Name: integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence
Uploaded: 2022-03-05T15:00:00
Duration: 14 min 55 s
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D.T.T. 실험적인 세포 생물학 연구 필요에 토론을 자극하기 위한 사우스 앨라배마 대학에 폐 생물학 센터와 제휴한 직원에게 감사드립니다. 이러한 논의는 iTACS의 개발을 시화하는 데 결정적인 역할을 했습니다.
이 작품은 국립 보건 원 / 국립 심장 폐 혈액 연구소의 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다, P01 HL66299 및 R37 HL60024 (스티븐스), R01-HL118334 (알바레즈), F32-HL144040-01 (Xu), 아브라함 미첼 암 연구 기금 (싱, 팔란키, 탐베), 연구 및 학술 개발 그랜트 (탐베)

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li><li>Saez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+forces+exerted+by+epithelial+cell+sheets.">Traction forces exerted by epithelial cell sheets.</a> Journal of Physics. 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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

부착 셀은 생존, 성장 및 기능을 위해 기계적 및 화학 신호를 모두 사용합니다. 다양한 현미경 소프트웨어는 형광 기반 이미징을 통해 화학 신호를 평가하는 데 사용자 경험을 최적화합니다. 그러나 기계 신호의 평가에는 표준 현미경 소프트웨어에서 사용할 수 없는 기능이 포함됩니다. 또한 데이터 수집이 데이터 분석과 통합될 때 기계적 신호 평가가 가장 효율적입니다. 기계 신호 평가의 고유한 요구를 충족하는 통합 플랫폼의 부족은 실험 세포 생물학의 주요 기술적 격차였습니다. 셀룰러 신호(iTACS)를 분석하는 통합 툴킷은 이러한 격차를 충족하도록 설계되었습니다. iTACS, AnViM 및 AcTrM의 두 구성 요소는 사용자에게 힘, 모션, 형태, 형광/밝기의 네 가지 광범위한 범주의 셀룰러 특성을 정량화하는 데 필요한 기능을 제공합니다. 이러한 범주에 걸쳐 iTACS는 현재 개별 부착 세포의 50 개 이상의 독특한 측면을 드러낼 수 있습니다. 이러한 양상은 셀 전체의 대표값 및 가변성을 포함하여 각 광범위한 범주의 특정 특성을 포함합니다(보충 표 S1). 예를 들어, 힘 내에서, 세포골격을 가로지르는 인장력이 있고, 이 장력의 이온성, 최대 장력의 방향, 및 셀-ECM 인터페이스 전반에 걸쳐 전단 응력이 있어 신봉세포의 동작에 지대한 영향을 미친다1,3,6.
단층의 개별 세포의 기계적 행동을 검사하는 새로운 접근 법 단층의 개별 세포는 화학및 기계적 성격의 신호교환에 종사한다3. 이러한 두 가지 유형의 신호는 셀룰러 모노레이어를 상이한 방식으로 전달한다23. 그러나, 기계적 신호 전송 지식은 화학 신호 전송의 뒤에 지연. 이 지식 격차는 세포 기계 신호를 평가하기 위한 간단하고 직관적인 접근 방식의 지속적인 부족과 일치합니다. 여기에 설명된 새로운 데이터 매핑 접근 방식은 이 격차를 메울 수 있도록 준비되어 있습니다. 이러한 매핑은 세포의 이웃 영역에서 본질적인 사이토켈레탈 장력의 변동이 셀레칼18의 세포 모양, 크기 및 속도의 변화를 조절하는 휴식, 유동화 및 앵커링 신호역할을 한다는 것을 보여준다. 이웃 영역의 특성의 지도는 세분화 내의 세포가 상대적으로 균일한 미세 환경에 노출되고 세분화의 경계에 있는 세포가 현저하게 부균일한 마이크로환경에 노출되는 "다세포 세분" 패턴을 나타낸다.
