Name: integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence
Uploaded: 2022-03-05T15:00:00
Duration: 14 min 55 s
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D.T.T.感谢南阿拉巴马大学肺生物学中心附属的工作人员激发了关于实验细胞生物学研究需求的讨论。这些讨论对于启动iTACS的发展至关重要。
这项工作得到了美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所P01 HL66299和R37 HL60024（史蒂文斯），R01-HL118334（Alvarez），F32-HL144040-01（Xu）以及南阿拉巴马大学通过亚伯拉罕米切尔癌症研究基金（Singh，Palanki，Tambe），研究和学术发展补助金（Tambe），荣誉学院和暑期本科生研究员（Nguyen）的部分资助。

<ol>
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作者声明没有利益冲突。

贴壁细胞使用机械和化学信号来生存，生长和功能。各种各样的显微镜软件通过基于荧光的成像优化了评估化学信号的用户体验。然而，机械信号的评估涉及标准显微镜软件中没有的功能。此外，当数据采集与数据分析相结合时，机械信号的评估效率最高。缺乏满足机械信号评估独特需求的统一平台一直是实验细胞生物学中的主要技术差距。用于分析蜂窝信号的集成工具包（iTACS）旨在满足这一差距。iTACS的两个组成部分，AnViM和AcTrM，为用户提供了必要的功能来量化四大类的细胞特性：力，运动，形态和荧光/亮度。在这些类别中，iTACS目前能够揭示单个贴壁细胞的50多个独特方面。这些方面包括每个广泛类别的特定性质，包括它们在细胞中的代表性值和变异性（补充表S1）。例如，在力内，细胞骨架上有拉伸力，这种张力的各向异性，最大张力的方向以及穿过细胞-ECM界面的剪切应力，这对贴壁细胞的行为有深远的影响1，3，6。
一种检查单层单个细胞机械行为的新方法 单层的单个细胞参与化学和机械性质的信号交换3。这两种类型的信号以不同的方式在蜂窝单层上传输23。然而，机械信号传输知识落后于化学信号传输。这种知识差距与持续缺乏简单直观的方法来评估细胞机械信号相吻合。这里描述的新颖数据映射方法足以填补这一空白。这种映射表明，细胞邻近区域内在细胞骨架张力的波动可作为弛豫，流态化和锚定信号，调节细胞形状，大小和细胞速度的变化18。邻近区域的属性图表现出"多细胞细分"模式，其中细分内的细胞暴露在相对均匀的微环境中，而细分边界的细胞暴露在非常不均匀的微环境中18。
力测量技术的可访问性 存在多种方案来制造PAA水凝胶，分析水凝胶变形和细胞运动，并量化细胞 - ECM和细胞 - 细胞力1，2，7，8，9，13，14，15，18，20，21，24，25，26，27，28，29，30，31，32.然而，这些发展仍然超出了普通细胞生物学实验室的范围，并且仅限于具有工程专业知识的实验室。通过自动化这些方法的技术方面，并将它们集成到一个统一且用户友好的平台下，iTACS的目标是使机械信号的评估成为实验细胞生物学研究和教育中的常规活动。
ImageJ 允许用户使用几乎不需要培训的方法开发应用程序11。iTACS 主要使用简单的脚本编写方法构建，以促进社区驱动的持续开发。大部分 AcTrM 使用 BeanShell 脚本进行编程，大部分 AnViM 使用 ImageJ 宏进行编程。这些脚本和在用户显微镜上实现这些功能的指南可通过 GitHub（<a href="https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS" style="font-size: 14px;" target="_blank">https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS</a>）获得。
采集图像的质量标准化 尽管基于弹性底物的量化贴壁细胞物理力的技术已经在各种实验室中开发和实施，但该协议仍然缺乏标准化。最需要标准化的一个领域是采集的顶部珠子图像的质量（补充图S1）。在整个实验过程中，焦点漂移会产生重大问题。我们新颖的基于参考图像的重新聚焦方法使这种聚焦成为一个客观的过程。AcTrM 第一步中定义的参数施加了必要的客观质量限制。其他标准化措施可以在未来版本的 AcTrM 中编程。
iTACS的广泛适用性 除了量化贴壁细胞的许多方面外，iTACS结构还有助于其用于各种实验方案和需求。AcTrM 允许软件引导的用户自我培训。例如，同时评估细胞质钙波动所需的高速成像目前受到重新定位和重新聚焦硬件速度的限制，最好一次在一个位置完成。然而，目前的实现对于长期成像，中断成像具有良好的条件，其中样品在整个实验过程中不能保留在显微镜载物台上。由于参考图像是在实验开始时采集的，因此iTACS能够对机械信号进行实时成像，从而为药物筛选应用开辟了新的途径。AnViM允许用户以外行术语提供高度技术性的信息。量化广泛的细胞特性并在整个实验过程中跟踪它们的能力构成了发现新的细胞间通信机制所需的关键能力。
