y especifique las variables específicas del experimento según sea necesario en la sección PERSONALIZAR SOLO AQUÍ.Luego, abra la aplicación Opentrons y cargue el script en la pestaña Protocolo en la aplicación Opentrons. A continuación, coloque el material de laboratorio y las pipetas necesarios en la ubicación correspondiente en la plataforma OT2 especificada en el script de Python. Luego, coloque la solución de bicarbonato de amonio en el pozo A1 del estante de tubos cuatro en uno con la parte superior del soporte de tubo de 15 mililitros más 50 mililitros y coloque la muestra de proteína en el pozo A1 del estante de tubos cuatro en uno con una tapa de soporte de tubo de dos mililitros.Coloque manualmente tubos de baja unión de proteína de dos mililitros en los pocillos del bloque de aluminio colocado en la parte superior del módulo de temperatura, comenzando desde A1 y moviéndose hacia abajo verticalmente. A continuación, coloque la solución de TDT en el pozo A6 del bastidor de tubos cuatro en uno con una tapa de soporte de tubo de dos mililitros. Observe mientras el robot transfiere un volumen apropiado del tampón de bicarbonato de amonio a los tubos de muestra en el bloque de aluminio.Luego, verifique manualmente que el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje, Asegúrese de que la TDT se haya cargado en A6 del bastidor de tubos de dos mililitros ubicado en la ranura cuatro antes de reanudar el protocolo. Después de confirmar la ubicación del tubo de TDT y abrir la tapa del tubo, haga clic en el botón Reanudar en la aplicación Opentrons para continuar. Asegúrese de que el robot transfiera 10 microlitros de la solución de TDT a cada pozo de muestra, seguido de cinco rondas de mezcla.A continuación, verifique que el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje, Asegúrese de cerrar las tapas de los tubos de muestra. Luego, cierre manualmente las tapas de los tubos y haga clic en Reanudar para continuar. Espere hasta que el módulo de temperatura del robot comience a calentar el bloque de aluminio y la temperatura alcance los 55 grados centígrados, seguida de una incubación de cinco minutos para permitir que las muestras lleguen a 55 grados centígrados.El robot mantendrá esta temperatura durante 30 minutos para permitir la reducción de proteínas mediante TDT. Durante la incubación, prepare la solución de yodoacetamida y envuélvala manualmente con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Después de la incubación, cuando el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje de advertencia, asegúrese de abrir las tapas en los tubos de muestra, destapar los tubos de muestra y haga clic en Reanudar para continuar.A continuación, verifique manualmente que el programa del robot esté en pausa con el mensaje de advertencia, Asegúrese de que la yodoacetamida se haya cargado en B6 del bastidor de tubos de dos mililitros ubicado en la ranura cuatro antes de reanudar el protocolo. Después de confirmar la ubicación del bastidor del tubo de yodoacetamida y abrir la tapa del tubo, haga clic en Reanudar y asegúrese de que el robot transfiera 10 microlitros de la solución de yodoacetamida a cada tubo de muestra, seguido de cinco rondas de mezcla. Cuando el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje, cierre las tapas de los tubos de muestra, cubra los tubos de muestra y cúbralos con papel de aluminio, luego cubra todo el bloque de aluminio con un trozo limpio de papel de aluminio y haga clic en Reanudar para continuar.Espere hasta que las muestras se incuben a 22 grados centígrados durante 30 minutos y asegúrese de que el módulo de temperatura del robot se desactive al finalizar la incubación de yodoacetamida. Cuando el programa del robot está en pausa y muestra el mensaje de advertencia, asegúrese de que la tripsina se haya cargado en C6 del bastidor de tubos de dos mililitros ubicado en la ranura cuatro antes de reanudar el protocolo, coloque la solución de tripsina en el pozo C6 del bastidor de tubos de dos mililitros con la tapa del tubo abierta y haga clic en Reanudar para continuar. Luego, cuando el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje de advertencia, abra las tapas en los tubos de muestra en el módulo de temperatura, desmarque los tubos de muestra y haga clic en Reanudar para continuar.Espera mientras el robot transfiere 10 microlitros de tripsina a cada tubo de muestra, seguido de cinco rondas de mezcla. Después de la digestión de tripsina durante la noche, gire brevemente las muestras con una microcentrífuga de sobremesa y coloque las muestras en un estante de tubos magnéticos. Después de dos minutos, transfiera el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta a un nuevo conjunto de tubos de microcentrífuga de baja unión de proteínas y guarde las muestras en un refrigerador.A continuación, abra el SP3_peptide_cleanup. py Python script en un editor de texto, y especifique las variables de experimento según sea necesario en la sección PERSONALIZAR AQUÍ SOLAMENTE. A continuación, cargue el script en la pestaña Protocolo de la aplicación Opentrons.Coloque el material de laboratorio y las pipetas necesarios en la ubicación correspondiente en la plataforma OT2 especificada en el script de Python, y asegúrese de que el módulo magnético esté encendido y conectado al robot. Coloque una nueva placa de pozo de dos mililitros y 96 pocillos de profundidad en la parte superior del módulo magnético. A continuación, coloque las muestras digeridas en el bastidor de tubos de dos mililitros a partir de A1 y moviéndose hacia abajo verticalmente.Luego, asegúrese de que el robot transfiera 