Name: integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence
Uploaded: 2022-03-05T15:00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence at JoVE.com

D.T.T. bedankt medewerkers verbonden aan het Center for Lung Biology aan de University of South Alabama voor het stimuleren van discussies over de experimentele celbiologische onderzoeksbehoeften. Deze discussies waren cruciaal bij het initiëren van de ontwikkeling van iTACS.
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het National Institute of Health / National Heart Lung Blood Institute, P01 HL66299 en R37 HL60024 (Stevens), R01-HL118334 (Alvarez), F32-HL144040-01 (Xu), en van de University of South Alabama via Abraham Mitchell Cancer Research Fund (Singh, Palanki, Tambe), Research and Scholarly Development Grant (Tambe), Honors College en Summer Undergraduate Research Fellow (Nguyen).

<ol>
	<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces.">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li><li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+stress+microscopy:+limitations,+artifacts,+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses.">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PloS One. 8 (2), 55172 (2013).</li><li>Das, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+mechanotransduction+pathway+regulates+collective+migration+of+epithelial+cells.">A molecular mechanotransduction pathway regulates collective migration of epithelial cells.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 276-287 (2015).</li><li>Vedula, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+epithelial+closure+over+non-adherent+environments.">Mechanics of epithelial closure over non-adherent environments.</a> Nature Communications. 6, 6111 (2015).</li><li>Lamason, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rickettsia+Sca4+reduces+vinculin-mediated+intercellular+tension+to+promote+spread.">Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread.</a> Cell. 167 (3), 670-683 (2016).</li><li>Sunyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+durotaxis+emerges+from+long-range+intercellular+force+transmission.">Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission.</a> Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).</li><li>Dong, L., Oberai, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+cellular+traction+in+three-dimensional+nonlinear+hyperelastic+matrices.">Recovery of cellular traction in three-dimensional nonlinear hyperelastic matrices.</a> Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering. 314, 296-313 (2017).</li><li>Nier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kalman+inversion+stress+microscopy.">Kalman inversion stress microscopy.</a> Biophysical Journal. 115 (9), 1808-1816 (2018).</li><li>Serrano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+Monolayer+Stress+Microscopy.">Three-dimensional Monolayer Stress Microscopy.</a> Biophysical Journal. 117 (1), 111-128 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+Image+Analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of Image Analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji+-+an+Open+Source+platform+for+biological+image+analysis.">Fiji - an Open Source platform for biological image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+microManager.">Computer control of microscopes using microManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 20 (2010).</li><li>Patel, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+shear:+Role+of+intercellular+traction+and+cellular+moments+in+collective+cell+migration.">Unleashing shear: Role of intercellular traction and cellular moments in collective cell migration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (2), 279-285 (2020).</li><li>Yeung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology,+cytoskeletal+structure,+and+adhesion.">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li><li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+forces+during+collective+cell+migration.">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li><li>Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+complaint+matrices+for+quantifying+cellular+contraction.">Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), (2010).</li><li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes.">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvascular Research. 67 (2), 139-151 (2004).</li><li>Patel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+in+a+pulmonary+microvascular+endothelial+cell+monolayer.">Mechanical signaling in a pulmonary microvascular endothelial cell monolayer.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 519 (2), 337-343 (2019).</li><li>K&#228;hler, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Main+results+of+the+4th+International+PIV+Challenge.">Main results of the 4th International PIV Challenge.