Name: integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence
Uploaded: 2022-03-05T15:00:00
Duration: 14 min 55 s
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D.T.T.は、実験的な細胞生物学研究のニーズに関する議論を刺激してくれた南アラバマ大学肺生物学センターに所属するスタッフに感謝します。これらの議論は、iTACSの開発を推進する上で極めて重要でした。
この研究は、国立衛生研究所/国立心臓肺血液研究所からの助成金によって部分的に支えられました。 P01 HL66299およびR37 HL60024(スティーブンス)、R01-HL118334(アルバレス)、F32-HL144040-01、南アラバマ大学からエイブラハム・ミッチェルがん研究基金(シン、パランキ、タンベ)、研究・学術助成金(タンベ)、研究・学術助成金(タンベ)、名誉大学、研究助成金(タンベ)、サマー・カレッジ、サマー・グラント・リサーチ・フェロー(N)。

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+hydrogels+for+simplified+measurement+of+cell+traction+forces.">Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces.</a> Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).</li><li>Toyjanova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Viscoelastic+traction+force+microscopy.">3D Viscoelastic traction force microscopy.</a> Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).</li><li>Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. 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著者らは利益相反を宣言しない。

接着細胞は、生き残るために機械的および化学的信号の両方を使用して、成長し、機能します。多種多様な顕微鏡ソフトウェアは、蛍光ベースのイメージングを通じて、化学的シグナルを評価する際のユーザエクスペリエンスを最適化します。ただし、機械的信号の評価には、標準の顕微鏡ソフトウェアでは使用できない機能が含まれます。さらに、データ取得とデータ分析を統合する場合、機械的信号の評価が最も効率的です。機械的信号評価の独自のニーズを満たす統一されたプラットフォームの欠如は、実験細胞生物学における主要な技術的ギャップとなっています。細胞信号を分析する統合ツールキット (iTACS) は、このギャップを満たすように設計されています。ITACSの2つのコンポーネント、AnViMとAcTrMは、4つの大きなカテゴリーの細胞特性を定量化するために必要な機能をユーザーに提供します:力、運動、形態、蛍光/輝度。これらのカテゴリー全体で、iTACSは現在、個々の接着細胞の50以上のユニークな側面を明らかにすることができます。これらのアスペクトは、各カテゴリの特定の特性を含み、その代表的な値およびセル全体の変動性を含む(補足表S1)。例えば、力の中には、細胞骨格全体の引張力、この張力の異方性、最大張力の向き、および接着性細胞1,3,6の挙動に大きな影響を与える細胞-ECM界面のせん断応力があります。
単層の個々の細胞の機械的挙動を調べる新しいアプローチ 単層の個々の細胞は、化学的および機械的性質のシグナルの交換に従事している3。これら2種類の信号は、細胞単層を介して異なる方法で送信される23。しかし、機械的信号伝達の知識は、化学信号伝達の知識に遅れをとっている。この知識のギャップは、細胞の機械的信号を評価するための単純で直感的なアプローチの持続的な欠如と一致します。ここで説明する新しいデータ マッピングアプローチは、このギャップを埋めるために装備されています。このようなマッピングは、細胞の隣接領域における固有の細胞骨格張力の変動が、細胞の形状、大きさ、およびセル18の速度の変化を調節する緩和、流動化、およびアンカー信号として機能することを明らかにする。隣接領域の特性の地図は、サブディビジョン内の細胞が比較的均一な微小環境にさらされ、サブディビジョンの境界にある細胞が著しく不均一な微小環境18にさらされる「多細胞サブディビジョン」パターンを示す。
力測定技術のアクセシビリティ PAAヒドロゲルを作り、ヒドロゲルの変形と細胞運動を分析し、細胞-ECMおよび細胞細胞力を定量化するための様々なプロトコルが存在します1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27,28,29,30,31,32.しかし、これらの開発は、一般的な細胞生物学研究所の手の届かないところに残っており、工学の専門知識を持つ研究室に限定されています。これらのアプローチの技術的側面を自動化し、統一されたユーザーフレンドリーなプラットフォームの下で統合することで、iTACSの目標は、機械的信号の評価を実験細胞生物学の研究と教育における日常的な活動にすることです。
ImageJを使用すると、トレーニングをほとんど必要としないアプローチを使用してアプリケーションを開発できます。iTACS は、コミュニティ主導型の継続的な開発を容易にするために、簡単なスクリプト手法を使用して構築されています。AcTrMの大部分は BeanShell スクリプトを使用してプログラムされ、AnViM の大部分は ImageJ マクロを使用してプログラムされています。これらのスクリプトとユーザーの顕微鏡でこれらの機能を実装するためのガイダンスは、GitHub (<a href="https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS" style="font-size: 14px;" target="_blank">https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS</a>) を通じて入手できます。
取得した画像の品質標準化 接着細胞の物理的な力を定量化する弾性基材ベースの技術は、様々なラボで開発され、実装されていますが、プロトコルはまだ標準化に欠けています。最も標準化が必要な分野の1つは、取得したトップビーズ画像の品質です(補助図S1)。実験を通じて焦点を当てたドリフトから重大な問題が生じます。私たちの新しい参照画像ベースの再焦点化アプローチは、このような焦点を合わせるのが客観的なプロセスになります。AcTrMの最初のステップで定義されたパラメータは、必要な客観的な品質制限を課します。その他の標準化措置は、AcTrMの将来のバージョンでプログラムすることができます。
iTACSの広範な適用性 iTACS構造は、接着細胞の多くの側面を定量化することに加えて、様々な実験的なプロトコルやニーズに対する使用を容易にします。AcTrMはソフトウェアガイドによるユーザーの自己訓練を可能にする。例えば、細胞質カルシウム変動の同時評価によって必要とされる高速イメージングは、現在、ハードウェアの位置変更と再焦点の速度によって制限され、一度に1つの場所で行われるのが最善です。しかし、現在の実装は、実験の全期間にわたってサンプルを顕微鏡ステージに保持することができない、長期イメージング、中断されたイメージングのために十分に装備されています。実験の開始時に参照画像が取得されるため、iTACSは機械的信号のリアルタイムイメージングを可能にし、薬物スクリーニングアプリケーションの新しい道を開きます。AnViMは、ユーザーが素人の言葉で高度な技術情報を提供することができます。広い範囲の細胞特性を定量化し、実験全体を通して追跡する能力は、新しい細胞間通信メカニズムを発見するために必要な重要な機能を構成します。
iTACSの今後の開発のために、(1)データ取得とデータ分析速度の向上、(2)新しいセルラー信号を評価するアプローチの実施、(3)iTACSベースの細胞信号評価に関するワークショップと教育モジュールの開発、(4)低コストの自動化ソリューションの開発の4つの重点分野を特定しました。