对于iTACS的未来发展，我们确定了四个重点领域：（1）提高数据采集和数据分析速度，（2）实施评估新蜂窝信号的方法13，（3）开发基于iTACS的蜂窝信号评估的研讨会和教育模块，（4）开发低成本自动化解决方案。

常用的光学成像和数据分析工具采用的硬件和软件技术几乎过时。电子设备，计算方法和数学分析的进步在常见实验细胞生物学工具中的翻译和实施滞后是对我们细胞生理学知识增长速度的主要制约因素。目前，细胞生物学研究人员发现分子生物学工具触手可及，但基于工程原理的工具遥不可及。一个基于工程原理的工具是单层应力显微镜（MSM）1，2。虽然MSM已在全球各种实验室中进行了改编和研究，但其使用主要限于具有工程专业知识的实验室3，4，5，6，7，8，9。
NIH-ImageJ是细胞生物学研究人员中最受欢迎的开源工具之一10。用户社区贡献驱动的进步是其受欢迎程度的核心11，12。ImageJ具有允许用户使用高级编程语言和简化脚本方法开发应用程序的功能。这些功能有助于具有基本编程知识的用户实现，适应和推进对软件的任何新贡献。基于NIH-ImageJ的这些特性，我们开发了分析细胞信号的集成工具包（iTACS），该工具包能够以低成本集成所需的硬件和软件工具，以自动测量贴壁细胞中的各种化学和机械信号11，12。
iTACS由两个组件组成：采集和训练模块（AcTrM）以及分析和可视化模块（AnViM）。AcTrM基于μManager（一种基于NIH-ImageJ的图像采集应用程序）构建，使用户能够设置多个样品中贴壁细胞的传统光学特性和各种物理特性的延时测量12。AcTrM 通过图形界面中包含的简明说明方便用户培训。此外，它还具有基于参考图像的自动对焦的新颖功能，旨在促进物理力的实时测量，并使采集的数据的质量标准化。
AnViM基于ImageJ插件，加急软件和文件处理脚本构建，使用户能够定量评估50多种属性，包括细胞形状，大小，方向，运动速度和方向，对细胞外基质（ECM）施加的牵引力，以及对相邻细胞，单个贴壁细胞及其邻近区域的收缩和剪切矩。AnViM有助于用户量化细胞物理特性，而无需掌握底层技术背景11。此外，它还支持在交互式或批处理模式下进行数据分析。它生成显示空间变化的热图和显示单个细胞属性的时间变化的图形。
在典型的实验中，用户在弹性水凝胶上培养细胞，顶部表面有适当的细胞外基质蛋白和两种类型的嵌入荧光标记物。从本质上讲，在培养细胞之前和之后这些荧光标记物的图像足以量化单个细胞内和周围的力2，13。AnViM将这些结果映射到贴壁簇的单个细胞上，并生成有见地的图像和图表。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97%</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
			<td>13822565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98%</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2530850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates</td>
			<td>MatTek or CellVis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde, EM Grade, 25%</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>1909100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1002074706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in preparing suitable hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7222301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rain-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>CovaChem</td>
			<td>102568434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope hardware used in the current study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H117 ProScanTM Stages</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5</td>
