Name: integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence
Uploaded: 2022-03-05T15:00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence at JoVE.com

D.T.T. أشكر الموظفين التابعين لمركز بيولوجيا الرئة في جامعة جنوب ألاباما لتحفيز المناقشات حول احتياجات البحوث بيولوجيا الخلايا التجريبية. وكانت هذه المناقشات حاسمة في الشروع في تطوير نظام iTACS.
وقد دعم هذا العمل جزئيا بمنح من المعهد الوطني للصحة/المعهد الوطني لدم الرئة القلبية، P01 HL66299 وR37 HL60024 (ستيفنز)، R01-HL118334 (ألفاريز)، F32-HL144040-01 (شو)، ومن جامعة جنوب ألاباما من خلال صندوق أبراهام ميتشل لأبحاث السرطان (سينغ، بالانكي، تامبي)، منحة البحث والتطوير العلمي (تامبي)، كلية الشرف، وزميل أبحاث الصيف الجامعي (نغوين).

<ol>
	<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PloS One. 8 (2), 55172 (2013).</li><li>Das, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+mechanotransduction+pathway+regulates+collective+migration+of+epithelial+cells.">A molecular mechanotransduction pathway regulates collective migration of epithelial cells.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 276-287 (2015).</li><li>Vedula, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+epithelial+closure+over+non-adherent+environments.">Mechanics of epithelial closure over non-adherent environments.</a> Nature Communications. 6, 6111 (2015).</li><li>Lamason, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+Sca4+reduces+vinculin-mediated+intercellular+tension+to+promote+spread.">Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread.</a> Cell. 167 (3), 670-683 (2016).</li><li>Sunyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+durotaxis+emerges+from+long-range+intercellular+force+transmission.">Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission.</a> Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).</li><li>Dong, L., Oberai, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+cellular+traction+in+three-dimensional+nonlinear+hyperelastic+matrices.">Recovery of cellular traction in three-dimensional nonlinear hyperelastic matrices.</a> Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering. 314, 296-313 (2017).</li><li>Nier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kalman+inversion+stress+microscopy.">Kalman inversion stress microscopy.</a> Biophysical Journal. 115 (9), 1808-1816 (2018).</li><li>Serrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Monolayer+Stress+Microscopy.">Three-dimensional Monolayer Stress Microscopy.</a> Biophysical Journal. 117 (1), 111-128 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+Image+Analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of Image Analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji+-+an+Open+Source+platform+for+biological+image+analysis.">Fiji - an Open Source platform for biological image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+microManager.">Computer control of microscopes using microManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 20 (2010).</li><li>Patel, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+shear:+Role+of+intercellular+traction+and+cellular+moments+in+collective+cell+migration.">Unleashing shear: Role of intercellular traction and cellular moments in collective cell migration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (2), 279-285 (2020).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology,+cytoskeletal+structure,+and+adhesion.">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+complaint+matrices+for+quantifying+cellular+contraction.">Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), (2010).</li><li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes.">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvascular Research. 67 (2), 139-151 (2004).</li><li>Patel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+in+a+pulmonary+microvascular+endothelial+cell+monolayer.">Mechanical signaling in a pulmonary microvascular endothelial cell monolayer.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 519 (2), 337-343 (2019).</li><li>K&#228;hler, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Main+results+of+the+4th+International+PIV+Challenge.">Main results of the 4th International PIV Challenge.</a> Experiments in Fluids. 57 (6), 97 (2016).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Alvarez-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-layer+elastographic+3-D+traction+force+microscopy.">Two-layer elastographic 3-D traction force microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 39315 (2017).</li><li>Makarchuk, S., Beyer, N., Gaiddon, C., Grange, W., Hebraud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+traction+force+microscopy.">Holographic traction force microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3038 (2018).</li><li>Janmey, P. A., Miller, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mechanical+signaling+in+development+and+disease.">Mechanisms of mechanical signaling in development and disease.</a> Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).</li><li>Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+traction+stresses+exerted+by+locomoting+cells+with+the+elastic+substratum+method.">Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method.</a> Biophysical Journal. 70 (4), 2008-2022 (1996).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li><li>Saez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+exerted+by+epithelial+cell+sheets.">Traction forces exerted by epithelial cell sheets.</a> Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194119 (2010).</li><li>Deforet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+velocity+mapping+of+migrating+cell+populations+(AVeMap).">Automated velocity mapping of migrating cell populations (AVeMap).</a> Nature Methods. 9 (11), 1081-1083 (2012).</li><li>Polio, S. R., Smith, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+hydrogels+for+simplified+measurement+of+cell+traction+forces.">Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces.</a> Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).</li><li>Toyjanova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Viscoelastic+traction+force+microscopy.">3D Viscoelastic traction force microscopy.</a> Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).</li><li>Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+forces+and+kinematics+during+collective+cell+migration.">Mapping forces and kinematics during collective cell migration.</a> Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).</li><li>Charrier, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+make+viscoelastic+polyacrylamide+gels+for+cell+culture+and+traction+force+microscopy.">A novel method to make viscoelastic polyacrylamide gels for cell culture and traction force microscopy.</a> APL Bioengineering. 4 (3), 036104 (2020).</li></ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