</a> Experiments in Fluids. 57 (6), 97 (2016).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Alvarez-Gonzalez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-layer+elastographic+3-D+traction+force+microscopy.">Two-layer elastographic 3-D traction force microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 39315 (2017).</li><li>Makarchuk, S., Beyer, N., Gaiddon, C., Grange, W., Hebraud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+traction+force+microscopy.">Holographic traction force microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3038 (2018).</li><li>Janmey, P. A., Miller, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mechanical+signaling+in+development+and+disease.">Mechanisms of mechanical signaling in development and disease.</a> Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).</li><li>Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+traction+stresses+exerted+by+locomoting+cells+with+the+elastic+substratum+method.">Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method.</a> Biophysical Journal. 70 (4), 2008-2022 (1996).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li><li>Saez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+exerted+by+epithelial+cell+sheets.">Traction forces exerted by epithelial cell sheets.</a> Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194119 (2010).</li><li>Deforet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+velocity+mapping+of+migrating+cell+populations+(AVeMap).">Automated velocity mapping of migrating cell populations (AVeMap).</a> Nature Methods. 9 (11), 1081-1083 (2012).</li><li>Polio, S. R., Smith, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+hydrogels+for+simplified+measurement+of+cell+traction+forces.">Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces.</a> Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).</li><li>Toyjanova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Viscoelastic+traction+force+microscopy.">3D Viscoelastic traction force microscopy.</a> Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).</li><li>Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+forces+and+kinematics+during+collective+cell+migration.">Mapping forces and kinematics during collective cell migration.</a> Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).</li><li>Charrier, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+make+viscoelastic+polyacrylamide+gels+for+cell+culture+and+traction+force+microscopy.">A novel method to make viscoelastic polyacrylamide gels for cell culture and traction force microscopy.</a> APL Bioengineering. 4 (3), 036104 (2020).</li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Aanhangende cellen gebruiken zowel mechanische als chemische signalen om te overleven, te groeien en te functioneren. Een breed scala aan microscopiesoftware optimaliseert de gebruikerservaring bij het beoordelen van de chemische signalen door middel van fluorescentiegebaseerde beeldvorming. Bij de beoordeling van de mechanische signalen zijn echter mogelijkheden betrokken die niet beschikbaar zijn in de standaard microscopiesoftware. Bovendien is de beoordeling van mechanische signalen het meest efficiënt wanneer data-acquisitie wordt geïntegreerd met data-analyse. Het ontbreken van een uniform platform dat voldoet aan de unieke behoeften van mechanische signaalbeoordeling is een belangrijke technologische leemte in de experimentele celbiologie. De Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) is ontworpen om deze kloof te dichten. De twee componenten van iTACS, AnViM en AcTrM, voorzien gebruikers van de nodige mogelijkheden om cellulaire eigenschappen van vier brede categorieën te kwantificeren: krachten, beweging, morfologie en fluorescentie / helderheid. In deze categorieën is iTACS momenteel in staat om meer dan 50 unieke aspecten van individuele adherente cellen te onthullen. Deze aspecten omvatten specifieke eigenschappen van elke brede categorie, inclusief hun representatieve waarde en variabiliteit in de cel (aanvullende tabel S1). Binnen de krachten zijn er bijvoorbeeld trekkrachten over het cytoskelet, anisotropie van deze spanning, de oriëntatie van maximale spanning en schuifspanning over de cel-ECM-interface die een diepgaande invloed heeft op het gedrag van aanhangende cellen1,3,6.