一般的に使用される光学イメージングおよびデータ解析ツールは、ほとんど時代遅れであるハードウェアおよびソフトウェア技術を採用しています。電子デバイスの翻訳と進歩の遅れ、計算手法、および一般的な実験細胞生物学ツールへの数学的解析は、細胞生理学の知識の成長ペースに大きな制約を与えています。現在、細胞生物学の研究者は、手の届くところに分子生物学ツールを見つけますが、工学原理に基づくツールは手の届かないところにあります。このような工学原理ベースのツールの1つは、単層応力顕微鏡(MSM)1,2です。MSMは世界中の様々な研究所で適応および研究されていますが、その使用は主に工学の専門知識を持つラボに限定されています3、4,5,6,7,8,9。
NIH-ImageJは、細胞生物学研究者の間で最も人気のあるオープンソースツールの1つです。ユーザーコミュニティの貢献主導の進歩は、その人気の中心となっています11,12。ImageJ には、高度なプログラミング言語と簡略化されたスクリプトアプローチを組み合わせてアプリケーションを開発できる機能があります。これらの機能は、ソフトウェアへの新たな貢献を実装、適応、および進歩するための基本的なプログラミング知識を持つユーザーを容易にします。NIH-ImageJのこれらの特性をベースに、我々は、接着セル11,12全体で多種多様な化学および機械信号の測定を自動化するために、所望のハードウェアおよびソフトウェアツールの低コストの統合を可能にする細胞信号を分析するための統合ツールキット(iTACS)を開発しました。
iTACSは、取得およびトレーニングモジュール(AcTrM)と分析および可視化モジュール(AnViM)の2つのコンポーネントで構成されています。AcTrMは、NIH-ImageJベースの画像取得アプリケーションであるμManagerに基づいて構築されており、ユーザーは従来の光学特性のタイムラプス測定と複数サンプル12の付着細胞の様々な物理的特性を設定できます。AcTrMは、グラフィカルインターフェイスに含まれる簡潔な指示を通じてユーザーのトレーニングを容易にします。さらに、物理力のリアルタイム測定を容易にし、取得したデータの品質標準化を可能にするように設計された、参照画像ベースの自動焦点の新しい機能を備えています。
AnViMは、ImageJプラグイン、迅速なソフトウェア、およびファイル処理スクリプト上に構築されており、細胞の形状、サイズ、向き、速度、動きの方向、細胞外マトリックス(ECM)での牽引力、および隣接する細胞、個々の接着細胞とその近隣地域の収縮とせん断の瞬間を含む50以上のプロパティを定量的に評価することができます。AnViMは、基礎となる技術的背景11を習得することなく、細胞の物理的特性を定量化するユーザーを容易にします。さらに、インタラクティブまたはバッチ処理モードでデータ分析が可能です。空間変動を明らかにするヒートマップと、個々の細胞の特性の時間的変動を示すグラフを生成します。
典型的な実験では、ユーザーは、上面に適切な細胞外マトリックスタンパク質と2種類の埋め込まれた蛍光マーカーを有する弾性ヒドロゲル上の細胞を培養する。基本的に、細胞を培養する前後のこれらの蛍光マーカーの画像は、個々の細胞内および周囲の力を定量化するのに十分です2,13。AnViMはこれらの結果を付着クラスターの個々のセルにマッピングし、洞察力のある画像とグラフを生成します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97%</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
			<td>13822565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98%</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2530850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates</td>
			<td>MatTek or CellVis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde, EM Grade, 25%</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>1909100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1002074706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in preparing suitable hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7222301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rain-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>CovaChem</td>
			<td>102568434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope hardware used in the current study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H117 ProScanTM Stages</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5</td>
			<td>Sutter instrument company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>550372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan III Universal Microscope Automation Controller</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Focus Drive</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence

細胞の力と運動の定量的評価は、過去40年間で大幅に進歩しました。これらの進歩は、細胞培養システムにおける洞察に満ちた機械的シグナル伝達プロセスを調べるフレームワークを提供した。しかし、この分野は現在、取得したデータの品質標準化の欠如、データ分析と可視化における技術的な誤り、そしておそらく最も重要なのは、この技術が一般的な細胞生物学研究所にとってほとんど手の届かないところにあるという3つの問題に直面しています。これらの制限を克服するために、我々は新しい実験プラットフォームを開発しました - 細胞信号を分析するための統合ツールキット(iTACS)。iTACSは、取得およびトレーニングモジュール(AcTrM)と分析および可視化モジュール(AnViM)の2つのコンポーネントで構成されています。AcTrMは、NIH-ImageJベースの顕微鏡制御ソフトウェアであるμManagerに基づいており、一般的な画像取得プロトコルのユーザーセルフトレーニングと自動化を容易にします。AnViMはNIH-ImageJに基づいており、データ分析と洞察に富んだ結果の可視化のユーザーフレンドリーな自動化を容易にします。これらの実験は、ヒドロゲル上の付着細胞の培養、ヒドロゲルに埋め込まれた受託マーカーのイメージング、および最後にこれらの画像から細胞の包括的な機械的特徴付けを抽出することを含む。現在、iTACSは、形態、運動、細胞骨格力、個々の細胞とその周辺領域の蛍光を含む幅広い特性を分析し、追跡することを可能にします。品質標準化の問題は、参照画像誘導再焦点化技術であるAcTrMで取り上げられました。AnViMでは、データ分析の技術的な問題に対処し、多面的な画像セグメンテーション手順、境界条件を特定するためのユーザーフレンドリーなアプローチ、および新しい細胞特性ベースのデータビジュアライゼーションを行いました。AcTrMは、基本的な蛍光顕微鏡を実験用細胞力学リグに簡単に変換できるように設計されており、AnViMは、ユーザーが工学的な背景を必要とせずに細胞の機械的信号を測定できるように装備されています。iTACSは、コミュニティ主導の開発機能を備えたオープンソーススイートとして、研究コミュニティに提供されます。

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Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence

細胞信号を分析する統合ツールキット(iTACS)プラットフォームは、接着細胞内の多種多様な化学および機械的信号を同時に測定するプロセスを自動化します。iTACSは、コミュニティ主導の開発を容易にし、研究者が学歴に関係なくすべてのプラットフォーム機能を使用できるように設計されています。

細胞信号を解析する統合ツールキット:力、運動、形態、蛍光

Quantitative assessment of cellular forces and motion advanced considerably over the last four decades. These advancements provided the framework to ...