힘 측정 기술의 접근성 PAA 하이드로겔을 만들고, 하이드로겔 변형 및 세포 운동을 분석하고, 세포-ECM 및 세포-세포 군력을 정량화하기 위해 다양한 프로토콜이 존재합니다 1,2,7,9,9,14,15,15,21,21,25,25,26,27 ,28,29,30,31,32. 그러나 이러한 발전은 일반적인 세포 생물학 실험실의 손이 닿지 않고 엔지니어링 전문 지식을 갖춘 실험실에 국한되어 있습니다. 이러한 접근법의 기술적 측면을 자동화하고 통합되고 사용자 친화적인 플랫폼으로 통합함으로써 iTACS의 목표는 기계 신호의 평가를 실험세포 생물학 연구 및 교육에서 일상적인 활동으로 만드는 것입니다.
ImageJ를 사용하면 교육이 거의 또는 전혀 필요하지 않은 접근 방식을 사용하여 응용 프로그램을 개발할 수 있습니다11. iTACS는 커뮤니티 중심의 지속적인 개발을 용이하게 하기 위해 간단한 스크립팅 접근 방식을 사용하여 주로 구축되었습니다. 대부분의 AcTrM은 BeanShell 스크립트를 사용하여 프로그래밍되며, 대부분의 AnViM은 ImageJ 매크로를 사용하여 프로그래밍됩니다. 사용자의 현미경에서 이러한 기능을 구현하기 위한 이러한 스크립트 및 지침은 GitHub(<a href="https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS" style="font-size: 14px;" target="_blank">https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS</a>)를 통해 확인할 수 있습니다.
획득한 이미지의 품질 표준화 부착 된 세포에서 물리적 힘을 정량화하는 탄성 기판 기반 기술이 다양한 실험실에서 개발되고 구현되었지만 프로토콜은 여전히 표준화가 부족합니다. 표준화가 가장 필요한 영역 중 하나는 획득한 상단 구슬 이미지의 품질입니다(보충 그림 S1). 실험 전반에 걸쳐 초점드에서 중요한 문제가 발생합니다. 우리의 새로운 참조 이미지 기반 재초점 접근 방식은 객관적인 프로세스를 집중합니다. AcTrM의 첫 번째 단계에서 정의된 매개 변수는 필요한 객관적인 품질 제한을 부과합니다. 다른 표준화 조치는 향후 버전의 AcTrM에서 프로그래밍할 수 있습니다.
iTACS의 광범위한 적용 가능성 iTACS 구조는 부착 된 세포의 다양한 측면을 정량화하는 것 외에도 다양한 실험 프로토콜 및 요구에 대한 사용을 용이하게합니다. AcTrM은 소프트웨어 유도 사용자 셀프 교육을 허용합니다. 예를 들어, 세포질 칼슘 변동의 동시 평가에 의해 요구되는 고속 이미징은 현재 하드웨어의 재배치 및 재집중 속도에 의해 제한되며 한 번에 한 위치에서 수행하는 것이 가장 좋습니다. 그러나, 현재 구현은 실험의 전체 기간 동안 현미경 단계에서 샘플을 유지할 수 없는 장기 이미징, 중단된 이미징을 위해 잘 갖추어져 있다. iTACS는 실험 초기에 참조 영상을 수집하므로 기계적 신호의 실시간 이미징을 가능하게 하여 약물 선별 응용 분야에서 새로운 길을 열어줍니다. AnViM을 사용하면 레이맨의 용어로 고도의 기술 정보를 제공할 수 있습니다. 광범위한 세포 특성을 정량화하고 실험 전반에 걸쳐 추적할 수 있는 능력은 새로운 세포 간 통신 메커니즘을 발견하는 데 필요한 중요한 기능을 구성합니다.
iTACS의 향후 개발을 위해 데이터 수집 및 데이터 분석 속도의 (1) 향상, (2) 새로운 셀룰러 신호 평가 접근 방식의 구현, (3) iTACS 기반 셀룰러 신호 평가에 대한 워크샵 및 교육 모듈 개발, (4) 저비용 자동화 솔루션 개발 의 네 가지 초점 영역을 확인했습니다.