			<td>Sutter instrument company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>550372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan III Universal Microscope Automation Controller</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Focus Drive</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence

在过去四十年中，对细胞力和运动的定量评估有了相当大的进步。这些进步为检查细胞培养系统中富有洞察力的机械信号传导过程提供了框架。然而，该领域目前面临三个问题：获取数据缺乏质量标准化，数据分析和可视化中的技术错误，也许最重要的是，该技术对于普通的细胞生物学实验室来说仍然遥不可及。为了克服这些限制，我们开发了一个新的实验平台 - 分析蜂窝信号的集成工具包（iTACS）。iTACS由两个组件组成：采集和训练模块（AcTrM）以及分析和可视化模块（AnViM）。AcTrM基于μManager（一种基于NIH-ImageJ的显微镜控制软件），有助于用户进行自我培训和自动化常用图像采集协议。AnViM基于NIH-ImageJ，有助于用户友好的数据分析自动化和结果的有见地可视化。这些实验涉及在水凝胶上培养贴壁细胞，对嵌入水凝胶中的基准标记物进行成像，最后从这些图像中提取细胞的全面机械表征。目前，iTACS使用户能够分析和跟踪各种特性，包括形态学，运动，细胞骨架力以及单个细胞及其邻近区域的荧光。质量标准化问题在AcTrM中得到了解决，这是一种参考图像引导的重新对焦技术。AnViM通过多管齐下的图像分割程序，用户友好的边界条件识别方法以及基于蜂窝属性的新型数据可视化解决了数据分析中的技术问题。AcTrM旨在促进基本荧光显微镜直接转换为实验细胞力学装置，而AnViM的配备使用户无需工程背景即可测量细胞机械信号。iTACS将作为具有社区驱动开发能力的开源套件提供给研究社区。

我们在这里介绍所演示示例的两个关键输出。第一个输出是细胞编号1的细胞速度和细胞骨架张力的时间痕迹（图16）。属性显示在共享的垂直轴上，以促进属性之间的视觉关联，水平轴指示时间实例编号。在该实验中，以15分钟的间隔获得连续帧。第二个输出是实验中1小时的热图数组（图17）。此处显示的属性包括扩散面积、方向、圆度、速度、运动方向、最大张力取向、细胞骨架张力、底物牵引和单个细胞的张力各向异性。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig01.jpg"> 图1：用于分析蜂窝信号的集成工具包（iTACS）的结构。 iTACS的两个关键组件是采集和训练模块（AcTrM）以及分析和可视化模块（AnViM）。AcTrM可以使用目前存在的各种水凝胶制备技术来制备可以牢固地保持在显微镜载物台上的水凝胶，任何细胞接种以及将细胞保留在一个焦平面中的生长方案。AnViM可以使用各种技术来量化水凝胶和单层变形，细胞 - ECM力和细胞 - 细胞力。所有这些用户首选的力测量协议组件都可以在iTACS中容纳，并且它们已经用虚线框标识。用实心盒识别的组件是对细胞力测量技术的新贡献。AnViM 中的可视化侧重于各个单元格中属性的中值和可变性。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig02.jpg"> 图2：参考图像采集 - 第1部分。 使用 AcTrM 创建仓位列表的步骤。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig03.jpg"> 图3：参考图像采集 - 第2部分。 使用 AcTrM 获取参考图像的步骤。步骤 2、4 和 6 的详细视图分别显示在 补充图 S2、 S3 和 S4 中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig04.jpg"> 图 4：剩余实验的自动图像采集。 恢复图像采集以使用 AcTrM 评估细胞行为的步骤。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig05.jpg"> 图 5：设置自动数据分析。 使用 AnViM 开始自动图像分析的步骤。该软件可识别AcTrM使用的图像格式。步骤3和5中面板的详细视图分别在 补充图S5 和 补充 图S6中显示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig06.jpg"> 图6：水凝胶和单层变形的定量 - 第1部分。 通过 AnViM参与Tseng，Q.等人的粒子图像测速实施的步骤，PNAS（2012）20 以量化水凝胶顶部表面的变形。用户还可以在AnViM中实施其他方法来量化水凝胶变形。步骤3的详细视图如 附图S7所示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig07.jpg"> 图7：水凝胶和单层变形的定量 - 第2部分。通过AnViM参与Tseng，Q.等人的粒子图像测速实现的步骤，PNAS（2012）20来量化单个细胞的局部运动。用户还可以在AnViM中实施其他方法来量化细胞运动。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig08.jpg"> 图8：细胞-ECM和细胞-细胞力的定量。 