تستخدم الخلايا الملتصقة إشارات ميكانيكية وكيميائية على حد سواء للبقاء والنمو والوظيفة. تعمل مجموعة واسعة من برامج المجهر على تحسين تجربة المستخدم في تقييم الإشارات الكيميائية من خلال التصوير القائم على الفلورسينس. ومع ذلك، ينطوي تقييم الإشارات الميكانيكية على قدرات غير متوفرة في برنامج المجهر القياسي. وعلاوة على ذلك، فإن تقييم الإشارات الميكانيكية يكون أكثر فعالية عندما يتم دمج الحصول على البيانات مع تحليل البيانات. كان عدم وجود منصة موحدة تلبي الاحتياجات الفريدة لتقييم الإشارات الميكانيكية فجوة تكنولوجية كبيرة في بيولوجيا الخلايا التجريبية. تم تصميم مجموعة الأدوات التكاملية لتحليل الإشارات الخلوية (iTACS) لسد هذه الفجوة. يزود المكونان من iTACS و AnViM و AcTrM المستخدمين بالقدرات اللازمة لتحديد الخصائص الخلوية لأربع فئات واسعة: القوى والحركة ومورفولوجيا والفلورسينس / السطوع. عبر هذه الفئات، iTACS قادرة حاليا على الكشف عن أكثر من 50 جوانب فريدة من الخلايا الملتصقة الفردية. وتشمل هذه الجوانب خصائص محددة لكل فئة واسعة، بما في ذلك قيمتها التمثيلية وتنوعها عبر الخلية (الجدول التكميلي S1). على سبيل المثال، داخل القوات، هناك قوى الشد عبر الهيكل الخلوي، anisotropy من هذا التوتر، واتجاه التوتر الأقصى، والإجهاد القص عبر واجهة الخلية-ECM التي لها تأثير عميق على سلوك الخلايا الملتصقة1،3،6.
نهج جديد لدراسة السلوك الميكانيكي للخلايا الفردية من طبقة واحدة وتشارك الخلايا الفردية من monolayer في تبادل الإشارات ذات الطبيعة الكيميائية والميكاميكانية3. يتم إرسال هذين النوعين من الإشارات عبر الطبقة الأحادية الخلوية بطريقة مختلفة23. ومع ذلك، فإن المعرفة الميكانيكية لنقل الإشارات متخلفة عن معرفة انتقال الإشارات الكيميائية. وتتزامن هذه الفجوة المعرفية مع النقص المستمر في النهج البسيطة والبديهية لتقييم الإشارات الميكانيكية الخلوية. وقد تم تجهيز نهج رسم خرائط البيانات الجديد الموصوف هنا لسد هذه الفجوة. يكشف مثل هذا الرسم الخرائطي أن تقلب التوتر الخلوي الجوهري في المنطقة المجاورة للخلية بمثابة إشارات استرخاء وسوائل وترسيخ تنظم التغيرات في الشكل الخلوي والحجم وسرعة الخلية18. تظهر خرائط خصائص المناطق المجاورة أنماط "التقسيم الفرعي متعدد الخلايا" حيث تتعرض الخلايا داخل التقسيم الفرعي لبيئة دقيقة موحدة نسبيا وتتعرض الخلايا عند حدود التقسيم الفرعي لبيئة صغيرة غير متوافقة بشكل ملحوظ18.
إمكانية الوصول إلى تكنولوجيا قياس القوة توجد مجموعة متنوعة من البروتوكولات لجعل هيدروجيلس PAA، وتحليل تشوه الهيدروجيل والحركة الخلوية، وتحديد كمية الخلية ECM وقوات الخلية1،2،7،8،9،13،14،15،18،20،21،24،25،26،27 28,29,30,31,32. ومع ذلك، لا تزال هذه التطورات بعيدة عن متناول مختبرات بيولوجيا الخلايا المشتركة وتقتصر على مختبرات ذات خبرة هندسية. ومن خلال أتمتة الجوانب التقنية لهذه النهج ودمجها في إطار منصة موحدة وسهلة الاستخدام، فإن الهدف من نظام iTACS هو جعل تقييم الإشارات الميكانيكية نشاطا روتينيا في البحوث التجريبية لبيولوجيا الخلايا والتعليم.
يسمح ImageJ للمستخدمين بتطوير التطبيقات باستخدام نهج تتطلب القليل من التدريب أو لا تتطلب أي تدريب على حده11. تم بناء iTACS إلى حد كبير باستخدام نهج البرمجة النصية البسيطة لتسهيل التنمية المستمرة التي تحركها المجتمعات المحلية. تتم برمجة الجزء الأكبر من AcTrM باستخدام نصوص BeanShell ، ويتم برمجة الجزء الأكبر من AnViM باستخدام وحدات ماكرو ImageJ. هذه البرامج النصية والتوجيهات لتنفيذ هذه القدرات على المجهر المستخدم متاحة من خلال GitHub (<a href="https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS" style="font-size: 14px;" target="_blank">https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS</a>).
توحيد جودة الصور المكتسبة وعلى الرغم من أن التقنيات القائمة على الركيزة المرنة لقياس القوى الفيزيائية في الخلايا الملتصقة قد تم تطويرها وتنفيذها في مختبرات مختلفة، فإن البروتوكول لا يزال يفتقر إلى التوحيد القياسي. أحد المجالات التي تحتاج إلى توحيد أكثر هو نوعية الصور الخرز الأعلى المكتسبة (الشكل التكميلي S1). وتنشأ قضايا هامة من الانجراف في التركيز طوال التجربة. إن نهجنا الجديد القائم على إعادة التركيز القائم على المراجع يجعل مثل هذه العملية الموضوعية مركزة. تفرض المعلمات المحددة في الخطوة الأولى من AcTrM حدود الجودة الموضوعية الضرورية. ويمكن برمجة تدابير توحيد أخرى في الإصدارات المقبلة من نظام التحكم في المقاييس.
قابلية تطبيق iTACS على نطاق واسع بالإضافة إلى تحديد جوانب عديدة من الخلايا الملتصقة، يسهل هيكل iTACS استخدامه لمختلف البروتوكولات والاحتياجات التجريبية. يسمح AcTrM بالتدريب الذاتي للمستخدم الموجه للبرامج. التصوير عالي السرعة المطلوب من قبل، على سبيل المثال، التقييم المتزامن لتقلبات الكالسيوم السيتوبلازمية محدود حاليا بسبب سرعة إعادة وضع وإعادة تركيز الأجهزة ويتم على أفضل وجه في موقع واحد في كل مرة. ومع ذلك ، فإن التنفيذ الحالي مجهز بشكل جيد للتصوير على المدى الطويل ، والتصوير المتقطع ، حيث لا يمكن الاحتفاظ بالعينة على مرحلة المجهر طوال مدة التجربة. وبما أن الصور المرجعية يتم الحصول عليها في بداية التجربة، فإن نظام iTACS يتيح التصوير في الوقت الحقيقي للإشارات الميكانيكية، مما يفتح آفاقا جديدة في تطبيقات فحص الأدوية. تسمح AnViM للمستخدمين بتقديم معلومات تقنية للغاية وفقا لشروط شخص عادي. وتشكل القدرة على تحديد مجموعة واسعة من الخصائص الخلوية وتتبعها طوال التجربة قدرات حاسمة مطلوبة لاكتشاف آليات اتصال جديدة بين الخلايا.
من أجل تطوير iTACS في المستقبل ، حددنا أربعة مجالات تركيز: (1) تعزيز سرعة الحصول على البيانات وتحليل البيانات ، (2) تنفيذ نهج لتقييم الإشارات الخلوية الجديدة13 ، (3) تطوير ورش العمل ووحدات التعليم حول تقييم الإشارات الخلوية المستندة إلى iTACS ، (4) تطوير حلول التشغيل الآلي منخفضة التكلفة.

