Name: shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Bu çalışma kısmen NIH ödülleri F32-HL149191'den YH'ye desteklendi; R00-HL144829'dan EL'e; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278'den MPL'ye. Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3 web tabanlı bir bilim illüstrasyon aracı yardımıyla oluşturulmuştur, BioRender.com.

Geliştirilen Python komut dosyaları GitHub'a şu https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Komut dosyalarının bir kopyası Ek Dosya 1'de verilmiştir. Lütfen en son sürümler için GitHub deposuna bakın.
1. Deneysel hazırlıklar
<ol><li>İletişim kuralını başlatmadan önce gerekli donanımı denetleyin. NOT: Aşağıdaki donanım bileşenleri gereklidir: OT-2 pipetler, pipet uçları, 4'ü 1 arada tüp raf seti, alüminyum...

<ol>
	<li>Geyer, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+biomarker+discovery+by+plasma+proteomics.">Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).</li><li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+mass+spectrometry-based+proteomics+workflow+for+large-scale+FFPE+tissue+analysis.">A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis.</a> The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).</li><li>Yeung, Y. -. G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+detergents+from+protein+digests+for+mass+spectrometry+analysis.">Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis.</a> Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bottom-up+proteomics+depends+on+digestion+conditions.">Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).</li><li>Elliott, K. C., Resnik, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientific+reproducibility,+human+error,+and+public+policy.">Scientific reproducibility, human error, and public policy.</a> Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).</li><li>Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+with+data+and+analyses:+Errors,+underlying+themes,+and+potential+solutions.">Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).</li><li>van den Broek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+multiplex+LC-MS/MS+assay+for+quantifying+serum+apolipoproteins+A-I,+B,+C-I,+C-II,+C-III,+and+E+with+qualitative+apolipoprotein+E+phenotypic.">Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic.</a> Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+preparation+with+SP3+for+low-input+clinical+proteomics.">Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics.</a> Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).</li><li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+reproducible+automated+proteomics+sample+preparation+workflow+for+quantitative+mass+spectrometry.">Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).</li><li>Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semiautomated+paramagnetic+bead-based+platform+for+isobaric+tag+sample+preparation.">A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).</li><li>Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+and+low-cost+proteomics+for+characterization+of+the+protein+corona:+experimental+methods+for+big+data.">Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+sample+processing+and+analysis+workflow+for+low-input+proteome+profiling.">Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling.</a> Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://opentrons.com/ot-app/">https://opentrons.com/ot-app/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://docs.opentrons.com/v2/">https://docs.opentrons.com/v2/</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry</a> (2021)</li><li>. Web URL Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275</a> (2021)</li><li>Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+alternative+protein+isoform+expression+using+RNA+sequencing+and+mass+spectrometry.">Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).</li></ol>

Protokol içinde kritik adımlar En iyi performans için Opentrons onaylı labware, modüller ve OT-2 ile uyumlu sarf malzemeleri kullanılmalıdır. Opentrons'un Reference14'teki talimatını takiben özel laboratuvar yazılımları oluşturulabilir. OT-2 destesini, pipetleri ve labware'i ilk kez kullanıldığında kalibre ettiğinizden emin olun. Peptit ve protein temizliği için boncuk hazırlamak için SP3 boncuk üreticisinin yönergelerine uymak da önemlidir. Özellikl...

