Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av NIH-utmärkelser F32-HL149191 till YH; R00-HL144829 till EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 till MPL. Figur 1, figur 2, figur 3 skapas med hjälp av ett webbaserat vetenskapligt illustrationsverktyg, BioRender.com.

De utvecklade Python-skripten har deponerats på GitHub på: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. En kopia av skripten ges i kompletterande fil 1. Se GitHub-lagringsplatsen för de senaste versionerna.
1. Experimentella preparat
<ol><li>Kontrollera den maskinvara som krävs innan protokollet startas. OBS: Följande hårdvarukomponenter krävs: OT-2 pipetter, pipettspetsar, 4-i-1 rörrackset, aluminiumblockuppsättning, magnetisk ...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions.">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li><li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+reproducibility,+human+error,+and+public+policy.">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li><li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

Kritiska steg i protokollet För bästa prestanda bör Opentrons-verifierade labware, moduler och förbrukningsartiklar kompatibla med OT-2 användas. Anpassade labware kan skapas enligt Opentrons instruktion på Reference14. Se till att kalibrera OT-2-däcket, pipetter och labbprogram när de används för första gången. Det är också viktigt att följa riktlinjer från SP3 pärlor tillverkare för att förbereda pärlor för peptid och protein sanering. Under bead- och pep...

Masspektrometribaserad hagelgevärsproteomik är ett kraftfullt verktyg för att mäta förekomsten av många proteiner i biologiska prover samtidigt. Proteomikexperiment med bioinformatikanalys används rutinmässigt för att identifiera biomarkörer och upptäcka tillhörande biologiska komplex och vägar som ligger till grund för patologiska mekanismer. Med sin höga analyt specificitet och potentiella kvantitativa noggrannhet har hagelgevärsproteomik också utmärkt potential att antas av forskningsanläggningar och diagnostiska laboratorier för klinisk provanalys utan att behöva förlita sig på antikroppar1,2.
För att förbereda proteinprover för analys av hagelgevärsproteomik måste proteiner som extraheras från biologiska prover (t.ex. celler och vävnader) vanligtvis först bearbetas med hjälp av långa protokoll, inklusive mätning av provproteinkoncentrationen, proteinreduktion och alkylation och enzymatisk nedbrytning till peptider. Dessutom kräver proteiner som extraheras i vanliga lysbuffertar som innehåller tvättmedel ofta ytterligare steg för buffertutbyte eller tvättmedelsborttagning före analys eftersom tvätt- och rengöringsmedel kan störa trypsinrötning och avsevärt försämra prestandan hos nedströms flytande kromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) analys3. Peptider avsaltas, torkas och rekonstitueras vanligtvis i LC-MS/MS-kompatibla lösningsmedel efter enzymatisk nedbrytning. Dessa proteinbiokemiska procedurer kan vara arbetsintensiva och tidskrävande. Således fortsätter de att begränsa genomströmningen av proteomikarbetsflöden och bidrar till variabiliteten för förvärvade data4,5. Mänskliga fel och fördomar har erkänts som avgörande faktorer som påverkar datavarians och reproducerbarhet6,7. För att minimera mänskliga fel i arbetsflöden för beredning av massspektrometriprover har automatiserade robotsystem för pipettering använts för att förbättra genomströmningen och reproducerbarheten av proteinidentifiering och kvantifiering från hagelgevärsproteomik och riktad analys av masspektrometri, där sådana framsteg har hyllats som avgörande för att fortsätta arbetet med att allmänt anta proteomikteknik i kritisk forskning och kliniska miljöer8. 9,10,11,12,13. De flesta befintliga protokoll använder dock robotiska vätskehanteringsplattformar som kräver betydande investeringar och utbildning, vilket begränsar deras användbarhet i många laboratorier i den akademiska miljön eller på annat sätt med en begränsad budget.
Den här artikeln beskriver ett protokoll som använder ett billigt, öppen källkodsrobotiskt vätskehanteringssystem, OT-2, för att halvautomatisera ett typiskt arbetsflöde för förberedelse av hagelgevär proteomik. OT-2 har en lägre kostnad än många andra robotiska vätskehanteringssystem, och kostar i skrivande stund cirka $ 5,000 US-dollar. När man räknar in priserna på olika moduler och labware är den totala kostnaden för att ställa in experiment i detta protokoll i skrivande stund cirka $ 10,000, vilket gör det mer överkomligt för en betydligt bredare uppsättning laboratorier över dyrare alternativ. OT-2 är kompatibel med programmering med öppen källkod via Python-skript och erbjuder stor flexibilitet i användardefinierad DIY-protokolldesign. Med hjälp av tre egenutvecklade manus täcker protokollen nedan ett typiskt arbetsflöde för beredning av hagelgevärsproteomikprov på OT-2-stationen med en arketypisk proteinstandard (bovint serumalbumin; BSA) och ett komplext proteinprov av en normal human hjärtlystna (figur 1). Förfarandena för bearbetning (1) ett BSA-prov och 2) ett komplext hjärtlystnaprov beskrivs i protokollavsnitten 1, 2, 5, 6 respektive 3, 4, 5, 6. Sera-Mag karboxoxylatmodifierade magnetiska pärlor används i en kruka solid fas-förbättrad provberedning (SP3) för att ta bort tvättmedel och salter i protein- och peptidproverna. Tryptiska sammandrag från bovin serum albumin och humana hjärtproteiner rengörs ytterligare av SP3 pärlor och skickas in för LC-MS /MS analys. Masspektra analyseras sedan med hjälp av MaxQuant-programvaran för peptid- och proteinidentifiering. Representativa resultat som utförs av oss visar att protokollet uppnår utmärkta tekniska variationskoefficienter (CV) samtidigt som bänktid sparas och är inte sämre än handsammanfattning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