تستخدم أدوات التصوير البصري وتحليل البيانات الشائعة الاستخدام تقنيات الأجهزة والبرامج التي تكاد تكون عتيقة. إن التأخر في ترجمة وتنفيذ التقدم في الأجهزة الإلكترونية والنهج الحاسوبية والتحليل الرياضي في أدوات بيولوجيا الخلايا التجريبية المشتركة هو قيد رئيسي على وتيرة النمو في معرفتنا بعلم وظائف الأعضاء الخلوية. حاليا، يجد الباحثون في بيولوجيا الخلايا أدوات البيولوجيا الجزيئية في متناول اليد، ولكن الأدوات القائمة على المبادئ الهندسية لتكون بعيدة المنال. ومن هذه الأدوات القائمة على المبادئ الهندسية المجهر الإجهاد أحادي الطبقة (MSM)1,2. وفي حين تم تكييف MSM ودراسة في مختبرات مختلفة في جميع أنحاء العالم، يقتصر استخدامه في المقام الأول على مختبرات ذات خبرة هندسية3,4,5,6,7,8,9.
NIH-ImageJ هي واحدة من الأدوات المفتوحة المصدر الأكثر شعبية بين الباحثين بيولوجيا الخلية10. وكانت التطورات المجتمعية التي يحركها مجتمع المستخدمين أساسية لشعبيته11,12. يحتوي ImageJ على ميزات تسمح للمستخدمين بتطوير التطبيقات بمزيج من لغة برمجة متقدمة ونهج برمجة مبسطة. تسهل هذه الميزات على المستخدمين الذين لديهم معرفة برمجية أساسية تنفيذ أي مساهمة جديدة في البرنامج وتكييفها وتقديمها. بناء على هذه الصفات من NIH-ImageJ، قمنا بتطوير مجموعة أدوات تكاملية لتحليل الإشارات الخلوية (iTACS)، والتي تمكن من التكامل منخفض التكلفة من الأجهزة والأدوات البرمجية المطلوبة لأتمتة قياس مجموعة واسعة من الإشارات الكيميائية والميكايكية عبر الخلايا الملتصقة11،12.
iTACS يتكون من عنصرين : اقتناء والتدريب وحدة (AcTrM) والتحليل والتصور وحدة (AnViM). تم بناء AcTrM على μManager - وهو تطبيق الحصول على الصور المستندة إلى NIH-ImageJ - لتمكين المستخدمين من إعداد قياسات الفاصل الزمني للخصائص البصرية التقليدية ومجموعة متنوعة من الخصائص الفيزيائية للخلايا الملتصقة في عينات متعددة12. AcTrM يسهل تدريب المستخدم من خلال توجيهات موجزة المدرجة في واجهة رسومية. وبالإضافة إلى ذلك، لديها ميزة جديدة من التركيز التلقائي القائم على الصورة المرجعية التي تهدف إلى تسهيل القياسات في الوقت الحقيقي للقوى المادية وتمكين توحيد جودة البيانات المكتسبة.
تم بناء AnViM على الإضافات ImageJ ، والبرمجيات المعجلة ، ومخطوطات التعامل مع الملفات التي تمكن المستخدمين من تقييم أكثر من 50 خاصية كميا ، بما في ذلك الشكل الخلوي والحجم والتوجه والسرعة واتجاه الحركة ، والجر المبذول على المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وعلى الخلايا المجاورة ، لحظات الانكماش والقص لكل من الخلايا الفردية الملتصقة والمنطقة المجاورة لها. يسهل AnViM المستخدمين لتحديد الخصائص الفيزيائية الخلوية دون إتقان الخلفية التقنية الأساسية11. وعلاوة على ذلك، فإنه يتيح تحليل البيانات في وضع معالجة تفاعلية أو دفعية. فهو يولد خرائط حرارية تكشف عن الاختلاف المكاني والرسوم البيانية التي تبين الاختلاف الزمني لخصائص الخلايا الفردية.
في تجربة نموذجية ، يقوم المستخدم بزراعة الخلايا على هيدروجيل مرن مع بروتينات مصفوفة خارج الخلية المناسبة على السطح العلوي ونوعين من علامات الفلورسنت المضمنة. أساسا، صور هذه العلامات الفلورية قبل وبعد زراعة الخلايا كافية لتحديد القوى داخل وحول الخلايا الفردية2،13. تقوم AnViM بتعيين هذه النتائج على خلايا فردية من الكتلة المنضمة وتولد صورا ورسوما بيانية ثاقبة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97%</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
			<td>13822565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98%</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2530850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates</td>
			<td>MatTek or CellVis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde, EM Grade, 25%</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>1909100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1002074706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in preparing suitable hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7222301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rain-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>CovaChem</td>
			<td>102568434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope hardware used in the current study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H117 ProScanTM Stages</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5</td>
			<td>Sutter instrument company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>550372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan III Universal Microscope Automation Controller</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Focus Drive</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence

تقدم التقييم الكمي للقوى الخلوية والحركة بشكل كبير على مدى العقود الأربعة الماضية. ووفرت هذه التطورات الإطار لدراسة عمليات الإشارات الميكانيكية الثاقبة في نظم زراعة الخلايا. ومع ذلك، يواجه المجال حاليا ثلاث مشاكل: عدم وجود توحيد جودة للبيانات المكتسبة، وأخطاء تقنية في تحليل البيانات والتصور، وربما الأهم من ذلك، أن التكنولوجيا لا تزال بعيدة المنال إلى حد كبير بالنسبة لمختبرات بيولوجيا الخلايا المشتركة. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير منصة تجريبية جديدة - مجموعة أدوات تكاملية لتحليل الإشارات الخلوية (iTACS). iTACS يتكون من عنصرين: اقتناء والتدريب وحدة (AcTrM) وتحليل والتصور وحدة (AnViM). ويستند AcTrM على μManager -- وهو برنامج التحكم في المجهر NIH - ImageJ القائم -- ويسهل المستخدم التدريب الذاتي والتشغيل الآلي لبروتوكولات اقتناء الصور المشتركة. تقوم AnViM على NIH-ImageJ وتيسر التشغيل الآلي سهل الاستخدام لتحليل البيانات والتصور الثاقب للنتائج. وتشمل هذه التجارب زراعة الخلايا الملتصقة على الهيدروجيل، وعلامات التصوير الكهودولوجية المضمنة في الهيدروجيل، وأخيرا استخراج توصيف ميكانيكي شامل للخلايا من هذه الصور. حاليا، iTACS تمكن المستخدم لتحليل وتتبع مجموعة واسعة من الخصائص، بما في ذلك مورفولوجيا، والحركة، والقوى الهيكل الخلوي، وفلورسينس من الخلايا الفردية والمنطقة المجاورة لها. تمت معالجة مشكلة توحيد الجودة في AcTrM باستخدام تقنية إعادة التركيز المرجعية الموجهة بالصور. تم تناول القضايا التقنية في تحليل البيانات في AnViM مع إجراء تجزئة الصور متعددة الجوانب ، ونهج سهل الاستخدام لتحديد ظروف الحدود ، وتصور جديد للبيانات المستندة إلى الخصائص الخلوية. تم تصميم AcTrM لتسهيل التحول المباشر للمجاهر الفلورية الأساسية إلى منصات ميكانيكا الخلايا التجريبية ، وتم تجهيز AnViM لتمكين المستخدمين من قياس الإشارات الميكانيكية الخلوية دون الحاجة إلى خلفية هندسية. وسوف تكون iTACS متاحة لمجتمع البحوث كجناح مفتوح المصدر مع قدرات التنمية التي يقودها المجتمع.