通过AnViM进行图像分析的步骤， 以 参与Trepat等人的傅里叶变换牵引显微镜实现，Nature Physics（2009）15 以量化细胞对水凝胶施加的力，以及Tambe等人的单层应力显微镜实现，Nature Materials（2011）1 以量化单个细胞内和相邻细胞之间的力。用户还可以在AnViM中实施其他方法来量化细胞ECM和细胞 - 细胞力。步骤6的详细视图如 附图S8 和 附图S9所示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig09.jpg"> 图 9：映射单个像元上的网格点值 - 第 1 部分。 使用新颖的多管齐下的方法分割包含细胞的图像区域的步骤。这种方法可用于分割细胞的相差，明场或荧光图像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig10.jpg"> 图 10：映射单个像元上的网格点值 - 第 2 部分。 使用AnViM中开发的新型多管齐下的方法分割单层单个细胞的步骤。这种方法可用于分割细胞的相差，明场或荧光图像。步骤2的详细视图如图 S10所示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig11.jpg"> 图 11：映射单个像元上的网格点值 - 第 3 部分。 使用 AnViM 评估单个细胞内区域以及单个细胞相邻区域内的像素强度的步骤。评估的强度包括透射光强度和荧光强度。此部分映射单个像元内以及单个像元的相邻区域内像素强度的中值和标准差。步骤2的详细视图如 附图S11所示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig12.jpg"> 图 12：映射单个像元上的网格点值 - 第 4 部分。 使用 AnViM 评估单个单元内以及单个单元的相邻区域内网格点的力和运动属性的步骤。此部分映射单个像元内以及各个像元的相邻区域内属性的中值和标准差。步骤 2 和 3 的详细视图显示在 补充图 S12 和 补充图 S13 中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig13.jpg"> 图 13：结果可视化 - 第 1 部分。 使用AnViM在整个实验过程中跟踪单个细胞属性的步骤。步骤 2 和 3 的详细视图显示在 补充图 S14 和 补充 图 S15 中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig13large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig14.jpg"> 图 14：结果可视化 - 第 2 部分。 使用 AnViM 生成评估属性的时间跟踪的步骤。用户可以选择在一个图形中绘制最多三个属性。为所有细胞或仅为在整个实验中成功跟踪的细胞生成时间痕迹。步骤5的详细视图如 附图S16 和 补充图S17所示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig14large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig15.jpg"> 图 15：结果可视化 - 第 3 部分。 使用 AnViM 生成评估属性的热图的步骤。将为起始帧之后的所有帧和所有选定属性生成热图。步骤3的详细视图在补充 图S18中给出。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig15large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig16.jpg"> 图 16：单元格 ID 1 的时间迹线。 显示的两个属性是细胞骨架张力（"avgtenMedian"）和细胞速度（"speedMedian"）。细胞骨架张力和细胞速度都被量化为细胞内网格点的中位值。这两个属性使用任意单位绘制在同一轴上，以可视化评估属性之间的关系。 补充表 S1 中列出了其他变量名称。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig16large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63095/63095fig17.jpg"> 图17：分析单层中单个细胞性质的热图。 每个单元格都使用面板中指示的属性的中值进行着色。因此，深红色表示色谱中的最大细胞值，深蓝色表示所分析的单层中的最小细胞值。如Tambe等人，PLoS One（2013）2中所述，位于边界附近的细胞具有受图像外部细胞未知特性影响的机械力。因此，将为远离边界的像元生成热图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/63095fig17large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