Kütle spektrometresi bazlı av tüfeği proteomik, biyolojik numunelerdeki birçok proteinin bolluğunu aynı anda ölçmek için güçlü bir araçtır. Biyoinformatik analizi ile proteomik deneyler, biyobelirteçleri tanımlamak ve patolojik mekanizmaları destekleyen ilişkili biyolojik kompleksleri ve yolları keşfetmek için rutin olarak sunulur. Yüksek analit özgüllüğü ve potansiyel nicel doğruluğu ile av tüfeği proteomik, antikorlara güvenmeye gerek kalmadan klinik numune analizi için araştırma tesisleri ve tanı laboratuvarları tarafından benimsenmesi için mükemmel bir potansiyele sahiptir1,2.
Av tüfeği proteomik analizi için protein örnekleri hazırlamak için, biyolojik örneklerden (örneğin, hücreler ve dokular) çıkarılan proteinlerin tipik olarak, numune protein konsantrasyonunu, protein azaltmayı ve alkilasyonu ölçmek ve peptitlere enzimatik sindirim dahil olmak üzere uzun protokoller kullanılarak işlenmesi gerekir. Ayrıca, deterjan içeren yaygın lizis tamponlarında çıkarılan proteinler genellikle analizden önce ek tampon değişimi veya deterjan çıkarma adımları gerektirir, çünkü deterjan tripsin sindirimini engelleyebilir ve aşağı akış sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) analizinin performansını önemli ölçüde düşürebilir3. Peptitler tipik olarak enzymatic sindirimi takiben LC-MS/MS uyumlu çözücülerde daha fazla tuzdan arındırılır, kurutulur ve yeniden inşa edilir. Bu protein biyokimyası prosedürleri emek yoğun ve zaman alıcı olabilir. Böylece, proteomik iş akışlarının verimini sınırlamaya ve elde edilen verilerin değişkenliğine katkıda bulunmaya devam ederler4,5. İnsan hataları ve önyargıları, veri farkını ve tekrarlanabilirliğini etkileyen önemli faktörler olarak kabul edilmiştir6,7. Kütle spektrometresi numune hazırlama iş akışlarındaki insan hatalarını en aza indirmek için, otomatik pipetleme robotik sistemleri, av tüfeği proteomik ve hedefli kütle spektrometresi analizinden protein tanımlama ve nicelemenin verimini ve tekrarlanabilirliğini iyileştirmek için kullanılmıştır, burada bu tür gelişmeler kritik araştırma ve klinik ortamlarda proteomik teknolojilerin yaygın olarak benimsenmesi için itici güç olarak kabul edilmiştir8, 9,10,11,12,13. Bununla birlikte, mevcut protokollerin çoğu, akademik ortamdaki veya sınırlı bir bütçeyle birçok laboratuvarda yardımcı programlarını sınırlayan, önemli yatırım ve eğitim gerektiren robotik sıvı işleme platformlarını kullanır.
Bu makalede, tipik bir av tüfeği proteomik numune hazırlama iş akışını yarı otomatikleştirmek için düşük maliyetli, açık kaynaklı robotik sıvı taşıma sistemi OT-2'yi kullanan bir protokol açıklanmaktadır. OT-2, diğer birçok robotik sıvı taşıma sisteminden daha düşük bir maliyete sahiptir ve yazma sırasında yaklaşık 5.000 ABD dolarına mal olur. Farklı modüllerin ve laboratuvar yazılımlarının fiyatlarını hesaba katırken, bu protokolde yazma sırasında deneyler kurmanın toplam maliyeti yaklaşık 10.000 $ 'dır, bu da onu daha pahalı seçenekler üzerinde önemli ölçüde daha geniş bir laboratuvar kümesi için daha uygun hale getirir. OT-2, Python komut dosyaları aracılığıyla açık kaynaklı programlama ile uyumludur ve kullanıcı tanımlı DIY protokol tasarımında büyük esneklikler sunar. Şirket içinde geliştirilen üç komut dosyası kullanılarak, aşağıdaki protokoller, ot-2 istasyonunda tipik bir av tüfeği proteomik örnek hazırlama iş akışını arketipik bir protein standardıyla (sığır serum albümin; BSA) ve normal bir insan kalp lisatının karmaşık bir protein örneğidir (Şekil 1). (1) BSA örneği ve (2) karmaşık bir kardiyak lisat örneğinin işlenmesine ilişkin prosedürler sırasıyla Protokol 1, 2, 5, 6 ve 3, 4, 5, 6 bölümlerinde ayrıntılı olarak yer haline gelir. Sera-Mag karboksilat modifiye manyetik boncuklar, protein ve peptit numunelerindeki deterjanları ve tuzları çıkarmak için tek pot katı fazlı geliştirilmiş numune hazırlamada (SP3) kullanılır. Sığır serum albümin ve insan kalp proteinlerinden elde edilen triptik sindirimler SP3 boncukları tarafından daha fazla temizlenir ve LC-MS/MS analizi için gönderilir. Kütle spektrumları daha sonra peptit ve protein tanımlama için MaxQuant yazılımı kullanılarak analiz edilir. Bizim tarafından gerçekleştirilen temsili sonuçlar, protokolün tezgah zaman tasarrufu sağlarken mükemmel teknik değişim katsayıları (CV) elde ettiğini ve el sindirmeden daha düşük olmadığını göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>300 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-in-1 tube rack set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#164568</td>
			<td>3 &#956;m particle; 100 &#197; pore; 75 &#956;m x 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#JT9829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block set</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D5545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#ES800A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasynLC 1200 Nano LC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#LC140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Proof 195-200</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>#04-355-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid LC-MS grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#85178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human heart lysate</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB820-59217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic tube rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXQuant v.1.6.10.43</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mySPIN 6 Mini Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#75004061</td>
			<td>benchtop mini centrifuge for quick spin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 magnetic module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P300 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 P50 single channel pipette</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 robot pipetting robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-2 temperature module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td></td>
			<td>GEN1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind tubes 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#022431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Sequence Database</td>
			<td>UniProt/SwissProt</td>
			<td></td>
			<td>https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 
			20reviewed:yes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#65152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>#45152105050250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vacuum evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin MS Grade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water LC-MS grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#BDH83645.400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot

Kütle spektrometresi bazlı av tüfeği proteomik deneyleri, enzymatic protein sindirimi ve temizleme dahil olmak üzere, önemli kişi-saat tezgah işçiliği alabilen ve toplu olarak değişkenlik kaynağı sunabilen birden fazla numune hazırlama adımı gerektirir. Pipetleme robotları ile laboratuvar otomasyonu manuel çalışmayı azaltabilir, verimi en üst düzeye çıkarır ve araştırma tekrarlanabilirliğini artırabilir. Yine de, standart otomasyon istasyonlarının dik başlangıç fiyatları, onları birçok akademik laboratuvar için uygun hale getiremez hale getirse de. Bu makalede, yarı otomatik protein azaltma, alkilasyon, sindirim ve temizleme adımlarını ayarlama talimatları da dahil olmak üzere uygun fiyatlı, açık kaynaklı bir otomasyon sistemi (Opentrons OT-2) kullanılarak bir proteomik örnek hazırlama iş akışı açıklanmaktadır; yanı sıra, OT-2 sistemini uygulama programlama arayüzü aracılığıyla programlamak için açık kaynaklı Python komut dosyalarına eşlik eder.

Burada OT-2 robotu ile uyumlu ve tek bir protein standart sığır serum albümin (teknik çoğalır n = 5 sindirim) ve deterjan içeren insan kalbi lysate örneği (n = 5 sindirim) ile kütle spektrometrisi proteomik için örnek hazırlama yapan üç Python betiği sağlanmıştır. Her sindirme ürünü iki peptit temizleme reaksiyonuna bölünür. BSA ve kalp örneklerinin her çalışmasında tanımlanan peptit spektrumlu eşleşmelerin (PSM' ler), peptitlerin ve proteinlerin sayısı Şekil 4</...

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot at JoVE.com

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Deterjan giderme, protein sindirimi ve peptit tuzdan arındırma adımlarını kapsayan kütle spektrometresi deneyleri için yarı otomatik protein numunesi hazırlamayı gerçekleştirmek üzere açık kaynaklı bir robotik sıvı taşıma sisteminin çalıştırılması için ayrıntılı protokol ve üç Python komut dosyası sağlanmıştır.