Watch this Scientific Journal Video about Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence at JoVE.com

Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence

تعمل منصة مجموعة الأدوات التكاملية لتحليل الإشارات الخلوية (iTACS) على أتمتة عملية قياس مجموعة واسعة من الإشارات الكيميائية والميكايكية في الخلايا الملتصقة في وقت واحد. تم تصميم iTACS لتسهيل التنمية التي يقودها المجتمع وتمكين الباحثين من استخدام جميع ميزات المنصة بغض النظر عن خلفيتهم التعليمية.

مجموعة أدوات تكاملية لتحليل الإشارات الخلوية: القوى والحركة والمورفولوجيا والفلورسينس

Quantitative assessment of cellular forces and motion advanced considerably over the last four decades. These advancements provided the framework to ...

الخلايا الملتصقة تمارس قوات على محيطها، وتشمل تلك القوى الخلايا القوات التي تمارس على الركيزة، كما هو موضح هنا باللون الأخضر، والخلايا القوات تمارس على جيرانها، كما هو مبين باللون الأحمر. ويمكن قياس هذه القوى في monolayers الخلوية باستخدام تقنية تسمى المجهر الإجهاد أحادي الطبقة. باختصار ، تتضمن التقنية إعداد المواد الهلامية المائية التي تحتوي على حبات الفلورسنت الصغيرة ، أسفل السطح العلوي مباشرة ، والخرز الفلوري الكبير الذي يتم لصقه على الزجاج.على هذا الهيدروجيل، يرى المرء الخلايا والثقافات لهم لالتقاء أو أيا كانت الدولة التي يرغب المرء في قياس القوى. يتطلب قياس القوى تصوير الطبقة الأحادية الخلوية ، والتقاط صور ضوئية مرسلة للخلايا ، وصور ضوئية فلورية للخرزات الصغيرة والكبيرة. يتم الحصول على كل من هذه الصور في نفس الطائرة الصوتية.يتم الحصول على هذه الصور عندما يتم إرفاق الخلايا وفصلها عن الهيدروجيل. والمقارنة بين هاتين المجموعتين من الصور تزودنا بالبيانات اللازمة لقياس كل هذه القوى. هذا هو المكان الذي AcTrM و AnViM تأتي في اللعب.بعد تشغيل الخلايا ، للحصول على صور في نفس الموقع بالضبط ، في أي مثيل مطلوب ، يتم برمجة هذا البروتوكول في AcTrM ثم لتحليل هذه البيانات لاحقا وتصور النتائج ، وهذا هو الغرض من AnViM. في الدقائق القليلة القادمة، سوف نسير لكم من خلال عملية الحصول على صور لخلية التقاء monolayer. الخطوة صفر الإجراء يطالب المستخدم لتحديد نوع الاستحواذ.عملية استحواذ جديدة لبدء تجربة جديدة، أو اقتناء مستمر لاستئناف تجربة سابقة. انقر فوق اكتساب جديد لإنشاء قائمة موضع. تسرد الخطوة الأولى من الإجراء كل خطوتك التالية.وسيتم اتخاذ هذه الإجراءات في نافذة قائمة موضع المرحلة هنا. انقر فوق Live في Micro-Manager لتصور العينة لإجراء تعديلات يدوية. في العرض المباشر ، سننظر في المرحلة.هنا هو واضح. الآن ، سيحتاج المرء إلى إلقاء نظرة على الخرز. هنا، يمكن تصور الخرز في مضان.لذا حدد القناة المناسبة للخرزات العلوية. من المهم أيضا أن تتمكن من رؤية بعض الخرز السفلي ، لذلك دعونا ننظر إلى قناة للخرزات السفلية. ما تراه هنا هو صورة ضبابية من الخرز السفلي ، وهذا جيد تماما طالما يمكنك معرفة أن الخرز السفلي موجود ، والذي يمكنك في هذه الصورة.قائمة الموضع، انقر فوق علامة. هذه هي الطريقة التي تقوم بها بإنشاء قائمة المناصب. بعد إنشاء قائمة مراكز، والتي تمت مناقشتها في الفيديو السابق، اتبع الخطوات المدرجة في الخطوة الثانية من الإجراء باستخدام نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد.لنفترض أننا نريد إجراء فاصل زمني طويل. هنا ، سأشير إلى عدد الصور التي نريد التقاطها. القناة الأولى ستكون قناة المرحلة.