图S1：顶部和底部荧光珠的样品图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s1.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图 S2：图 3 中步骤 2 的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s2.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图 S3：图 3 中步骤 4 的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s3.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图S4 A：图3中步骤6的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s4.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图 S5：图 5 中步骤 3 的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s5.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图 S6：图 5 中步骤 5 的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s6.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图 S7：图 6 中步骤 3 的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s7.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图S8：图8中步骤6的单元-ECM力输出的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s8.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图S9：图8中步骤6的细胞-细胞力输出的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s9.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图 S10：图 10 中步骤 2 的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s10.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图 S11：图 11 中步骤 2 的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s11.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图 S12：图 12 中步骤 2 的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s12.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图 S13： 图 12 中步骤 3 输出的详细视图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s13.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图 S14：图 13 中步骤 2 的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s14.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图 S15：图 13 中步骤 3 的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s15.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图 S16：图 14 中步骤 5 中生成的数据文件的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s16.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图 S17：图 14 中步骤 5 中生成的绘图的详细视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s17.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
图S18：热图的详细视图和包含图15中步骤4中生成的色谱范围的文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/s18.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
表 S1：由 iTACS 量化的选定属性列表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63095/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>

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Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence

用于分析细胞信号的集成工具包 （iTACS） 平台可自动测量贴壁细胞中的各种化学和机械信号。iTACS旨在促进社区驱动的开发，并使研究人员能够使用所有平台功能，无论其教育背景如何。

用于分析细胞信号的集成工具包：力、运动、形态学和荧光

Quantitative assessment of cellular forces and motion advanced considerably over the last four decades. These advancements provided the framework to ...

贴壁细胞对它们的周围施加力，这些力包括细胞施加在底物上的力，这里以绿色显示，以及细胞对它们的邻居施加的力，以红色显示。这些力可以使用称为单层应力显微镜的技术在细胞单层中测量。简而言之，该技术涉及制备水凝胶，其中含有微小的荧光珠，就在顶部表面下方，以及粘在玻璃上的大荧光珠。在这种水凝胶上，人们看到细胞并培养它们汇合或想要测量力的任何状态。力的测量需要对细胞单层进行成像，拍摄细胞的透射光图像，以及微小和大珠子的荧光光图像。这些图像中的每一个都是在同一声乐平面上获取的。当细胞附着并从水凝胶中分离时，这些图像被获取。对这两组图像的比较为我们提供了量化所有这些力所必需的数据。这就是AcTrM和AnViM发挥作用的地方。在将细胞电镀后，您可以在任何所需的实例上在完全相同的位置获取图像，该协议被编程到AcTrM中，然后随后分析这些数据并可视化结果，这就是AnViM的目的。在接下来的几分钟里，我们将引导您完成为汇合细胞单层获取图像的过程。操作步骤 0 会提示用户选择获取类型。重新开始新的实验，或继续收购以恢复先前的实验。单击"全新获取"以创建职位列表。操作步骤 1 列出了所有下一步。这些操作将在此处的舞台位置列表窗口中执行。单击"在微管理器中实时"以可视化示例以进行手动调整。在实时视图中，我们将查看阶段。在这里，这是很清楚的。现在，人们需要看看珠子。在这里，珠子可以在荧光中可视化。因此，请选择适合顶部珠子的通道。同样重要的是，您能够看到一些底部珠子，因此让我们看一下底部珠子的通道。你在这里看到的是一个模糊的底部珠子的图像，只要你能看出底部珠子在那里，这完全没问题，你可以在这个图像中。位置列表，单击标记。这就是您创建职位列表的方式。创建仓位列表（如上一视频所述）后，请使用多维采集窗口按照操作步骤 2 中列出的步骤操作。假设我们想要执行很长的延时。在这里，我将指出我们想要拍摄的图像数量。第一个通道将是相位通道。下一个将是顶部珠子，之后的那个将是底部珠子。在多维采集窗口中单击关闭，然后在 AcTrM 步骤 2 中单击确定。输出将保存在多维采集窗口中标识的目录中。操作步骤 3 将询问实验是否需要恢复。答案通常是肯定的。在这里，iTACS问，我们是否要执行精细的恢复？第一部分将使我们非常接近精炼的复苏，但底部将使我们更接近更高精度的重新定位。如果要使用有限的视野进行恢复，则提供此选项，但对于此实验，我们不会选择该选项。此时，一组参考图像的采集完成，可以关闭Micro-Manager。对于图像采集，将启动 AcTrM。选择放大倍率，然后选择包含数据文件夹的目录。选择用于重新定位板的选项以及用于重新定位的通道。提供了一个界面，用于将相机中当前看到的内容与保存的图像进行匹配。如果有重叠，图像将显示红色和绿色以及黑色，并且可以执行手动调整。否则，命中接受，收购将继续进行。我们现在可以从斐济开始。在 MSM 下拉菜单中选择标记为"预处理"的第一个选项。然后，选择包含 tnimgs 文件夹的文件夹。接下来，我们将必须定义哪个通道对应于哪个图像。对于此示例，通道 0 是透射光图像，它是细胞的相差图像。底部珠子图像为通道 2，顶部磁珠图像为通道 1。然后，它会问你细胞在哪里交叉以及图像的哪一边。在这种情况下，单元格是向右边缘前进的单层，因此我们将取消选择"右"并继续。在这里，一小块顶部珠子区域，远离单层，其用途与底部珠子图像相同，其看起来比这里显示的更稀疏，更大。现在它问我们是否要改变亮度和对比度，使珠子突出显示。因此，我们使用菜单中的滑块进行调整，一旦珠子出现突出，请单击"确定"。现在，我们将进行位置校正。如果有任何转变，它将摆脱它。完成后，它将创建分析文件夹。在分析文件夹中，它将创建位置文件夹 P0，我们在前面的预处理菜单中所做的选择存储在分析选项中，例如交叉的边缘、像素大小以及相差图像等。在单层应力显微镜或 MSM 下拉菜单中，选择 MSM 凝胶变形。从这里，我们将选择适合我们的珠子分销的选项。在处理数据时，您可以看到位置文件夹中出现了一个新的置换文件夹。这将是存储所有输出文件的位置。这表示分析已完成。我们将研究如何计算在细胞 - ECM连接和细胞 - 细胞连接以及单层的单个细胞的细胞骨架上施加的力。