接着性細胞は周囲に力を発揮し、それらの力には、緑色で示されている細胞が基質に及ぼす力と、細胞が隣接する力を赤色で示す。これらの力は、単層応力顕微鏡と呼ばれる技術を用いて細胞単層で測定することができる。簡単に言えば、この技術は、上面のすぐ下に小さな蛍光ビーズを含むヒドロゲルと、ガラスに接着された大きな蛍光ビーズを調製することを含みます。このヒドロゲルでは、細胞を見て、合流するか、または力を測定するために望む状態にそれらを培養します。力の測定は、細胞単層をイメージングし、細胞の透過光画像を撮影し、小さなビーズと大きなビーズの蛍光光画像を必要とします。これらの画像のそれぞれは、同じボーカルプレーンで取得されます。これらの画像は、細胞が結合され、ヒドロゲルから切り離されたときに取得されます。そして、これら2つの画像のセットを比較すると、これらすべての力を定量化するために必要なデータが提供されます。そこで、AcTrMとAnViMが遊びに来ます。セルをプレートした後、任意のインスタンスでまったく同じ場所で画像を取得するために、そのプロトコルはAcTrMにプログラムされ、その後、このデータを分析し、結果を可視化するために、AnViMの目的です。次の数分で、合流セル単層の画像を取得するプロセスを見ていきます。アクション ステップ 0 は、取得タイプを選択するように求めるプロンプトを表示します。新しい実験を開始するための新しい買収、または以前の実験を再開するための継続的な買収。[新規取得] をクリックして、職位リストを作成します。アクションステップ1は、次のステップのすべてを一覧表示します。そして、これらのアクションは、ここでステージの位置リストウィンドウで行われます。手動調整のサンプルを視覚化するには、[ライブ イン マイクロ マネージャー] をクリックします。ライブビューでは、フェーズを見てみましょう。ここでは明らかです。さて、ビーズを見る必要があります。ここで、ビーズは蛍光で可視化することができる。だから、トップビーズに適したチャンネルを選択します。また、いくつかのボトムビーズを見ることができることも重要ですので、下部のビーズのチャンネルを見てみましょう。ここで見えるのは下のビーズのぼやけた画像であり、この画像で可能な下のビーズがそこにあることを知ることができる限り、それは完全に問題ありません。位置リストで、[マーク] をクリックします。このようにして、職位リストを作成します。前のビデオで説明した位置リストを作成した後、多次元取得ウィンドウを使用して、手順 2 の手順に従います。長いタイムラプスを実行したいとしましょう。ここでは、撮影したい画像の数を示します。最初のチャネルはフェーズチャネルになります。次のものはトップビーズになり、その後のビーズは下のビーズになるでしょう。多次元取得ウィンドウで閉じる をクリックし、AcTrM ステップ 2 で[OK]をクリックします。出力は、多次元取得ウィンドウで指定されたディレクトリに保存されます。アクションステップ3は、実験が回復を必要とするかどうか尋ねます。答えは通常はイエスになります。ここでiTACSは、洗練された回復を実行したいですか?この最初の部分は、洗練された回復にかなり近づくでしょうが、下の部分は私たちを再配置のより高い精度にさらに近づけるつもりです。限られた視野を使用してリカバリを行う場合は、このオプションが提供されますが、この実験では、このオプションは選択されません。この時点で、一連の参照画像の取得が完了し、Micro-Managerを閉じることができます。画像取得の場合、AcTrMを起動します。拡大率を選択し、データフォルダを含むディレクトリを選択します。プレートの位置を変更する場合は、位置変更に使用するチャネルを選択します。カメラで現在見られるものを保存した画像と一致させるインターフェースが用意されています。重なりが存在する場合、画像は黒と共に赤と緑の色を表示し、手動調整を行うことができます。それ以外の場合は、ヒット受け入れ、および取得が進みます。これでフィジーを始めることができます。MSM ドロップダウン メニューの最初のオプションを選択します。次に、tnimgs フォルダを含むフォルダを選択します。次に、どのチャンネルがどの画像に対応するかを定義する必要があります。この例では、チャンネル0は、細胞の位相コントラスト画像である透過光画像である。下のビーズイメージはチャンネル 2 で、上端のビーズイメージはチャンネル 1 です。