التالي سيكون من الخرز العلوي والآخر بعد ذلك سيكون الخرز السفلي. انقر فوق إغلاق في إطار اقتناء متعدد الأبعاد ثم انقر فوق موافق في الخطوة الثانية AcTrM. سيتم حفظ الإخراج في الدليل المحدد في إطار اقتناء متعدد الأبعاد.الخطوة الثالثة الإجراء سوف تسأل إذا كانت التجربة تحتاج إلى الانتعاش. الجواب سيكون عادة نعم. هنا iTACS يسأل، هل نريد أن أداء الانتعاش المكرر؟هذا الجزء الأول هو الذهاب الى الحصول على لنا قريبة جدا من الانتعاش المكرر، ولكن الجزء السفلي هو الذهاب الى الحصول على لنا حتى أقرب إلى دقة أعلى من إعادة تحديد المواقع. إذا كان الاسترداد سيتم باستخدام مجال رؤية محدود، يتم تقديم هذا الخيار، ولكن لهذه التجربة، لن نقوم بتحديد هذا الخيار. عند هذه النقطة ، والحصول على مجموعة من الصور المرجعية كاملة ويمكن إغلاق مايكرو مدير.للحصول على الصور ، سيبدأ المرء AcTrM. حدد التكبير واختر الدليل الذي يحتوي على مجلدات البيانات. حدد خيارات لتغيير موضع اللوحة مع القناة المستخدمة لتغيير الموضع.يتم توفير واجهة لمطابقة ما يشاهد حاليا في الكاميرا مع الصور المحفوظة. إذا كان هناك تداخل، سيتم عرض الصور لون أحمر وأخضر جنبا إلى جنب مع الأسود، ويمكن إجراء التعديل اليدوي. وإلا، ضرب قبول، وسوف تستمر عملية الاستحواذ.يمكننا الآن أن نبدأ فيجي. حدد الخيار الأول في القائمة المنسدلة MSM المسماة المعالجة المسبقة. ثم حدد المجلد الذي يحتوي على المجلد tnimgs.بعد ذلك ، سيتعين علينا تحديد القناة التي تتوافق مع الصورة. على سبيل المثال، القناة 0 هي صورة الضوء المرسل وهي صورة تباين الطور للخلايا. صورة الخرزة السفلية هي القناة 2 ، وصورة الخرزة العلوية هي القناة 1.وبعد ذلك، فإنه يطلب منك أين تعبر الخلايا وأي جانب من الصورة. في هذه الحالة، الخلايا هي أحادية الطبقة تتقدم نحو الحافة اليمنى لذلك سنقوم بإلغاء تحديد اليمين، والاستمرار. هنا منطقة صغيرة من الخرز العلوي ، وتقع بعيدا عن monolayer ، تخدم نفس الغرض من صور حبة القاع التي من شأنها أن تظهر sparser وأكبر من تلك المعروضة هنا.الآن هو يسألنا ما إذا كنا نريد تغيير السطوع والتباين حتى الخرز تظهر بشكل بارز. لذلك نحن ضبط باستخدام أشرطة شريط التمرير في القائمة، وبمجرد أن تظهر الخرز بارزة انقر فوق موافق. والآن، سنقوم بتصحيح الموقف. إذا كان هناك أي تحول، فإنه سيتم التخلص منه.وبعد الانتهاء من ذلك ، سيقوم بإنشاء مجلد التحليل. داخل مجلد التحليل ، سيقوم بإنشاء مجلد الموضع ، P0 ، ويتم تخزين الخيارات التي قمنا بها في قوائم ما قبل المعالجة السابقة في خيارات التحليل ، مثل الحواف التي تم عبورها ، وحجم البكسل ، والصورة التي هي تباين الطور وغيرها. في الفحص المجهري للإجهاد أحادي الطبقة ، أو القائمة المنسدلة MSM ، حدد تشوه هلام MSM.من هنا ، سنحدد الخيار المناسب لتوزيع الخرز لدينا. وأثناء معالجة البيانات ، يمكنك أن ترى أن مجلد إزاحة جديد قد ظهر في مجلد الموضع. سيكون هذا هو المكان الذي سيتم فيه تخزين جميع ملفات الإخراج.هذا يشير إلى أن التحليل قد اكتمل. سننظر في كيفية حساب القوى التي تمارس عبر تقاطع الخلية ECM ووصلة الخلية الخلوية وكذلك الهيكل الخلوي للخلايا الفردية للطبقة الواحدة. لذلك، حدد الخيار الثالث.واحد هو الذهاب الى اختيار الدليل الذي يحتوي على tnimgs وتحليل المجلد ، وهو ما يعني واحد سوف حدد الدليل المثال بدلا من أي من هذه الدلائل. ضرب حدد، وسوف يطلب منك، ما هو معامل القص من هذا الجل؟ معامل القص هو 1250 وسماكة الهيدروجيل في هذا المثال هو 118 ميكرون.يتم توفير مستوى الضوضاء المتوقع هنا. ثم، يعني الإزاحة هو علامة صفر، والتي لم يتم التحقق في هذه الحالة. حدد موافق، والتنفيذ الذي يحسب الجر ينفذ عبر وظيفة MATLAB، وهي الطريقة التي يتم تنفيذها في هذا الإصدار من AnViM.