Masspektrometribaserade hagelgevär proteomik experiment kräver flera prov beredning steg, inklusive enzymatiska protein matsmältning och sanering, som kan ta upp betydande person-timmar av bänk arbete och presentera en källa till batch-till-batch variabilitet. Labbautomation med pipetteringsrobotar kan minska manuellt arbete, maximera genomströmningen och öka forsknings reproducerbarheten. Ändå gör de branta startpriserna för standardautomationsstationer dem oöverkomliga för många akademiska laboratorier. Den här artikeln beskriver ett arbetsflöde för proteomikprovberedning med hjälp av ett prisvärt automatiseringssystem med öppen källkod (The Opentrons OT-2), inklusive instruktioner för att ställa in halvautomatiska proteinreduktions-, alkylations-, matsmältnings- och rengöringssteg. samt medföljande Python-skript med öppen källkod för att programmera OT-2-systemet genom sitt applikationsprogrammeringsgränssnitt.

Tre Python-skript tillhandahålls här som är kompatibla med OT-2-roboten, och som utför provberedning för masspektrometriproteomik med ett enda proteinstandard bovin serumalbumin (tekniska replikerar n = 5 matsmältningar) och ett tvättmedelsinnehållande humant hjärta lysateprov (n = 5 matsmältningar). Varje smältprodukt är uppdelad i två peptidrensningsreaktioner. Antalet identifierade peptidspektrummatchningar (PSMs), peptider och proteiner i varje omgång av BSA och hjärtprover visas i <strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Detaljerade protokoll och tre Python-skript tillhandahålls för att driva ett robotiserat vätskehanteringssystem med öppen källkod för att utföra halvautomatiska proteinprovberedningar för massspektrometriexperiment, som täcker tvättmedelsborttagning, proteinrötning och peptidavsaltning.

Hagelgevär Proteomics provbehandling automatiserad av en labbrobot med öppen källkod