55 microlitros de las muestras digeridas a los pozos en las placas de pozos profundos en el módulo magnético. Verifique que el protocolo del robot esté en pausa y muestre el mensaje, Asegúrese de que las cuentas preparadas se hayan cargado en A6 del bastidor de tubos de dos mililitros ubicado en la ranura cuatro antes de reanudar el protocolo. Luego, vórtice y gire brevemente las cuentas SP3 en una mini centrífuga de sobremesa y colóquelas en el pozo A6 del bastidor de tubos de dos mililitros con la tapa abierta.Verifique que el programa de robots esté en pausa y muestre el mensaje, Asegúrese de que se haya cargado un 80% de etanol en A4 del bastidor de tubos de 15 mililitros más 50 mililitros ubicado en la ranura cinco antes de reanudar el protocolo. Luego, coloque una solución de etanol al 80% en el pozo A4 en el estante de tubos y haga clic en Reanudar para continuar. Observe mientras el robot cambia la velocidad de pipeteo a lenta, aspira el sobrenadante de cada pozo y lo dispensa en el tubo de desecho.Espere hasta que el robot cambie la velocidad de pipeteo a la predeterminada y desconecte el módulo magnético. Cuando el programa de robots esté en pausa y muestre el mensaje, Abra la tapa en el tubo de bicarbonato de amonio, abra la tapa de la solución de bicarbonato de amonio, luego haga clic en Reanudar para continuar. Espera mientras el robot desconecta el módulo magnético, transfiere 250 microlitros del tampón de bicarbonato de amonio a cada pozo y se mezcla inmediatamente 10 veces.Luego, observe mientras el robot cambia la velocidad de pipeteo a lenta y transfiere el sobrenadante de cada pozo al tubo de desecho. Espere hasta que el robot transfiera 100 microlitros del tampón de bicarbonato de amonio a cada pozo e inmediatamente mezcle 10 veces. Verifique que el programa de robots esté en pausa y muestre el mensaje, Asegúrese de que se hayan colocado nuevos tubos de recolección en el bloque de aluminio de dos mililitros antes de reanudar el protocolo.Luego, coloque un nuevo conjunto de tubos de microcentrífuga de baja retención de proteínas en el bloque de aluminio inmediatamente después del último tubo de muestra inicialmente en el bloque, y haga clic en Reanudar para continuar. Espera mientras el robot transfiere cada muestra en el tampón de bicarbonato de amonio a los nuevos tubos de dos mililitros. Cuando el programa del robot esté en pausa y muestre el mensaje, asegúrese de que la tripsina se haya cargado en C6 del bastidor de tubos de dos mililitros ubicado en la ranura cuatro antes de reanudar el protocolo, coloque la solución de tripsina en el pozo C6 del bastidor de tubos de dos mililitros con la tapa del tubo abierta y haga clic en Reanudar para continuar.Una vez que el programa haya terminado de ejecutarse, envuelva las tapas del tubo de muestra con una película de parafina, transfiera todas las muestras a un mezclador con temperatura controlada e incube a 37 grados Celsius durante 16 a 20 horas con agitación de 1, 000 RPM. Con la muestra de BSA, se identificó un medio de 728 coincidencias de espectro peptídico y 65 péptidos, con coeficientes de variación de 5,2% y 3,2%, respectivamente. Con una muestra de corazón compleja, se identificó un medio de 9, 526 coincidencias de espectro peptídico, 7, 558 péptidos y 1, 336 proteínas en 10 tiradas con coeficientes de variación de 7.6% 5.9% y 3.6%, respectivamente.Para determinar la variabilidad en la cuantificación de péptidos, se calcularon los coeficientes de variación de las intensidades del cromatograma iónico extraído para 10 péptidos que se asignan a una proteína única. Cuando las variabilidades de los resultados experimentales de humanos versus robots en la medición de la concentración de proteínas se compararon aún más con el ensayo de BCA, el coeficiente promedio de variación del ensayo de BCA de robot fue menor que el ensayo de BCA manual humano. Este protocolo reduce el tiempo de banco para procesar cada muestra.Nos allana el camino para explorar las diferencias proteómicas en un panel de líneas celulares entre múltiples tratamientos farmacológicos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatizado de dispensación acústica para la dilución en serie del péptido Los agonistas de la potencia Ensayos de Determinación

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Investigación

Bioquímica

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS para la caracterización en profundidad y cuantificación de glutamina y asparagina desamidación en escopeta Proteómica

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Preparación de compartimientos los cloroplasto de Arabidopsis para el análisis de la localización de la proteína por Immunoblotting o proteómica

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Uso de la tubería de código abierto MALDI TOF-MS IDBac para el análisis de datos de proteínas microbianas y metabolitos especializados

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Un soporte de muestra todo en uno para cristalografía de rayos X macromolecular con dispersión mínima de fondo

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Una preparación de muestra de plasma para espectrometría de masas utilizando una estación de trabajo automatizada

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparación de muestras TMT para la presentación de instalaciones proteómicas y análisis de datos posteriores

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Realización de mediciones FRET precisas y precisas de una sola molécula utilizando el smfBox de código abierto

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...