일반적으로 사용되는 광학 이미징 및 데이터 분석 도구는 거의 구식인 하드웨어 및 소프트웨어 기술을 사용합니다. 전자 기기의 발전, 전산 접근법 및 일반적인 실험 세포 생물학 도구로의 수학적 분석의 번역 및 구현지연은 세포 생리학에 대한 지식의 성장 속도에 대한 주요 제약조건입니다. 현재, 세포 생물학 연구원은 손이 닿지 않는 곳에 있는 분자 생물학 공구를 찾아내지만, 기술 원리에 근거를 둔 공구는 손이 닿지 않는 곳에 있습니다. 이러한 엔지니어링 원리 기반 도구 중 하나는 단층 응력 현미경 검사법(MSM)1,2입니다. MSM은 전 세계 다양한 실험실에서 적응하고 연구되었지만, 그 사용은 주로 엔지니어링 전문 지식이있는 실험실에 국한되어 있습니다3,4,5,6,7,8,9.
NIH-ImageJ는 세포 생물학 연구자들 사이에서 가장 인기있는 오픈 소스 도구 중 하나입니다10. 사용자 커뮤니티 기여 중심의 발전은 인기의 중심이었습니다11,12. ImageJ에는 사용자가 고급 프로그래밍 언어와 간소화된 스크립팅 접근 방식을 혼합하여 응용 프로그램을 개발할 수 있는 기능이 있습니다. 이러한 기능을 통해 기본적인 프로그래밍 지식을 가진 사용자가 소프트웨어에 대한 새로운 기여를 구현, 조정 및 발전시킬 수 있습니다. NIH-ImageJ의 이러한 품질을 기반으로 당사는 셀룰러 신호(iTACS)를 분석하기 위한 통합 툴킷을 개발하여 원하는 하드웨어 및 소프트웨어 도구를 저비용 통합하여 부착 셀 11,12에서 다양한 화학 및 기계적 신호의 측정을 자동화할 수 있도록 합니다.
iTACS는 인수 및 교육 모듈(AcTrM) 및 분석 및 시각화 모듈(AnViM)의 두 가지 구성 요소로 구성됩니다. AcTrM은 NIH-ImageJ 기반 이미지 수집 응용 프로그램인 μManager를 기반으로 제작되어 사용자가 기존 광학 특성의 시간 경과 측정과 여러 샘플12에서 부착 셀의 다양한 물리적 특성을 설정할 수 있도록 합니다. AcTrM은 그래픽 인터페이스에 포함된 간결한 방향을 통해 사용자 교육을 용이하게 합니다. 또한, 물리적 힘의 실시간 측정을 용이하게 하고 획득된 데이터의 품질 표준화를 가능하게 하도록 설계된 레퍼런스 이미지 기반 자동 초점 의 새로운 기능을 가지고 있습니다.
AnViM은 ImageJ 플러그인, 신속한 소프트웨어 및 파일 처리 스크립트를 기반으로 하여 셀룰러 모양, 크기, 방향, 속도 및 모션 방향, 세포 외 매트릭스(ECM)에 가해지는 트랙션, 그리고 이웃 세포, 수축 및 주변 셀 과 이웃 영역의 전단 모멘트 등 50개 이상의 특성을 정량적으로 평가할 수 있습니다. AnViM은 사용자가 기본 기술 배경을 마스터하지 않고 셀룰러 물리적 특성을 정량화할 수 있도록 합니다11. 또한 대화형 또는 배치 처리 모드에서 데이터 분석을 수행할 수 있습니다. 개별 셀의 특성의 시간적 변화를 보여주는 공간 변화와 그래프를 보여주는 열 맵을 생성합니다.