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Detta protokoll använder automatisering för att utföra proteinbiokemi preparat före masspektrometri experiment, vilket möjliggör högre genomströmning och lägre variabilitet för proteomiska studier. Detta protokoll använder ett billigt, programmerbart vätskehanteringssystem som är överkomligt för fler laboratorier. Vi tillhandahåller Python-skript med öppen källkod som kan ändras för vidare utveckling.Milton Amaya, en masterstudent i vårt laboratorium, demonstrerar proceduren. Börja med att öppna noSP3_Digestion. py skript i textredigeraren och ange de experimentspecifika variablerna efter behov i avsnittet ANPASSA HÄR ENDAST.Öppna sedan Opentrons-appen och ladda upp skriptet till fliken Protokoll i Opentrons-appen. Placera sedan de nödvändiga labware och pipetter på motsvarande plats i OT2-däcket som anges i Python-skriptet. Placera sedan ammoniumbikarbonatlösningen i A1-brunnen i fyra-i-ett-rörstället med 15-milliliter plus 50 ml rörhållare topp och placera proteinprovet i A1-brunnen i fyra-i-ett-rörstället med en två-milliliter rörhållare topp.Placera manuellt två milliliter protein lågbindningsrör i brunnarna i aluminiumblocket som placeras ovanpå temperaturmodulen, från A1 och flytta ner vertikalt. Placera sedan DTT-lösningen i A6-brunnen på fyra-i-ett-rörstället med en två milliliter rörhållare. Observera medan roboten överför en lämplig volym av ammoniumbikarbonatbufferten till provrören i aluminiumblocket.Kontrollera sedan manuellt att robotprogrammet är pausat och visar meddelandet, Se till att DTT har laddats i A6 på det två milliliter rörracket som finns i spår fyra innan protokollet återupptas. När du har bekräftat placeringen av DTT-röret och öppnat rörlocket klickar du på knappen Fortsätt i Opentrons-appen för att fortsätta. Se till att roboten överför 10 mikroliter av DTT-lösningen till varje provbrunn, följt av fem blandningsrundor.Kontrollera sedan att robotprogrammet är pausat och visar meddelandet, Se till att stänga versaler på provrör. Stäng sedan rörens lock manuellt och klicka på Fortsätt för att fortsätta. Vänta tills robotens temperaturmodul börjar värma aluminiumblocket och temperaturen når 55 grader Celsius, följt av en fem minuters inkubation för att låta proverna komma till 55 grader Celsius.Roboten håller sedan denna temperatur i 30 minuter för att möjliggöra proteinreduktion med DTT. Under inkubationen, förbered jodoketamidlösning och täck den manuellt med aluminiumfolie för att undvika exponering för ljus. Efter inkubationen, när robotens program är pausat och visar varningsmeddelandet, Se till att öppna locket på provrör, lossa provrören och klicka på Fortsätt för att fortsätta.Kontrollera sedan manuellt att robotens program är pausat med varningsmeddelandet, Se till att jodacetamid har laddats in i B6 på det två milliliter stora rörracket som finns i spår fyra innan protokollet återupptas. Efter att ha bekräftat stället för jodacetamidröret och öppnat rörlocket, klicka på Fortsätt och se till att roboten överför 10 mikroliter av joacetamidlösningen till varje provrör, följt av fem blandningsrundor. När robotens program är pausat och visar meddelandet, Stäng kepsar på provrör, kapa provrören och täck dem med folie, täck sedan hela aluminiumblocket med en ren bit folie och klicka på Fortsätt för att fortsätta.Vänta tills proverna har inkuberats vid 22 grader Celsius i 30 minuter och se till att robotens temperaturmodul inaktiveras när iodoacetamidinkubationen är klar. När robotens program är pausat och visar varningsmeddelandet, Se till att trypsin har laddats i C6 på det två milliliterubbelt rörracket som ligger i spår fyra före återupptagandeprotokollet, placera trypsinlösningen i C6-brunnen i det två milliliter stora rörracket med rörlocket öppet och klicka på Fortsätt för att fortsätta. Sedan, när robotens program pausas och visar varningsmeddelandet, Öppna kepsar på provrör på temperaturmodulen, lossa provrören och klicka på Fortsätt för att fortsätta.Standby medan roboten överför 10 mikroliter trypsin till varje provrör, följt av fem blandningsrundor. Efter över natten trypsin matsmältning, kort snurra proverna med hjälp av en benchtop microcentrifuge och placera proverna på ett magnetiskt rörställ. Efter två minuter överför du supernatanten försiktigt med en pipett till en ny uppsättning protein lågbindningsmikrocentrifugerör och förvara proverna i kylskåp.