Een nieuwe benadering om het mechanische gedrag van individuele cellen van een monolaag te onderzoeken Individuele cellen van een monolaag zijn bezig met een uitwisseling van signalen van chemische en mechanische aard3. Deze twee soorten signalen worden op een andere manier over de cellulaire monolaag verzonden23. De kennis van mechanische signaaloverdracht blijft echter achter bij die van chemische signaaloverdracht. Deze kenniskloof valt samen met een aanhoudend gebrek aan eenvoudige en intuïtieve benaderingen om cellulaire mechanische signalen te beoordelen. De nieuwe data mapping-aanpak die hier wordt beschreven, is uitgerust om deze leemte op te vullen. Een dergelijke mapping onthult dat fluctuatie van intrinsieke cytoskeletale spanning in het naburige gebied van een cel dient als ontspannings-, fluidisatie- en verankeringssignalen die veranderingen in cellulaire vorm, grootte en snelheid van de cel reguleren18. Kaarten van de eigenschappen van aangrenzende regio's vertonen "meercellige onderverdelingspatronen" waarbij cellen binnen de onderverdeling worden blootgesteld aan een relatief uniforme micro-omgeving en de cellen aan de grens van de onderverdeling worden blootgesteld aan een opmerkelijk niet-uniforme micro-omgeving18.
Toegankelijkheid van de krachtmeettechnologie Er bestaat een verscheidenheid aan protocollen om PAA-hydrogels te maken, hydrogelvervorming en cellulaire beweging te analyseren en cel-ECM en celcelkrachten1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27 te kwantificeren ,28,29,30,31,32. Deze ontwikkelingen blijven echter buiten het bereik van gemeenschappelijke celbiologische laboratoria en beperkt tot laboratoria met technische expertise. Door de technische aspecten van deze benaderingen te automatiseren en te integreren onder een uniform en gebruiksvriendelijk platform, is het doel van iTACS om de beoordeling van mechanische signalen een routineactiviteit te maken in experimenteel celbiologisch onderzoek en onderwijs.
ImageJ stelt gebruikers in staat om applicaties te ontwikkelen met behulp van benaderingen die weinig of geen training vereisen11. iTACS is grotendeels gebouwd met behulp van eenvoudige scripting-benaderingen om community-driven voortdurende ontwikkeling te vergemakkelijken. Een groot deel van AcTrM wordt geprogrammeerd met behulp van BeanShell-scripts en het grootste deel van AnViM wordt geprogrammeerd met ImageJ Macros. Deze scripts en richtlijnen voor het implementeren van deze mogelijkheden op de microscoop van de gebruiker zijn beschikbaar via GitHub (<a href="https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS" style="font-size: 14px;" target="_blank">https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS</a>).
Kwaliteitsstandaardisatie van de verkregen beelden Hoewel de op elastisch substraat gebaseerde technieken om fysieke krachten in aanhangende cellen te kwantificeren in verschillende laboratoria zijn ontwikkeld en geïmplementeerd, mist het protocol nog steeds standaardisatie. Een gebied dat het meest moet worden gestandaardiseerd, is de kwaliteit van de verkregen afbeeldingen van de bovenste kralen (aanvullende figuur S1). Belangrijke problemen komen voort uit de verschuiving in focus gedurende het experiment. Onze nieuwe op referentiebeelden gebaseerde heroriëntatiebenadering maakt zo'n focus een objectief proces. De parameters die in de allereerste stap van AcTrM zijn gedefinieerd, leggen de nodige objectieve kwaliteitslimieten op. Andere standaardisatiemaatregelen kunnen worden geprogrammeerd in toekomstige versies van AcTrM.
De brede toepasbaarheid van iTACS Naast het kwantificeren van tal van aspecten van adherente cellen, vergemakkelijkt de iTACS-structuur het gebruik ervan voor verschillende experimentele protocollen en behoeften. AcTrM maakt softwaregestuurde zelftraining van gebruikers mogelijk. Snelle beeldvorming die vereist is door bijvoorbeeld gelijktijdige beoordeling van cytoplasmatische calciumfluctuaties wordt momenteel beperkt door de snelheid van herpositionering en heroriëntatie van hardware en kan het beste op één locatie tegelijk worden uitgevoerd. De huidige implementatie is echter goed uitgerust voor langetermijnbeeldvorming, onderbroken beeldvorming, waarbij het monster gedurende de gehele duur van het experiment niet op het microscoopstadium kan worden gehouden. Omdat de referentiebeelden aan het begin van het experiment worden verkregen, maakt iTACS real-time beeldvorming van mechanische signalen mogelijk, waardoor nieuwe wegen worden geopend in toepassingen voor geneesmiddelenscreening. AnViM stelt gebruikers in staat om zeer technische informatie te verstrekken in lekentermen. Het vermogen om een breed spectrum van cellulaire eigenschappen te kwantificeren en ze gedurende het hele experiment te volgen, vormt kritieke mogelijkheden die nodig zijn om nieuwe intercellulaire communicatiemechanismen te ontdekken.
Voor de toekomstige ontwikkeling van iTACS hebben we vier aandachtsgebieden geïdentificeerd: (1) verbetering van de snelheid van gegevensverzameling en gegevensanalyse, (2) implementatie van benaderingen om nieuwe cellulaire signalen te beoordelen13, (3) ontwikkeling van workshops en onderwijsmodules over iTACS-gebaseerde cellulaire signaalbeoordeling, (4) ontwikkeling van goedkope automatiseringsoplossingen.