そして、細胞が交差する場所と画像のどちら側を横切っているのかを尋ねています。この場合、セルは右端に向かって進む単層であるため、右の選択を解除して続行します。ここでは、単層から遠く離れた上のビーズの小さな領域は、ここに示されているものよりもまばらで大きく見えるボトムビーズ画像と同じ目的を果たします。今では、ビーズが目立つように明るさとコントラストを変更したいかどうかを尋ねています。そこで、メニューのスライダーバーを使用して調整し、ビーズが目立つように表示されたら[OK]をクリックします。そして今、私たちは位置補正を行います。シフトがあれば、それを取り除くでしょう。完了すると、分析フォルダーが作成されます。解析フォルダ内に位置フォルダ P0 が作成され、前のプリプロセスメニューで選択した内容は、交差したエッジ、ピクセルサイズ、位相コントラストなどの選択項目に保存されます。単層応力顕微鏡、または MSM ドロップダウン メニューで、[MSM ゲル変形]を選択します。ここから、ビーズの分布に適したオプションを選択します。データが処理されると、新しい移動フォルダが position フォルダに表示されることがわかります。これは、すべての出力ファイルが格納される場所です。これは、分析が完了したことを示します。細胞-ECM接合と細胞-細胞接合、また単層の個々の細胞の細胞骨格を横切って作用する力を計算する方法を見ていこう。そのためには、3 番目のオプションを選択します。そして、1つはtnimgsと分析フォルダを含むディレクトリを選択することです。選択をヒットし、それはあなたに尋ねるでしょう、このゲルのせん断弾性率は何ですか?せん断弾性率は1250であり、この例ではヒドロゲルの厚さは118ミクロンである。予想されるノイズレベルは、ここで提供されます。次に、平均変位はゼロフラグであり、この場合はチェックされません。OK を選択すると、トラクションを計算する実装は、このバージョンの AnViM で実装される MATLAB 関数を介して実行されます。これで、細胞細胞または細胞骨格力の計算を行う準備ができました。そして、最初に尋ねる質問は、単層はコンフルエントですか?この特定のケースでは、我々は前進する単層を有し、フレームの右側に細胞領域がない。だから答えは、単層がコンフルエントではないということですので、私たちはノーと言うつもりです。次に、最大の非セル オブジェクトの周囲にポリゴンを描画するように求められます。セグメンテーションに適した方法を選択します。ここでは、方法3と4で細胞の色を示すように求めているので、ここでは細胞が黒いので、黒を選択します。これらの異なる方法から生成されるセグメンテーションは、セルの単層にいくつかの穴と、セル領域内のいくつかの白い領域で終了します。ここでは、選択し、自動的にスポットを埋め、ヒット OK.So、すべてのスポットが単層に埋め込まれ、セル領域がありません。そして、次に、セルラー単層の機械的応力を計算します。すでに第1部を実行して、セルのない領域からセルをセグメント化したので、このステップは個々のセルと画像のセグメント化であるパート2から始めます。1つは、個々のセルのセグメンテーションを選択することです。ここで、位置ディレクトリを選択するように求めています。これらのパラメータについては、ここで説明する情報がいくつか存在します。次に、最小の法線セルの周囲にポリゴンを描画するように求められます。したがって、ここで描いたものは面積の計算に使用され、これより小さいものはセルとして定義されないことを規定します。そして次に、最大のセルを求めます。そこで、最大の通常セルの周りにポリゴンを描画し、どちらが明るいかを尋ねます。セルとセルのインターフェースは明るいか、セルの中心が明るいか。だから、この場合、セルとセルのインターフェイスは明るいので、セルとセルのインターフェイスを選択します。これは、計算が完了したことを示します。まず、セルの強度に関するマップを選択します。まず、iTACS は、P0 フォルダとも呼ばれる位置ディレクトリを選択するようにユーザに要求します。完了したら、[選択] をクリックします。次に、ユーザーはiTACSが細胞分裂を検出するか、細胞蛍光を定量化することを望んでいるのかを尋ねられます。この場合、細胞内に蛍光タンパク質が存在しなかったので、細胞分裂の検出を選択します。次のスライドでは、隣接する領域のサイズを定義するユーザーを可能にする、これは、AnViMが、個々のセルのプロパティと隣接する領域のプロパティを調べ、実行するユニークな分析です。