Öppna sedan SP3_peptide_cleanup. py Python-skript i en textredigerare och ange experimentvariablerna efter behov i avsnittet ANPASSA ENDAST HÄR. Ladda sedan upp skriptet till fliken Protokoll i Opentrons-appen.Placera nödvändiga labware och pipetter på motsvarande plats i OT2-däcket som anges i Python-skriptet och se till att magnetmodulen är påslagen och ansluten till roboten. Placera en ny, två milliliter, 96-brunns djup brunnsplatta på toppen av magnetmodulen. Placera sedan de smälta proverna i rörstället på två milliliter som börjar från A1 och rör sig vertikalt.Se sedan till att roboten överför 55 mikroliter av de smälta proverna till brunnarna i de djupa brunnsplattorna på magnetmodulen. Kontrollera att robotprotokollet är pausat och visar meddelandet, Se till att förberedda pärlor har laddats i A6 på det två milliliter rörs stället som finns i spår fyra innan protokollet återupptas. Snurra sedan och snurra sp3pärlorna kort i en mini-benchtop-centrifug och placera dem i A6-brunnen i det två milliliter rörstället med locket öppet.Kontrollera att robotprogrammet är pausat och visar meddelandet, Se till att 80% etanol har laddats i A4 på 15-milliliter plus 50 milliliter rörställ som ligger i spår fem innan protokollet återupptas. Placera sedan en 80% etanollösning i A4-brunnen i rörstället och klicka på Fortsätt för att fortsätta. Observera medan roboten ändrar pipetterhastigheten för att sakta, aspirerar supernatanten från varje brunn och doserar den i avfallsröret.Vänta tills roboten ändrar pipetterhastigheten tillbaka till standard och kopplar ur magnetmodulen. När robotprogrammet är pausat och visar meddelandet, Öppna locket på ammonium bikarbonatrör, öppna locket på ammoniumbikarbonatlösningen och klicka sedan på Fortsätt för att fortsätta. Standby medan roboten kopplar ur magnetmodulen överför 250 mikroliter av ammoniumbikarbonatbufferten till varje brunn och blandas omedelbart i 10 gånger.Observera sedan medan roboten ändrar pipetterhastigheten för att sakta och överför supernatanten från varje brunn till avfallsröret. Vänta tills roboten överför 100 mikroliter av ammoniumbikarbonatbufferten till varje brunn och blandas omedelbart i 10 gånger. Kontrollera att robotprogrammet är pausat och visar meddelandet, Se till att nya uppsamlingsrör har placerats i aluminiumblocket på två milliliter innan protokollet återupptas.Placera sedan en ny uppsättning mikrocentrifugerör med låg proteinretention i aluminiumblocket omedelbart efter det sista provröret inledningsvis i blocket och klicka på Fortsätt för att fortsätta. Standby medan roboten överför varje prov i ammoniumbikarbonatbufferten till de nya två milliliterrören. När robotens program är pausat och visar meddelandet, Se till att trypsin har laddats i C6 på det två milliliter rörs stället som ligger i spår fyra före återupptagandeprotokollet, placera trypsinlösningen i C6-brunnen i två ml-rörstället med rörlocket öppet och klicka på Fortsätt för att fortsätta.När programmet är klart igång, linda provrörslocken med paraffinfilm, överför alla prover till en temperaturkontrollerad mixer och inkubera vid 37 grader Celsius i 16 till 20 timmar med 1 000 RPM-skakningar. Med BSA-provet identifierades ett medium på 728 peptidspektrummatchningar och 65 peptider, med 5,2% respektive 3,2% variationskoefficienter. Med ett komplext hjärtprov identifierades ett medium på 9, 526 peptidspektrum, 7, 558 peptider och 1, 336 proteiner i 10 körningar med 7,6% 5,9% respektive 3,6%variationskoefficienter.För att bestämma variabiliteten i peptidkvantifiering beräknades variationskoefficienterna för variationen av de extraherade jonkromatogramintensiteterna för 10 peptider som kartlägger till ett unikt protein. När variabiliteterna mellan försöksresultat mellan människa och robot vid mätning av proteinkoncentration jämfördes ytterligare med BCA-analysen var den genomsnittliga variationskoefficienten för robot BCA-analysen lägre än den mänskliga manuella BCA-analysen. Detta protokoll minskar bänktiden för bearbetning av varje prov.Det banar väg för oss att utforska proteomiska skillnader i en panel av cellinjer mellan flera läkemedelsbehandlingar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiserad Acoustic Utlämning för serieutspädning av peptidagonister i Styrka Fastställande Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS för Djupgående Karakterisering och kvantifiering av glutamin och asparagin Deamidering i Shotgun proteomik

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Beredning av kloroplast sub fack från Arabidopsis för analys av Protein lokalisering av Immunoblotting eller proteomik

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Med öppen källkod MALDI TOF-MS IDBac pipeline för analys av mikrobiellt protein och specialiserade Metabolitdata

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En allt-i-ett-provhållare för makro molekyl ära röntgenkristallografi med minimal bakgrunds spridning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Ett plasmaprovförberedelse för masspektrometri med hjälp av en automatiserad arbetsstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Provberedning för Proteomics Facility Submission och efterföljande dataanalys

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Göra exakta och exakta enmolekyliga FRET-mätningar med hjälp av SmfBox med öppen källkod

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...