일반적인 실험에서, 사용자는 상단 표면에 적절한 세포외 매트릭스 단백질과 두 가지 유형의 임베디드 형광 마커를 가진 탄성 하이드로겔에 세포를 배양한다. 본질적으로, 세포를 배양하기 전과 후에 이 형광 마커의 심상은 개별 세포 2,13의 내과 주위에 힘을 정량화하기에 충분합니다. AnViM은 이러한 결과를 부착 클러스터의 개별 셀에 매핑하고 통찰력 있는 이미지와 그래프를 생성합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97%</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
			<td>13822565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98%</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>2530850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates</td>
			<td>MatTek or CellVis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde, EM Grade, 25%</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>1909100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1002074706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents and components used in preparing suitable hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Bis Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>7222301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rain-X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I Rat Tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>CovaChem</td>
			<td>102568434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope hardware used in the current study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera</td>
			<td>C11440-42U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H117 ProScanTM Stages</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5</td>
			<td>Sutter instrument company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>550372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProScan III Universal Microscope Automation Controller</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stagetop incubator</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>11922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper Motor Focus Drive</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrative toolkit to analyze cellular signals: forces, motion, morphology, and fluorescence

세포력과 운동의 정량적 평가는 지난 4년간 상당히 발전했습니다. 이러한 발전은 세포 배양 시스템에서 통찰력있는 기계적 신호 공정을 검사하는 프레임 워크를 제공했습니다. 그러나, 필드는 현재 세 가지 문제에 직면: 획득 된 데이터의 품질 표준화의 부족, 데이터 분석 및 시각화에 기술적 오류, 그리고 아마도 가장 중요한 것은, 기술은 일반적인 세포 생물학 실험실에 대한 손이 닿지 않는 남아있다. 이러한 한계를 극복하기 위해 셀룰러 신호(iTACS)를 분석하기 위한 통합 툴킷이라는 새로운 실험 플랫폼을 개발했습니다. iTACS는 인수 및 교육 모듈(AcTrM) 및 분석 및 시각화 모듈(AnViM)의 두 가지 구성 요소로 구성됩니다. AcTrM은 NIH-ImageJ 기반 현미경 제어 소프트웨어인 μManager를 기반으로 하며 일반적인 이미지 수집 프로토콜의 사용자 자체 교육 및 자동화를 용이하게 합니다. AnViM은 NIH-ImageJ를 기반으로 하며 데이터 분석의 사용자 친화적인 자동화와 결과의 통찰력 있는 시각화를 용이하게 합니다. 이 실험은 하이드로겔에 부착된 세포, 하이드로겔에 내장된 선적 선량마커를 배양하고, 마지막으로 이러한 이미지에서 세포의 포괄적인 기계적 특성화를 추출하는 것을 포함한다. 현재 iTACS를 통해 사용자는 형태학, 운동, 사이토셀레탈 력 및 개별 세포 및 이웃 영역의 형광을 포함한 다양한 특성을 분석하고 추적할 수 있습니다. 품질 표준화 문제는 AcTrM에서 참조 이미지 유도 재초점 기술인 참조 이미지 유도 로 해결되었습니다. 데이터 분석의 기술적 문제는 다각적인 이미지 세분화 절차, 경계 조건을 식별하는 사용자 친화적 인 접근 방식 및 새로운 셀룰러 속성 기반 데이터 시각화를 통해 AnViM에서 해결되었습니다. AcTrM은 기본 형광 현미경을 실험 세포 역학 장비로 간단하게 변환할 수 있도록 설계되었으며, AnViM은 사용자가 엔지니어링 배경없이 셀룰러 기계 신호를 측정할 수 있도록 장착되어 있습니다. iTACS는 지역 사회 기반 의 개발 기능을 갖춘 오픈 소스 스위트 룸으로 연구 커뮤니티에 사용할 수 있습니다.

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Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals: Forces, Motion, Morphology, and Fluorescence

iTACS(셀룰러 신호)를 분석하는 통합 툴킷은 부착 셀에서 다양한 화학 및 기계적 신호를 동시에 측정하는 과정을 자동화합니다. iTACS는 지역 사회 기반의 개발을 용이하게하고 연구원이 교육 배경에 관계없이 모든 플랫폼 기능을 사용할 수 있도록 설계되었습니다.

세포 신호를 분석하는 통합 툴킷: 힘, 동작, 형태학 및 형광

Quantitative assessment of cellular forces and motion advanced considerably over the last four decades. These advancements provided the framework to ...