وهي الآن على استعداد لإجراء حساب لخلايا الخلية أو القوى الهيكل الخلوي. والسؤال الأول الذي يجب طرحه هو، هل التقاء الطبقة الأحادية؟ في هذه الحالة بالذات ، لدينا طبقة أحادية متقدمة ولا توجد منطقة خلية على الجانب الأيمن من الإطار.لذا فإن الجواب هو أن الطبقة الأحادية ليست التقاء، لذلك نحن ذاهبون لنقول لا. الآن يطلب منا رسم مضلع حول أكبر كائن غير الخلية. نختار الطرق المناسبة للتجزئة.هنا يطلب منا أن تشير إلى لون الخلايا في الأساليب ثلاثة وأربعة، حتى هنا الخلايا هي سوداء لذلك سوف نختار الأسود. وينتهي التقسيم الذي يتم إنتاجه من هذه الطرق المختلفة ببعض الثقوب في الطبقة أحادية الخلية وبعض المناطق البيضاء في منطقة الخلية بدون. هنا يمكننا اختيار وملء البقع تلقائيا وضرب OK.So الآن يتم ملء جميع البقع في الطبقة الأحادية ولا توجد منطقة خلية.وبعد ذلك، سنقوم بحساب الضغوط الميكانيكية في الطبقة الخلوية الأحادية. لقد قمنا بالفعل بأداء الجزء الأول حيث قمنا بتقسيم الخلايا من منطقة عدم وجود خلية ، لذلك نبدأ هذه الخطوة بالجزء الثاني الذي هو تجزئة الخلايا الفردية والصور. واحد هو الذهاب الى اختيار تجزئة للخلايا الفردية.وهنا يطلب منا اختيار دليل المواقف. وهناك بعض المعلومات الواردة هنا لهذه المعلمات. ثم يطلب منك رسم مضلع حول أصغر خلية عادية.إذا ما ترسمه هنا يستخدم لحساب المساحة وسينص على أن أي شيء أصغر من هذا لا يعرف كخلية. وبعد ذلك يسأل عن أكبر خلية. ثم نرسم مضلع حول أكبر خلية عادية، ثم يسأل، أيهما أكثر إشراقا؟هل واجهة الخلية الخلية أكثر سطوعا أم أن مراكز الخلايا أكثر سطوعا؟ لذا في هذه الحالة، واجهة الخلية الخلية أكثر إشراقا لذلك أنا ذاهب لتحديد واجهة الخلية الخلية. وهذا يشير إلى أن الحساب قد اكتمل.لنبدأ بتحديد الخريطة على كثافة الخلايا. أولا، تطلب iTACS من المستخدم تحديد دليل الموضع، والذي يعرف أيضا باسم مجلد P0. عند الانتهاء، انقر فوق تحديد.ثم يسأل المستخدم عما إذا كان يريد أن يكتشف iTACS انقسام الخلايا أو تحديد فترة الفلورسينس الخلوية. في هذه الحالة، ليس لدينا أي بروتينات فلورية داخل الخلية لذلك سنختار الكشف عن انقسام الخلايا. الشريحة التالية تمكن المستخدم من تحديد حجم المنطقة المجاورة، وهذا هو تحليل فريد أن AnViM ينفذ حيث ينظر إلى خصائص الخلايا الفردية وكذلك خصائص الخلايا المجاورة للمنطقة.هنا، يمكن للمستخدم اختيار عرض الخلايا المجاورة للمنطقة. في هذه الحالة، نحدد المناطق المجاورة مع 60 بكسل. يسأل مربع الاختيار الأول ما إذا كنا نريد iTACS لجمع خصائص الخلايا، نعم نفعل، وهذا الاختيار يسأل ما إذا كنا نريد iTACS لجمع خصائص الجيران، نعم، نريد iTACS للقيام بذلك أيضا.أسفل خانات الاختيار هذه، يوفر iTACS المزيد من المعلومات حول خانات الاختيار إذا كان المستخدم يرغب في مزيد من التفاصيل حول كل خانة اختيار. هذا يشير إلى أن التحليل قد اكتمل. مرة أخرى، تطلب iTACS من المستخدم تحديد دليل الموضع.ثم، يتم إعطاء المستخدم خيار لرسم خريطة بيانات القوة، وخلق صور للبيانات القوة، والبيانات سرعة الخريطة، وخلق صور للبيانات السرعة. من المهم ملاحظة أن إنشاء الصور يستغرق وقتا ، لذلك يمكن للمرء أن يختار القيام بذلك الآن أو الانتظار للقيام بذلك لاحقا. لهذا السبب يتم إعطاء المستخدم خيار تحديد الخيارات أم لا.هنا ، يطلب iTACS من المستخدم تحديد حجم المنطقة المجاورة مرة أخرى ، ويمكنك استخدام نفس الحجم الذي حددته لكثافة التعيين ، والذي كان 60 بكسل ، في حالتنا. ومرة أخرى ، يطلب من المستخدم جمع خصائص الخلايا وكذلك المنطقة المجاورة لها. هذا يشير إلى أن التحليل قد اكتمل.