Veelgebruikte optische beeldvormings- en data-analysetools maken gebruik van hardware- en softwaretechnologieën die bijna verouderd zijn. De vertraging in de vertaling en implementatie van vooruitgang in elektronische apparaten, computationele benaderingen en wiskundige analyse in gemeenschappelijke experimentele celbiologische hulpmiddelen is een belangrijke beperking voor het groeitempo van onze kennis van cellulaire fysiologie. Momenteel vinden celbiologische onderzoekers moleculair biologische hulpmiddelen binnen handbereik, maar tools op basis van technische principes zijn buiten bereik. Een van die op engineeringprincipes gebaseerde tools is Monolayer Stress Microscopy (MSM)1,2. Hoewel MSM is aangepast en bestudeerd in verschillende laboratoria over de hele wereld, is het gebruik ervan voornamelijk beperkt tot laboratoria met technische expertise3,4,5,6,7,8,9.
NIH-ImageJ is een van de meest populaire open-source tools onder celbiologische onderzoekers10. Door bijdragen van de gebruikersgemeenschap zijn verbeteringen centraal komen te staan in de populariteit11,12. ImageJ heeft functies waarmee gebruikers applicaties kunnen ontwikkelen met een mix van een geavanceerde programmeertaal en vereenvoudigde scriptbenaderingen. Deze functies vergemakkelijken gebruikers met basisprogrammeerkennis om elke nieuwe bijdrage aan de software te implementeren, aan te passen en te bevorderen. Voortbouwend op deze kwaliteiten van NIH-ImageJ, hebben we de Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) ontwikkeld, die een goedkope integratie van gewenste hardware- en softwaretools mogelijk maakt om de meting van een breed scala aan chemische en mechanische signalen over adherente cellen te automatiseren11,12.
iTACS bestaat uit twee componenten: Acquisitie- en Trainingsmodule (AcTrM) en Analyse- en Visualisatiemodule (AnViM). AcTrM is gebouwd op μManager - een op NIH-ImageJ gebaseerde beeldacquisitietoepassing - om gebruikers in staat te stellen time-lapse-metingen van traditionele optische eigenschappen en een verscheidenheid aan fysieke eigenschappen van adherente cellen in meerdere monsters in te stellen12. AcTrM vergemakkelijkt gebruikerstraining door middel van beknopte aanwijzingen in de grafische interface. Bovendien heeft het een nieuw kenmerk van op referentiebeelden gebaseerde autofocus die is ontworpen om realtime metingen van fysieke krachten te vergemakkelijken en kwaliteitsstandaardisatie van de verkregen gegevens mogelijk te maken.
AnViM is gebouwd op ImageJ-plug-ins, versnelde software en scripts voor bestandsafhandeling waarmee gebruikers meer dan 50 eigenschappen kwantitatief kunnen beoordelen, waaronder cellulaire vorm, grootte, oriëntatie, snelheid en bewegingsrichting, tracties uitgeoefend op de extracellulaire matrix (ECM) en op naburige cellen, contractiele en afschuifmomenten van zowel individuele adherente cellen als hun aangrenzende regio. AnViM faciliteert gebruikers om de cellulaire fysieke eigenschappen te kwantificeren zonder de onderliggende technische achtergrond onder de knie te krijgen11. Bovendien maakt het gegevensanalyse mogelijk in een interactieve of batchverwerkingsmodus. Het genereert heatmaps die ruimtelijke variatie onthullen en grafieken die de temporele variatie van de eigenschappen van individuele cellen laten zien.
In een typisch experiment kweekt de gebruiker cellen op een elastische hydrogel met geschikte extracellulaire matrixeiwitten op het bovenste oppervlak en twee soorten ingebedde fluorescerende markers. In wezen zijn beelden van deze fluorescerende markers voor en na het kweken van de cellen voldoende om de krachten in en rond individuele cellen te kwantificeren2,13. AnViM brengt deze resultaten in kaart op individuele cellen van de aanhangende cluster en genereert inzichtelijke beelden en grafieken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97%</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
			<td>13822565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98%</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2530850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates</td>
			<td>MatTek or CellVis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde, EM Grade, 25%</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>1909100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1002074706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in preparing suitable hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7222301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rain-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>CovaChem</td>
			<td>102568434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope hardware used in the current study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H117 ProScanTM Stages</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5</td>
			<td>Sutter instrument company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>550372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan III Universal Microscope Automation Controller</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Focus Drive</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence

Kwantitatieve beoordeling van cellulaire krachten en beweging is de afgelopen vier decennia aanzienlijk verbeterd. Deze ontwikkelingen boden het kader om inzichtelijke mechanische signaleringsprocessen in celkweeksystemen te onderzoeken. Het veld wordt momenteel echter geconfronteerd met drie problemen: gebrek aan kwaliteitsstandaardisatie van de verkregen gegevens, technische fouten in gegevensanalyse en visualisatie, en misschien wel het belangrijkste, de technologie blijft grotendeels buiten bereik voor gemeenschappelijke celbiologische laboratoria. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een nieuw experimenteel platform ontwikkeld - Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS). iTACS bestaat uit twee componenten: Acquisitie- en Trainingsmodule (AcTrM) en Analyse- en Visualisatiemodule (AnViM). AcTrM is gebaseerd op μManager - een op NIH-ImageJ gebaseerde microscoopbesturingssoftware - en vergemakkelijkt zelftraining en automatisering van gemeenschappelijke beeldacquisitieprotocollen. AnViM is gebaseerd op NIH-ImageJ en faciliteert gebruiksvriendelijke automatisering van data-analyse en inzichtelijke visualisatie van resultaten. Deze experimenten omvatten het kweken van adherente cellen op hydrogels, het afbeelden van fiduciale markers ingebed in de hydrogel en uiteindelijk het extraheren uit deze afbeeldingen van een uitgebreide mechanische karakterisering van de cellen. Momenteel stelt iTACS de gebruiker in staat om een breed scala aan eigenschappen te analyseren en te volgen, waaronder morfologie, beweging, cytoskeletale krachten en fluorescentie van individuele cellen en hun naburige regio. Het probleem met kwaliteitsstandaardisatie werd in AcTrM opgelost met een referentiebeeldgestuurde herfocussingstechniek. De technische problemen in data-analyse werden in AnViM aangepakt met een veelzijdige beeldsegmentatieprocedure, een gebruiksvriendelijke aanpak om randvoorwaarden te identificeren en een nieuwe op cellulaire eigenschappen gebaseerde datavisualisatie. AcTrM is ontworpen om de eenvoudige transformatie van basisfluorescentiemicroscopen in experimentele celmechanica-rigs te vergemakkelijken, en AnViM is uitgerust om gebruikers in staat te stellen cellulaire mechanische signalen te meten zonder een technische achtergrond te vereisen. iTACS zal beschikbaar zijn voor de onderzoeksgemeenschap als een open-source suite met community-gedreven ontwikkelingsmogelijkheden.