为此，请选择第三个选项。人们将选择包含tnimgs和分析文件夹的目录，这意味着人们将选择示例目录而不是这些目录中的任何一个。点击选择，它会问你，这个凝胶的剪切模量是多少？剪切模量为1250，本例中水凝胶的厚度为118微米。此处提供了预期的噪音水平。然后，存在平均位移为零标志，在这种情况下不进行检查。选择"确定"，计算牵引力的实现将通过 MATLAB 函数执行，这就是在此版本的 AnViM 中实现的方式。现在它已准备好对细胞 - 细胞或细胞骨架力进行计算。首先要问的问题是，单层是汇合的吗？在这种特殊情况下，我们有一个前进的单层，并且在框架的右侧有一个没有细胞的区域。所以答案是单层不是汇合的，所以我们要说不。现在，我们被要求在最大的非像元对象周围绘制一个多边形。我们选择适当的分割方法。在这里，它要求我们在方法3和4中指示单元格的颜色，因此这里的单元格是黑色的，因此我们将选择黑色。从这些不同方法产生的分割以细胞单层中的一些孔和无细胞区域中的一些白色区域结束。在这里，我们可以选择，自动填充点并点击 OK.So 现在所有点都填充在单层中，没有细胞区域。然后，我们将计算细胞单层中的机械应力。我们已经执行了第一部分，其中我们从无细胞区域分割了细胞，因此我们从第二部分开始此步骤，即分割单个细胞和图像。一个是为单个单元格选择分割。在这里，它要求我们选择职位目录。这里提供了有关这些参数的更多信息。然后，它会要求您在最小的正常像元周围绘制一个多边形。所以你在这里绘制的东西用于计算面积，它将规定任何小于此值的东西都不被定义为一个单元格。接下来，它要求最大的细胞。然后我们围绕最大的正常像元绘制一个多边形，然后它会问，哪一个更亮？是细胞-细胞界面更亮还是细胞中心更亮？所以在这种情况下，细胞-细胞接口更亮，所以我将选择细胞-细胞接口。因此，这表示计算已完成。让我们从选择细胞强度的图谱开始。首先，iTACS 要求用户选择位置目录，也称为 P0 文件夹。完成后，单击"选择"。然后询问用户是否希望iTACS检测细胞分裂或量化细胞荧光。在这种情况下，我们在细胞内没有任何荧光蛋白，这就是为什么我们选择检测细胞分裂。下一张幻灯片使用户能够定义相邻区域的大小，这是AnViM执行的独特分析，它在其中查看单个单元的属性以及相邻区域的单元的属性。在这里，用户可以选择相邻区域的像元的宽度。在本例中，我们使用 60 像素定义相邻区域。第一个复选框询问我们是否希望 iTACS 收集单元格的属性，是的，我们这样做，这个复选框询问我们是否希望 iTACS 收集邻居的属性，是的，我们希望 iTACS 也这样做。在这些复选框下方，如果用户希望了解有关每个复选框的更多详细信息，iTACS 将提供有关这些复选框的更多信息。这表示分析已完成。同样，iTACS 要求用户选择位置目录。然后，用户可以选择映射力数据，创建力数据的图像，映射速度数据以及创建速度数据的图像。重要的是要注意，创建图像确实需要时间，因此可以选择现在就做或等待以后再做。这就是为什么用户可以选择或不选择选项的原因。在这里，iTACS 要求用户再次确定相邻区域的大小，您可以使用您为映射强度确定的相同大小，在本例中为 60 像素。同样，系统会要求用户收集像元及其邻近区域的属性。这表示分析已完成。在单层应力显微镜或 MSM 下拉菜单中，选择结果跟踪数据。首先，iTACS 要求用户选择位置目录，也称为 P0 文件夹。完成后，单击"选择"。在这里，iTACS 询问用户希望 iTACS 从哪个帧号开始跟踪数据。从第二帧开始跟踪是非常安全的，因为无法确定第一帧的速度。在这里，iTACS 要求用户指示要同时填充的最大绘图数。从本质上讲，这是一种加快数据跟踪的方法。完成后，单击"确定"（OK），用于在跟踪期间选择变量的选项将以与生成热图的选项类似的方式显示。感兴趣的常见属性在窗口顶部的文本框中提供。但是，如果要自定义变量，只需删除文本框中的所有内容，然后选择下面列出的特定属性即可。在单层应力显微镜或 MSM 下拉菜单中，选择结果图。之后，iTACS 会询问用户是否要将绘图限制为具有不间断轨迹的单元格。如果不想将绘图限制为不间断的轨迹，请单击"否"。但是，如果您确实希望将打印限制为具有不间断轨迹的单元格，请单击"是此处 iTACS"询问用户希望程序绘制多少个变量。iTACS 最多可以绘制三个变量，在本例中，我们只绘制两个变量来查看这些因子之间的关系。在单层应力显微镜或 MSM 下拉菜单中，选择结果图片。下面是位置目录，完成后，单击"选择"。然后，iTACS 要求我们选择起始帧。在这里，我们选择了第二帧。用于制作热图的选项以与绘制单个像元的时间轨迹的选项类似的方式呈现。有了这个，我们总结了如何制作热图。这里表示细胞骨架张力中细胞速度的时间痕迹，用于细胞编号。这些属性显示在共享的垂直轴上，水平轴指示时间实例编号，其中帧以 15 分钟的间隔获取。第二个输出是实验开始一小时的热图数组。此处显示的属性包括扩散面积、方向、圆度、速度、运动方向、最大张力取向、细胞骨架张力、底物牵引和单个细胞的张力各向异性。所以这是对一组实验的一瞥。还有其他几种实验情况，其中AnViM和AcTrM可以帮助用户可重复地进行实验，这些联系人在手稿中列出。iTACS的一些关键功能包括实验方案的自动化，自动化数据分析，并且不需要工程背景。

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