Açık Kaynaklı Bir Laboratuvar Robotu Tarafından Otomatikleştirilmiş Av Tüfeği Proteomik Numune İşleme

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Bu protokol, kütle spektrometrisi deneylerinden önce protein biyokimyası preparatlarını gerçekleştirmek için otomasyon kullanır ve proteomik çalışmalar için daha yüksek verim ve daha düşük değişkenlik sağlar. Bu protokol, daha fazla laboratuvar için uygun fiyatlı düşük maliyetli, programlanabilir bir sıvı taşıma sistemi kullanır. Daha fazla geliştirme için değiştirilebilen açık kaynaklı Python komut dosyaları sunuyoruz.Prosedürü gösteren milton Amaya, laboratuvarımızda yüksek lisans öğrencisi. Başlamak için noSP3_Digestion açın. py komut dosyasını metin düzenleyicisinde bulabilirsiniz ve yalnızca BURADA ÖZELLeştİr bölümünde denemeye özgü değişkenleri gerektiği gibi belirtin.Ardından, Opentrons uygulamasını açın ve komut dosyasını Opentrons uygulamasındaki Protokol sekmesine yükleyin. Ardından, gerekli labware ve pipetleri Python komut dosyasında belirtilen OT2 destesinde ilgili konuma yerleştirin. Ardından, amonyum bikarbonat çözeltisini 15 mililitre artı 50 mililitre tüp tutucu üst ile dört arada tüp rafının A1 kuyusuna yerleştirin ve protein örneğini iki mililitrelik tüp tutucu üstlü dört arada tüp rafının A1 kuyusuna yerleştirin.A1'den başlayıp dikey olarak aşağı doğru hareket ederek sıcaklık modülünün üzerine yerleştirilen alüminyum bloğun kuyularına iki mililitre proteinli düşük bağlayıcı boruları manuel olarak yerleştirin. Ardından, DTT çözeltisini iki mililitrelik bir tüp tutucu üst kısmına sahip dört'ü bir arada tüp rafının A6 kuyusuna yerleştirin. Robot, alüminyum bloktaki numune tüplerine uygun miktarda amonyum bikarbonat tamponu aktarırken gözlemleyin.Ardından, robot programının duraklatıldığını manuel olarak doğrulayın ve mesajı görüntüler, DTT'nin protokole devam etmeden önce yuva dört'te bulunan iki mililitrelik tüp rafının A6'sına yüklendiğinden emin olun. DTT tüpünün konumunu onayladıktan ve tüp kapağını açtıktan sonra, devam etmek için Opentrons uygulamasındaki Özgeçmiş düğmesine tıklayın. Robotun her numuneye 10 mikrolitre DTT çözeltisi aktardığından ve ardından beş karıştırma mermisi aktardığından emin olun.Ardından, robot programının duraklatıldığından emin olun ve mesajı görüntüler, Örnek tüplerdeki kapakları kapattığından emin olun. Ardından, tüplerin kapaklarını manuel olarak kapatın ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın. Robotun sıcaklık modülü alüminyum bloğu ısıtmaya başlayana ve sıcaklık 55 santigrat dereceye ulaşana kadar bekleyin, ardından numunelerin 55 santigrat dereceye ulaşmasını sağlamak için beş dakikalık bir kuluçka.Robot daha sonra DTT tarafından protein azaltımını sağlamak için bu sıcaklığı 30 dakika tutacaktır. Kuluçka sırasında, ışığa maruz kalmamak için iodoasetamid çözeltisi hazırlayın ve alüminyum folyo ile manuel olarak sarın. Kuluçkadan sonra, robotun programı duraklatıldığında ve uyarı mesajını görüntülediğinde, örnek tüplerde kapakları açtığından emin olun, örnek tüplerin kapağını açın ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın.Daha sonra, robotun programının uyarı mesajıyla duraklatıldığını manuel olarak doğrulayın, protokolü sürdürmeden önce iodoasetamid'in yuva dörtte bulunan iki mililitrelik tüp rafının B6'sına yüklendiğinden emin olun. İodoasetamid tüpünün raf