في المجهر الإجهاد أحادي الطبقة، أو القائمة المنسدلة MSM، حدد نتائج تتبع البيانات. أولا، تطلب iTACS من المستخدم تحديد دليل الموضع، والذي يعرف أيضا باسم مجلد P0. عند الانتهاء، انقر فوق تحديد.هنا، يسأل iTACS عن رقم الإطار الذي يريد المستخدم أن يبدأ iTACS في تتبع البيانات منه. من الآمن جدا البدء في التتبع من الإطار رقم اثنين ، لأنه لا يمكن تحديد السرعة للإطار رقم واحد. هنا ، يطلب iTACS من المستخدم الإشارة إلى الحد الأقصى لعدد المؤامرات التي يجب ملؤها في وقت واحد.وأساسا ، وهذا هو وسيلة لتسريع تتبع البيانات. عند الانتهاء، انقر فوق موافق، ويتم تقديم خيارات اختيار المتغيرات أثناء التتبع بطريقة مشابهة لخيارات إنشاء خرائط الحرارة. يتم توفير الخصائص الشائعة ذات الاهتمام في مربع النص في أعلى الإطار.ولكن إذا كنت ترغب في تخصيص المتغيرات الخاصة بك، تحتاج ببساطة إلى حذف كل شيء في مربع النص وتحديد خصائص محددة المدرجة أدناه. في المجهر الإجهاد أحادي الطبقة، أو MSM القائمة المنسدلة، حدد رسم النتائج. بعد ذلك، تطلب iTACS من المستخدم إذا كان المستخدم يريد الحد من التآمر على الخلايا ذات المسار غير المنقطع.إذا كنت لا تريد قصر التآمر على المسارات غير المنقطعة ، فانقر فوق No.ولكن إذا كنت تريد قصر التآمر على الخلايا ذات المسارات غير المنقطعة ، فانقر فوق Yes Here iTACS يسأل عن عدد المتغيرات التي يريد المستخدم أن يرسمها البرنامج. iTACS قادر على رسم ما يصل إلى ثلاثة متغيرات، وفي هذه الحالة، سنقوم برسم متغيرين فقط لرؤية العلاقة بين تلك العوامل. في المجهر الإجهاد أحادي الطبقة، أو MSM القائمة المنسدلة، حدد صورة النتائج.إليك دليل الموضع، وعند الانتهاء، انقر فوق تحديد. ثم يطلب منا iTACS اختيار إطار البداية. هنا ، اخترنا الإطار رقم اثنين.يتم تقديم خيارات صنع الخرائط الحرارية بطريقة مماثلة لخيارات رسم المسارات الزمنية للخلايا الفردية. مع ذلك ، نستنتج كيفية إنشاء خريطة حرارية. هنا يمثل الأثر الزمني للسرعة الخلوية في توتر الهيكل الخلوي للخلية رقم واحد.يتم عرض الخصائص على محور عمودي مشترك ويشير المحور الأفقي إلى رقم مثيل الوقت، حيث يتم الحصول على الإطارات في فواصل زمنية مدتها 15 دقيقة. الإخراج الثاني هو مجموعة من الخرائط الحرارية ساعة واحدة في التجربة. وتشمل الخصائص المعروضة هنا منطقة الانتشار، والتوجه، والتعميم، والسرعة، واتجاه الحركة، والتوجه الأقصى للتوتر، والتوتر الهيكل الخلوي، والجر الركيزة، وانزعاج التوتر للخلايا الفردية.إذا هذه لمحة عن مجموعة واحدة من التجارب. هناك العديد من الحالات التجريبية الأخرى حيث يمكن أن تساعد AnViM و AcTrM المستخدم على إجراء التجربة بشكل مستنسخ ويتم سرد هذه الاتصالات في المخطوطة. تتضمن بعض الميزات الرئيسية ل iTACS أتمتة البروتوكول التجريبي ، وتحليل البيانات الآلي ، ولا يلزم وجود خلفية هندسية.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

أداة تحليلية يحدد مقدار التغييرات الخلوية الصرف من التقاط صور ثلاثية الأبعاد الإسفار

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

قياس عمر في<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

تحليل الالتهام الذاتي في<em&gt; البنسليوم العسجدية</em&gt; باستخدام التجويع وسادات في تركيبة مع المجهر مضان

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

تنفيذ المشبك التصحيح وايف مضان المجهر لرصد خصائص الوظيفية للالمعزولة حديثا PKD الظهارة

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

محلي الميدان مضان المجهر: التصوير الإشارات الخلوية في قلوب سليمة

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...