ここでは、ユーザーは隣接する領域のセルの幅を選択できます。この場合、60 ピクセルの隣接領域を定義します。最初のチェックボックスは、iTACSにセルのプロパティを収集するかどうかを尋ね、はい、このチェックボックスはiTACSに隣人のプロパティを収集するかどうかを尋ねます。これらのチェック ボックスの下に、各チェック ボックスの詳細をユーザーが望む場合は、iTACS がチェック ボックスの詳細を提供します。これは、分析が完了したことを示します。ここでも、iTACS はユーザに位置ディレクトリの選択を要求します。次に、力データのマッピング、力データの画像の作成、速度データのマッピング、速度データの画像の作成を選択できます。イメージの作成には時間がかかるので、今すぐ作成するか、後で実行するのを待つことができます。そのため、ユーザーには選択肢を選択するオプションが与えられます。ここでは、iTACS は、ユーザーに隣接領域のサイズを再度決定するように要求し、この場合は 60 ピクセルのマッピング強度に対して決定したのと同じサイズを使用できます。また、ユーザーは、セルとその隣接領域のプロパティを収集するように求められます。これは、分析が完了したことを示します。単層応力顕微鏡(MSM ドロップダウン メニュー)で、結果トラック データを選択します。まず、iTACS は、P0 フォルダとも呼ばれる位置ディレクトリを選択するようにユーザに要求します。完了したら、[選択] をクリックします。ここでは、iTACS は、どのフレーム番号から iTACS がデータの追跡を開始することを望むかを尋ねます。フレーム番号 1 の速度を決定できないため、フレーム番号 2 からトラッキングを開始するのは非常に安全です。ここでは、iTACS は同時に満たすプロットの最大数を示すようにユーザーに要求します。そして、基本的に、これはデータ追跡を促進する方法です。完了したら、[OK]をクリックすると、トラッキング中に変数を選択するためのオプションが、ヒート マップを生成するオプションと同様の方法で表示されます。関心のある共通プロパティは、ウィンドウの上部にあるテキスト ボックスに表示されます。ただし、変数をカスタマイズする場合は、テキスト ボックス内のすべてを削除し、以下に示す特定のプロパティを選択するだけです。単層応力顕微鏡(MSM ドロップダウン メニュー)で、結果プロットを選択します。その後、iTACS は、ユーザーがトラックが切れ目のないセルにプロットを制限するかどうかをユーザーに尋ねます。切れ目のないトラックにプロットを制限しない場合は、[いいえ]をクリックしますが、トラックが切れ目のないセルにプロットすることを制限する場合は、[Yes Here iTACS]をクリックして、プログラムにプロットする変数の数を尋ねます。iTACSは最大3つの変数をプロットすることができ、この場合、これらの因子間の関係を確認するために2つの変数のみをプロットします。単層応力顕微鏡(MSM ドロップダウン メニュー)で、結果画像を選択します。ここに位置ディレクトリがあり、完了したら[選択]をクリックします。iTACSは開始フレームを選択するように私たちに求めます。ここでは、フレーム番号 2 を選択しました。ヒート マップを作成するオプションは、個々のセルのタイム トラックをプロットするオプションと同様の方法で表示されます。それで、ヒートマップの作り方を締めくくります。ここで、細胞番号1の細胞細胞の緊張における細胞速度の経時トレースを表す。プロパティは共有縦軸に表示され、横軸は時間インスタンス数を示し、フレームは 15 分間隔で取得されます。2 番目の出力は、実験に 1 時間のヒート マップの配列です。ここに示す特性は、広域、向き、円形性、速度、運動方向、最大張力方向、細胞骨格張力、基質牽引力、および個々の細胞の張力異方性を含む。だから、これは実験の1セットを垣間見ることができます。AnViMとAcTrMがユーザーが実験を再現的に行う手助けをする実験的な状況は他にもいくつかあります。iTACSの主な機能の一部には、実験プロトコルの自動化、自動データ分析、エンジニアリングのバックグラウンドが不要などがあります。

Research

JoVE Journal

Biology

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