부착 된 세포는 주변의 힘을 발휘하고, 그 힘은 녹색으로 여기에 표시된 기판에 발휘하는 세포와 붉은 색으로 표시된 힘 세포가 이웃에 발휘하는 것을 포함한다. 이러한 힘은 단층 응력 현미경 검사법이라는 기술을 사용하여 세포 단층에서 측정될 수 있다. 간단히 말해서, 이 기술은 작은 형광 구슬을 포함하는 하이드로겔과 유리에 붙어있는 큰 형광 구슬을 준비하는 것을 포함합니다.이 하이드로겔에서, 하나는 세포를 보고 결합하거나 어떤 상태 하나가 힘을 측정하고자하는 것을 배양. 힘의 측정은 세포 단층을 이미징하고 세포의 전달된 빛 이미지, 작고 큰 구슬의 형광 광 이미지를 촬영해야합니다. 이러한 각 이미지는 동일한 보컬 평면에서 획득됩니다.이러한 이미지는 셀이 하이드로겔에서 부착되고 분리될 때 획득됩니다. 그리고 이 두 이미지 집합을 비교하면 이러한 모든 힘을 정량화하는 데 필요한 데이터를 제공합니다. 이것이 바로 AcTrM과 AnViM이 플레이하는 곳입니다.셀을 플레이트한 후 원하는 인스턴스에서 동일한 위치에서 이미지를 수집한 다음 해당 프로토콜이 AcTrM으로 프로그래밍된 다음 이 데이터를 분석하고 결과를 시각화하기 위해 AnViM의 목적입니다. 다음 몇 분 안에, 우리는 합류 세포 단층에 대한 이미지를 획득하는 과정을 안내할 것입니다. 작업 단계 0은 사용자가 획득 유형을 선택하라는 메시지를 표시합니다.새로운 실험을 시작하기 위한 새로운 인수 또는 이전 실험을 재개하기 위한 지속적인 인수. 새로 수집을 클릭하여 위치 목록을 만듭니다. 작업 단계 1에는 다음 단계의 모든 단계가 나열됩니다.그리고 이러한 작업은 여기에 단계 위치 목록 창에서 수행됩니다. 마이크로 관리자에서 라이브를 클릭하여 수동으로 조정할 샘플을 시각화합니다. 라이브 뷰에서, 우리는 단계를 볼 수 있습니다.여기에 분명하다. 이제 구슬을 보아야 합니다. 여기서, 구슬은 형광으로 시각화될 수 있다.따라서 상단 구슬에 적합한 채널을 선택합니다. 또한 몇 가지 하단 구슬을 볼 수 있는 것이 중요 하므로 하단 구슬에 대 한 채널을 살펴보겠습니다. 여기서 보는 것은 아래 구슬의 흐릿한 이미지이며, 하단 구슬이 있다는 것을 알 수 있는 한 이 이미지에서 볼 수 있는 것은 완전히 괜찮습니다.위치 목록을 클릭합니다. 위치 목록을 만드는 방법입니다. 이전 비디오에서 설명한 위치 목록을 만든 후 다차원 획득 창을 사용하여 2단계에서 나열된 단계를 따릅니다.우리가 오랜 시간 경과를 수행 할 것을 가정 해 봅시다. 여기, 나는 우리가 촬영하려는 이미지의 수를 나타낼 거야. 첫 번째 채널은 위상 채널이 될 것입니다.다음 하나는 상단 구슬의 될 것입니다 그리고 그 후 하나는 하단 구슬 될 것입니다. 다차원 획득 창에서 닫을 클릭하고 AcTrM 2 단계에서 확인을 클릭합니다. 출력은 다차원 획득 창에서 식별된 디렉터리에 저장됩니다.작업 단계 3실험에 복구가 필요한지 묻습니다. 대답은 일반적으로 '예'입니다. 여기에 iTACS는 우리가 세련된 복구를 수행 할 수 있습니까?이 첫 번째 부분은 정제 된 회복에 매우 가까워질 것이지만, 하단 부분은 재배치의 더 높은 정확도에 더 가까워질 것입니다. 제한된 시야를 사용하여 복구가 수행될 경우 이 옵션이 제공되지만 이 실험에서는 해당 옵션을 선택하지 않습니다. 