Watch this Scientific Journal Video about Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence at JoVE.com

Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence

Het Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) platform automatiseert het proces van het gelijktijdig meten van een breed scala aan chemische en mechanische signalen in aanhangende cellen. iTACS is ontworpen om community-driven ontwikkeling te vergemakkelijken en onderzoekers in staat te stellen alle platformfuncties te gebruiken, ongeacht hun educatieve achtergrond.

Integratieve toolkit om cellulaire signalen te analyseren: krachten, beweging, morfologie en fluorescentie

Quantitative assessment of cellular forces and motion advanced considerably over the last four decades. These advancements provided the framework to ...

Adherente cellen oefenen krachten uit op hun omgeving, en die krachten omvatten de krachten die cellen uitoefenen op het substraat, hier weergegeven in groen, en de krachten die cellen uitoefenen op hun buren, weergegeven in rood. Deze krachten kunnen worden gemeten in cellulaire monolagen met behulp van een techniek die monolaagstressmicroscopie wordt genoemd. Kortom, de techniek omvat het bereiden van hydrogels met kleine fluorescerende kralen, net onder het bovenste oppervlak, en grote fluorescerende kralen die op het glas zijn gelijmd.Op deze hydrogel ziet men de cellen en kweekt ze samenvloeien of welke toestand men ook wenst om krachten te meten. Het meten van krachten vereist het in beeld brengen van de cellulaire monolaag, het nemen van doorgelaten lichtbeelden van de cellen en fluorescerende lichtbeelden van de kleine en grote kralen. Elk van deze beelden wordt verworven in hetzelfde vocale vlak.Deze beelden worden verkregen wanneer de cellen worden bevestigd en losgemaakt van de hydrogel. En een vergelijking van deze twee sets beelden levert ons de gegevens op die nodig zijn om al deze krachten te kwantificeren. Dat is waar AcTrM en AnViM in het spel komen.Nadat u de cellen hebt geplateerd, zodat u afbeeldingen op exact dezelfde locatie kunt verkrijgen, op elk gewenst moment, wordt dat protocol geprogrammeerd in AcTrM en vervolgens deze gegevens analyseren en de resultaten visualiseren, dat is het doel van AnViM. In de komende paar minuten zullen we u door het proces leiden van het verkrijgen van beelden voor een samenvloeiingscelmonolaag. Actie stap nul vraagt de gebruiker om het acquisitietype te selecteren.Een nieuwe acquisitie om een nieuw experiment te starten, of een verdere acquisitie om een eerder experiment te hervatten. Klik op Nieuwe acquisitie om een positielijst te maken. Actie stap één geeft een overzicht van al uw volgende stappen.En deze acties worden uitgevoerd in het venster van de lijst met podiumposities hier. Klik op Live in Micro-Manager om het voorbeeld te visualiseren voor handmatige aanpassingen. In live view kijken we naar de fase.Hier is het duidelijk. Nu zal men naar de kralen moeten kijken. Hier kunnen de kralen worden gevisualiseerd in fluorescentie.Selecteer dus het kanaal dat geschikt is voor de bovenste kralen. Het is ook belangrijk dat je een paar bodemkralen kunt zien, dus laten we eens kijken naar een kanaal voor de onderste kralen. Wat je hier ziet is een wazig beeld van bodemkralen, en dat is helemaal prima zolang je kunt zien dat de onderste kralen er zijn, wat je in deze afbeelding kunt doen.Positielijst, klik op Markeren. Zo maak je een positielijst. Nadat u een positielijst hebt gemaakt, die in de vorige video is besproken, volgt u de stappen die worden vermeld in actie stap twee met behulp van het multidimensionale acquisitievenster.Laten we zeggen dat we een lange time-lapse willen uitvoeren. Hier ga ik aangeven hoeveel foto's we willen maken. Het eerste kanaal wordt het fasekanaal.De volgende zal van de bovenste kralen zijn en de volgende zal de onderste kralen zijn. Klik op sluiten in het multidimensionale acquisitievenster en klik op OK in AcTrM stap twee. De uitvoer wordt opgeslagen in de map die wordt geïdentificeerd in het multidimensionale acquisitievenster.Actie stap drie zal vragen of het experiment herstel nodig heeft. Het antwoord zal meestal ja zijn. Hier vraagt iTACS, willen we een verfijnd herstel uitvoeren?Dit eerste deel zal ons vrij dicht bij een verfijnd herstel brengen, maar het onderste deel zal ons nog dichter bij een hogere nauwkeurigheid van herpositionering brengen. Als het herstel wordt uitgevoerd met een beperkt gezichtsveld, wordt deze optie aangeboden, maar voor dit experiment selecteren we die optie niet. Op dit punt is de verwerving van een reeks referentiebeelden voltooid en kan Micro-Manager worden gesloten.Voor beeldacquisitie start men AcTrM. Selecteer de vergroting en kies de map die gegevensmappen bevat. Selecteer keuzes voor het herpositioneren van de plaat samen met het kanaal dat wordt gebruikt voor herpositionering.Er is een interface voorzien om wat er momenteel in de camera te zien is af te stemmen op de opgeslagen beelden. Als er overlap is, geven de afbeeldingen een rode en groene kleur weer samen met zwart en kan handmatige aanpassing worden uitgevoerd. Anders druk je op accepteren en gaat de acquisitie door.We kunnen nu beginnen met FIJI. Selecteer de eerste optie in het vervolgkeuzemenu MSM met het label voorbewerking. Selecteer vervolgens de map met de map tnimgs.Vervolgens zullen we