konumunu onayladıktan ve tüp kapağını açtıktan sonra, Özgeçmiş'e tıklayın ve robotun her örnek tüpe 10 mikrolitre iodoasetamid çözeltisi aktardığından ve ardından beş karıştırma mermisi aktardığından emin olun. Robotun programı duraklatıldığında ve mesajı görüntülediğinde, Örnek tüplere kapakları kapatın, numune tüplerini kaplayın ve folyo ile örtün, ardından tüm alüminyum bloğu temiz bir folyo parçasıyla örtün ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın.Numuneler 30 dakika boyunca 22 santigrat derecede inkübe edilene kadar bekleyin ve iodoasetamid inkübasyonunun tamamlanmasıyla robotun sıcaklık modülünün devre dışı kalmasını sağlayın. Robotun programı duraklatıldığında ve uyarı mesajını görüntülediğinde, trypsin'in devam protokolünden önce dördüncü yuvada bulunan iki mililitrelik tüp rafının C6'sına yüklendiğinden emin olun, tripin çözeltisini tüp kapağı açık olan iki mililitrelik tüp rafının C6 kuyusuna yerleştirin ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın. Ardından, robotun programı duraklatıldığında ve uyarı mesajını görüntülediğinde, sıcaklık modülündeki örnek tüplerde kapakları açın, örnek tüplerin kapağını açın ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın.Robot her numune tüpüne 10 mikrolitre tripsin aktarırken beklemede kalın, ardından beş karıştırma mermisi. Bir gecede tripsin sindirimden sonra, numuneleri bir tezgah üstü mikrosantrifüj kullanarak kısa bir süre döndürün ve numuneleri manyetik bir tüp rafı üzerine yerleştirin. İki dakika sonra, süpernatantı bir pipetle dikkatlice yeni bir protein düşük bağlı mikrosantrifüj tüpleri kümesine aktarın ve numuneleri bir buzdolabında saklayın.Ardından, SP3_peptide_cleanup açın. py Python komut dosyasını bir metin düzenleyicisinde tıklatın ve deneme değişkenlerini yalnızca BURADA ÖZELLeştİr bölümünde gerektiği gibi belirtin. Ardından, komut dosyasını Opentrons uygulamasındaki Protokol sekmesine yükleyin.Gerekli labware ve pipetleri Python komut dosyasında belirtilen OT2 destesinde ilgili konuma yerleştirin ve manyetik modülün açık ve robota bağlı olduğundan emin olun. Manyetik modülün üstüne yeni, iki mililitrelik, 96 kuyu derinliğinde bir kuyu plakası yerleştirin. Ardından, sindirilen numuneleri A1'den başlayıp dikey olarak aşağı hareket eden iki mililitrelik tüp rafa yerleştirin.Daha sonra, robotun sindirilen numunelerin 55 mikrolitresini manyetik modüldeki derin kuyu plakalarındaki kuyulara aktardığından emin olun. Robot protokolünün duraklatıldığını doğrulayın ve mesajı görüntüler, Protokole devam etmeden önce hazırlanan boncukların yuva dörtte bulunan iki mililitrelik tüp rafının A6'sına yüklendiğinden emin olun. Daha sonra, vorteks ve kısa bir süre SP3 boncuklarını mini tezgah üstü santrifüjde döndürün ve kapağı açık olan iki mililitrelik tüp rafının A6 kuyusuna yerleştirin.Robot programının duraklatıldığını doğrulayın ve mesajı görüntüler, devam protokolünden önce yuva beşte bulunan 15 mililitre artı 50 mililitrelik tüp rafının A4'üne %80 etanol yüklendiğinden emin olun. Ardından, tüp rafındaki A4 kuyusuna% 80 etanol çözeltisi yerleştirin ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın. Robot pipet hızını yavaşlamak için değiştirirken gözlemleyin, her kuyudan süpernatantı aspire eder ve atık tüpüne dağıtır.Robot pipetleme hızını varsayılana döndürüp manyetik modülü devre dışı bırakana kadar