이 시점에서 참조 이미지 집합의 수집이 완료되고 마이크로 관리자를 닫을 수 있습니다.이미지 수집의 경우 AcTrM이 시작됩니다. 배율을 선택하고 데이터 폴더가 포함된 디렉터리를 선택합니다. 위치를 지정하는 데 사용되는 채널과 함께 플레이트 위치를 재배치하기 위한 선택 사항을 선택합니다.현재 카메라에서 볼 수 있는 것과 저장된 이미지와 일치하는 인터페이스가 제공됩니다. 겹치면 이미지가 검은색과 함께 빨간색과 녹색색을 표시하고 수동 조정을 수행할 수 있습니다. 그렇지 않으면, 히트 수락, 그리고 인수가 진행됩니다.이제 피지를 시작할 수 있습니다. 사전 처리라는 MSM 드롭다운 메뉴에서 첫 번째 옵션을 선택합니다. 그런 다음 tnimgs 폴더를 포함하는 폴더를 선택합니다.다음으로 어떤 채널이 어떤 이미지와 일치하는지 정의해야 합니다. 이 예에서, 채널 0은 세포의 위상 대비 영상인 전송된 광 화상이다. 하단 비드 이미지는 채널 2이고 상단 비드 이미지는 채널 1입니다.그리고, 그것은 세포가 교차하는 곳과 이미지의 어느 면을 묻는 것입니다. 이 경우 셀은 오른쪽 가장자리를 향해 전진하는 단층이므로 오른쪽을 선택 해제하고 계속합니다. 모노레이어에서 멀리 떨어진 상단 구슬의 작은 영역은 여기에 표시된 것보다 희소하고 더 큰 것처럼 보이는 하단 구슬 이미지와 동일한 목적을 제공합니다.이제 비드가 눈에 띄게 보이도록 밝기와 대비를 바꿀 것인지 묻습니다. 따라서 메뉴의 슬라이더 막대를 사용하여 조정하고 구슬이 눈에 띄게 나타나면 확인을 클릭합니다. 그리고 지금, 우리는 위치 수정을 할 수 있습니다. 어떤 변화가있는 경우, 그것은 그것을 제거합니다.그리고 완료되면 분석 폴더를 만듭니다. 분석 폴더 내에서 위치 폴더, P0을 만들고 이전 전처리 메뉴에서 선택한 항목이 교차된 모서리, 픽셀 크기 및 위상 대비 및 기타 이미지와 같은 분석 선택에 저장됩니다. 단층 응력 현미경 검사법 또는 MSM 드롭다운 메뉴에서 MSM 젤 변형을 선택합니다.여기에서 비드 배포에 적합한 옵션을 선택합니다. 데이터가 처리되고 있으므로 위치 폴더에 새 변위 폴더가 나타난 것을 볼 수 있습니다. 이것은 모든 출력 파일이 저장되는 곳입니다.이는 분석이 완료했음을 나타냅니다. 우리는 세포-ECM 접합 및 세포 세포 접합및 또한 단층의 개별 세포의 세포 골격을 통해 발휘되는 힘을 계산하는 방법을 살펴볼 것입니다. 이를 위해 세 번째 옵션을 선택합니다.그리고 하나는 tnimgs와 분석 폴더를 포함하는 디렉토리를 선택할 것입니다, 이는 하나는 이러한 디렉터리 대신 예제 디렉터리를 선택한다는 것을 의미합니다. 히트 선택, 그것은 당신을 물어 볼 것이다, 이 젤의 전단 계수는 무엇입니까? 전단 계수는 1250이며 이 예에서 하이드로겔의 두께는 118 미크론이다.예상 소음 수준은 여기에서 제공됩니다. 그런 다음 변위가 0 플래그라는 의미가 있으며 이 경우 확인되지 않습니다. 확인을 선택하고 견인력을 계산하는 구현은 이 버전의 AnViM에서 구현되는 방법입니다.이제 세포 세포 또는 사이토셀레탈 힘에 대한 계산을 할 준비가 되었습니다. 그리고 첫 번째 질문은 단층 이면에 있는 것입니까? 이 특별한 경우에, 우리는 전진 단층이 있고 프레임의 오른쪽에 있는 셀 영역이 없습니다.