moeten definiëren welk kanaal overeenkomt met welk beeld. Voor dit voorbeeld is kanaal 0 het doorgelaten lichtbeeld dat het fasecontrastbeeld van de cellen is. De onderste kraalafbeelding is kanaal 2 en de bovenste kraalafbeelding is kanaal 1.En dan is het je vragen waar de cellen elkaar kruisen en welke kant van het beeld. In dit geval zijn de cellen een monolaag die naar de rechterrand oprukt, dus we zullen Rechts deselecteren en doorgaan. Hier dient een klein gebied van bovenste kralen, ver van de monolaag, hetzelfde doel als onderste kraalafbeeldingen die spaarzamer en groter lijken dan die hier worden getoond.Nu vraagt het ons of we de helderheid en het contrast willen veranderen, zodat de kralen prominent verschijnen. Dus we passen ons aan met behulp van de schuifbalken in het menu en zodra de kralen prominent verschijnen, klikt u op OK. En nu gaan we positiecorrectie doen. Als er een verschuiving is, zal het er vanaf komen.En nadat het klaar is, wordt de analysemap gemaakt. In de analysemap wordt de positiemap, P0, gemaakt en de keuzes die we in de vorige voorbewerkingsmenu's hebben gemaakt, worden opgeslagen in analysekeuzen, zoals welke randen zijn gekruist, pixelgrootte en welke afbeelding fasecontrast is en andere. Selecteer in de monolaagstressmicroscopie of het msm-vervolgkeuzemenu de optie MSM-gelvervorming.Vanaf hier selecteren we de optie die geschikt is voor onze kralendistributie. En terwijl de gegevens worden verwerkt, kunt u zien dat er een nieuwe verplaatsingsmap in de positiemap is verschenen. Dit is waar alle uitvoerbestanden worden opgeslagen.Dit geeft aan dat de analyse compleet is. We gaan kijken hoe we de krachten kunnen berekenen die worden uitgeoefend over de cel-ECM-junctie en cel-celverbinding en ook het cytoskelet van individuele cellen van de monolaag. Selecteer daarvoor de derde optie.En men gaat de map kiezen die tnimgs en de analysemap bevat, wat betekent dat men de voorbeeldmap selecteert in plaats van een van deze mappen. Druk op selecteren en het zal je vragen, wat is de schuifmodulus van deze gel? De schuifmodulus is 1250 en de dikte van de hydrogel in dit voorbeeld is 118 micron.Het verwachte geluidsniveau wordt hier gegeven. Dan is er een gemiddelde verplaatsing is nulvlag, die in dit geval niet wordt gecontroleerd. Selecteer OK en de implementatie die tractie berekent, wordt uitgevoerd via een MATLAB-functie, en dat is hoe deze wordt geïmplementeerd in deze versie van AnViM.Nu is het klaar om de berekening voor celcel- of cytoskeletkrachten uit te voeren. En de eerste vraag die je moet stellen is, is de monolaag confluent? In dit specifieke geval hebben we een voortschrijdende monolaag en is er een geen celgebied aan de rechterkant van het frame.Dus het antwoord is dat de monolaag niet samenvloeit, dus we gaan nee zeggen. Nu wordt ons gevraagd om een veelhoek te tekenen rond het grootste niet-celobject. We selecteren de juiste methoden voor segmentatie.Hier vraagt het ons om de kleur van de cellen aan te geven in methoden drie en vier, dus hier zijn de cellen zwart, dus we zullen zwart kiezen. De segmentatie die wordt geproduceerd uit deze verschillende methoden eindigt met enkele gaten in de celmonolaag en enkele witte gebieden in het geen-celgebied. Hier kunnen we kiezen, plekken automatisch opvullen en op OK.So nu zijn alle plekken opgevuld in de monolaag en geen celgebied.En dan berekenen we de mechanische spanningen in de cellulaire monolaag. We hebben al deel één uitgevoerd waar we de cellen uit het geen celgebied hebben gesegmenteerd, dus we beginnen deze stap met deel twee dat is segmentatie van de individuele cellen en de afbeeldingen. Men gaat segmentatie selecteren voor individuele cellen.En hier vraagt het ons om de positiedirectory te kiezen. En er is hier wat meer informatie gegeven voor deze parameters. Vervolgens wordt je gevraagd om een veelhoek rond de kleinste normale cel te tekenen.Dus wat je hier tekent, wordt gebruikt om het oppervlak te berekenen en het zal bepalen dat alles wat kleiner is dan dit niet als een cel wordt gedefinieerd. En vervolgens vraagt het om de grootste cel. Dus dan tekenen we een veelhoek rond de grootste normale cel, en dan vraagt het, welke is helderder?Is de cel-cel interface helderder of zijn de celcentra helderder? Dus in dit geval is de cel-cel interface helderder, dus ik ga cel-cel interface selecteren. Dit geeft dus aan dat de berekening is afgerond.Laten we beginnen met het selecteren van een kaart op celintensiteiten. Eerst vraagt iTACS de gebruiker om de positiemap te selecteren, die ook bekend staat als de P0-map. Als u klaar bent, klikt u op Selecteren.Vervolgens wordt de gebruiker gevraagd of hij of zij wil dat iTACS celdeling detecteert of cellulaire fluorescentie kwantificeert. In dit geval hebben we geen fluorescerende eiwitten in de cel, dus daarom zullen we ervoor kiezen om celdeling te detecteren. Met de volgende dia kan de gebruiker de grootte van het aangrenzende gebied definiëren, dit is een unieke analyse die AnViM uitvoert waarbij wordt gekeken naar de eigenschappen van individuele cellen en de eigenschappen van het aangrenzende cellengebied.Hier kan de gebruiker de breedte van een aangrenzend cellengebied kiezen. In dit geval definiëren we de aangrenzende regio's met 60 pixels. Het eerste selectievakje vraagt of we willen dat iTACS eigenschappen van de cellen verzamelt, ja