bekleyin. Robotlar programı duraklatıldığında ve mesajı görüntülediğinde, amonyum bikarbonat tüpünde kapağı açın, amonyum bikarbonat çözeltisinin kapağını açın, ardından devam etmek için Devam Et'e tıklayın. Robot manyetik modülü devre dışı bırakarak, amonyum bikarbonat tamponunun 250 mikrolitresini her kuyuya aktarır ve hemen 10 kez karıştırır.Ardından, robot pipetleme hızını yavaşlamak için değiştirirken gözlemleyin ve süpernatantı her kuyudan atık tüpüne aktarın. Robot, amonyum bikarbonat tamponunun 100 mikrolitresini her kuyuya aktarana ve hemen 10 kez karışana kadar bekleyin. Robotlar programının duraklatıldığını doğrulayın ve mesajı görüntüler, Protokol devam etmeden önce iki mililitrelik alüminyum bloğa yeni toplama tüplerinin yerleştirildiklerinden emin olun.Ardından, başlangıçta bloktaki son numune tüpünden hemen sonra alüminyum bloğa yeni bir düşük protein tutma mikrosantrifüj tüpü seti yerleştirin ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın. Robot amonyum bikarbonat tamponundaki her numuneyi yeni iki mililitreli tüplere aktarırken beklemeyin. Robotun programı duraklatıldığında ve mesajı görüntülediğinde, trypsin'in devam protokolünden önce dördüncü yuvada bulunan iki mililitrelik tüp rafının C6'sına yüklendiğinden emin olun, tripin çözeltisini tüp kapağı açık olan iki mililitrelik tüp rafının C6 kuyusuna yerleştirin ve devam etmek için Devam Et'e tıklayın.Program tamamlandıktan sonra, numune tüp kapaklarını parafin filmi ile sarın, tüm örnekleri sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıya aktarın ve 1.000 RPM sallanarak 16 ila 20 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. BSA örneği ile sırasıyla %5,2 ve %3,2 değişim katsayısı ile 728 peptit spektrum eşleşmesi ve 65 peptit ortamı tanımlanmıştır. Karmaşık bir kalp örneği ile 9.526 peptit spektrumu eşleşmesi, 7.558 peptit ve 1.336 proteinin bulunduğu 10 koşuda sırasıyla %7.6%5.9 ve %3.6 değişim katsayıları tespit edildi.Peptit niceliğindeki değişkenliği belirlemek için, çıkarılan iyon kromatogram yoğunluklarının varyasyon katsayıları, benzersiz bir proteinle eşlenen 10 peptit için hesaplandı. Protein konsantrasyonunun ölçülmesinde insan ve robot deneysel sonuçlarının değişkenlikleri BCA testine kıyasla daha fazla olduğunda, robot BCA testinin ortalama değişim katsayısı insan el kitabı BCA testinden daha düşüktü. Bu protokol, her örneği işlemek için tezgah süresini azaltır.Birden fazla ilaç tedavisi arasındaki hücre hatları panelinde proteomik farklılıkları keşfetmemizin yolunu açıyor.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Kloroplast alt bölmeler Arabidopsis üzerinden hazırlanması Protein yerelleştirme Immunoblotting veya proteomik analizi için

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Mikrobiyal protein ve özel metabolit verilerinin analizi için açık kaynak MALDı TOF-MS ıdbac Pipeline kullanma

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Minimal arka plan saçılma ile Macromoleküler X-ışını Kristalografi için bir hepsi bir arada örnek tutucu

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Otomatik İş İstasyonu Kullanarak Kütle Spektrometresi Için Plazma Numune Spektrometresi Hazırlığı

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomik Tesis Gönderimi ve Müteakip Veri Analizi için TMT Örnek Hazırlama

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...