dat doen we, en dit selectievakje vraagt of we willen dat iTACS eigenschappen van de buren verzamelt, ja, we willen dat iTACS dat ook doet.Onder deze selectievakjes biedt iTACS meer informatie over de selectievakjes als de gebruiker meer informatie over elk selectievakje wil. Dit geeft aan dat de analyse compleet is. Nogmaals, iTACS vraagt de gebruiker om de positiemap te selecteren.Vervolgens krijgt de gebruiker de keuze om krachtgegevens in kaart te brengen, afbeeldingen van de krachtgegevens te maken, snelheidsgegevens in kaart te brengen en afbeeldingen van de snelheidsgegevens te maken. Het is belangrijk op te merken dat het maken van afbeeldingen tijd kost, dus men kan ervoor kiezen om het nu te doen of te wachten om het later te doen. Daarom krijgt de gebruiker de mogelijkheid om de keuzes te selecteren of niet.Hier vraagt iTACS de gebruiker om de grootte van het naburige gebied opnieuw te bepalen en u kunt dezelfde grootte gebruiken die u hebt bepaald voor toewijzingsintensiteiten, in ons geval 60 pixels. En nogmaals, de gebruiker wordt gevraagd om eigenschappen van de cellen en het naburige gebied te verzamelen. Dit geeft aan dat de analyse compleet is.Selecteer in het vervolgkeuzemenu monolaagstressmicroscopie of MSM de optie resultaten bijhouden van gegevens. Eerst vraagt iTACS de gebruiker om de positiemap te selecteren, die ook bekend staat als de P0-map. Als u klaar bent, klikt u op Selecteren.Hier vraagt iTACS welk framenummer de gebruiker wil dat iTACS gegevens gaat bijhouden. Het is vrij veilig om te beginnen met volgen vanaf frame nummer twee, omdat de snelheid niet kan worden bepaald voor frame nummer één. Hier vraagt iTACS de gebruiker om het maximale aantal percelen aan te geven dat tegelijkertijd moet worden gevuld.En in wezen is dit een manier om het bijhouden van gegevens te versnellen. Als u klaar bent, klikt u op OK en de opties voor het kiezen van variabelen tijdens het bijhouden worden op dezelfde manier gepresenteerd als de opties voor het genereren van heatmaps. Algemene interessante eigenschappen worden weergegeven in het tekstvak boven aan het venster.Maar als u uw variabelen wilt aanpassen, hoeft u alleen maar alles in het tekstvak te verwijderen en de specifieke eigenschappen hieronder te selecteren. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Monolayer Stress-microscopie of MSM de optie Resultatenplot. Daarna vraagt iTACS de gebruiker of de gebruiker het plotten wil beperken tot cellen met ononderbroken track.Als u het plotten niet wilt beperken tot ononderbroken tracks, klikt u op Nee.Maar als u het plotten wilt beperken tot cellen met ononderbroken tracks, klikt u op Ja Hier iTACS vraagt hoeveel variabelen de gebruiker wil dat het programma plot. iTACS is in staat om maximaal drie variabelen uit te zetten, en in dit geval zullen we slechts twee variabelen plotten om de relatie tussen die factoren te zien. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Monolayer Stress-microscopie of MSM de optie Resultatenafbeelding.Hier is de positiemap en als u klaar bent, klikt u op Selecteren. iTACS vraagt ons vervolgens om het startframe te kiezen. Hier selecteerden we frame nummer twee.De opties voor het maken van heatmaps worden op dezelfde manier gepresenteerd als de opties voor het plotten van tijdsporen van individuele cellen. Daarmee concluderen we hoe we een heatmap kunnen maken. Hier vertegenwoordigt het tijdsspoor van cellulaire snelheid in cytoskeletale spanning voor cel nummer één.De eigenschappen worden weergegeven op een gedeelde verticale as en de horizontale as geeft het tijdinstantienummer aan, waarbij de frames met intervallen van 15 minuten worden verkregen. De tweede output is een reeks heatmaps een uur na het experiment. De hier getoonde eigenschappen omvatten verspreidingsgebied, oriëntatie, circulariteit, snelheid, bewegingsrichting, maximale spanningsoriëntatie, cytoskeletspanning, substraattractie en spanningsanisotropie van individuele cellen.Dit is dus een inkijkje in één reeks experimenten. Er zijn verschillende andere experimentele situaties waarin AnViM en AcTrM de gebruiker kunnen helpen het experiment reproduceerbaar uit te voeren en deze contacten worden vermeld in het manuscript. Enkele van de belangrijkste kenmerken van iTACS zijn automatisering van het experimentele protocol, geautomatiseerde gegevensanalyse en er is geen technische achtergrond vereist.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Micro-injectie van de zebravis embryo&#39;s Gene functie analyseren

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Een analytisch instrument dat cellulaire morfologie Veranderingen van Drie-dimensionale Fluorescentie afbeeldingen kwantificeert

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Meting van de levensduur in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse van autofagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Door gebruikmaken van uithongering pads in combinatie met fluorescentiemicroscopie

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Implementeren Patch Clamp en Live-fluorescentie microscopie om functionele eigenschappen van vers geïsoleerde PKD Epithelium Monitor

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

Lokale Field fluorescentiemicroscopie: Beeldvorming van cellulaire signalen in Intact Hearts

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...