그래서 대답은 단층이 혼잡하지 않다는 것입니다, 그래서 우리는 아니오를 말할 것입니다. 이제 가장 큰 비셀 개체 주위에 다각형을 그려야 합니다. 우리는 세분화에 적합한 방법을 선택합니다.여기서는 3번과 4번 의 방법으로 세포의 색을 표시해 달라고 요청하고 있으므로, 여기서 세포는 검은색이므로 검은색을 선택하게 됩니다. 이러한 다른 방법에서 생성되는 분할은 셀 단층및 셀 영역이 없는 일부 흰색 영역에 있는 일부 구멍으로 끝납니다. 여기에서 우리는 선택하고 반점을 자동으로 채우고 OK.So 모든 반점이 단층과 셀 영역으로 채워지지 않습니다.그런 다음 셀룰러 모노레이어에서 기계적 응력을 계산합니다. 우리는 이미 세포 영역이 없는 세포 영역에서 세포를 분할한 1부를 수행했기 때문에 개별 세포와 이미지의 분할인 2부로 이 단계를 시작합니다. 하나는 개별 셀에 대한 세분화를 선택할 것입니다.그리고 여기에 위치 디렉토리를 선택하도록 요청하고 있습니다. 그리고 이러한 매개 변수에 대한 몇 가지 더 많은 정보가 여기에 제공됩니다. 그런 다음 가장 작은 정상 셀 주위에 다각형을 그려 달라고 요청합니다.따라서 여기에 그리는 것은 영역을 계산하는 데 사용되며 이보다 작은 것은 셀로 정의되지 않는다고 규정할 것입니다. 그리고 다음으로 가장 큰 세포를 요구합니다. 그래서 우리는 가장 큰 정상 셀 주위에 다각형을 그립니다, 그리고 어느 것이 더 밝습니까?세포-세포 인터페이스가 더 밝습니까, 아니면 세포 중심이 더 밝습니까? 따라서 이 경우 셀 셀 인터페이스가 밝기 때문에 셀 셀 인터페이스를 선택합니다. 따라서 계산이 완료되었음을 나타냅니다.먼저 셀 강도에 대한 맵을 선택해 보겠습니다. 먼저 iTACS는 사용자에게 P0 폴더라고도 하는 위치 디렉토리를 선택하도록 요청합니다. 완료되면 선택 선택을 클릭합니다.그런 다음 사용자는 iTACS가 세포 분열을 감지하거나 세포 형광을 정량화하기를 원하는지 묻습니다. 이 경우, 우리는 세포 내부에 형광 단백질이 없기 때문에 세포 분열을 감지하기로 선택합니다. 다음 슬라이드를 사용하면 사용자가 인접 영역의 크기를 정의할 수 있으며, 이는 AnViM이 개별 셀의 특성뿐만 아니라 이웃 영역의 특성을 보는 곳에서 수행하는 고유한 분석입니다.여기서 사용자는 인접한 셀 영역의 폭을 선택할 수 있습니다. 이 경우 60픽셀로 인접 영역을 정의합니다. 첫 번째 확인란은 iTACS가 세포의 특성을 수집할 것인지 묻고, 그래, 이 확인란은 iTACS가 이웃의 속성을 수집할 것인지 묻습니다.이러한 확인란 아래에 iTACS는 사용자가 각 확인란에 대한 자세한 내용을 원하는 경우 확인란에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 이는 분석이 완료했음을 나타냅니다. 다시 말하지만 iTACS는 사용자에게 위치 디렉터리를 선택하도록 요청합니다.그런 다음 사용자는 힘 데이터를 매핑하고, 힘 데이터의 이미지를 만들고, 속도 데이터를 매핑하고, 속도 데이터의 이미지를 만들 수 있습니다. 이미지를 만드는 데는 시간이 걸리므로 지금 이미지를 선택하거나 나중에 기다릴 수 있습니다. 따라서 사용자에게 선택 사항을 선택하거나 선택할 수 있는 옵션이 제공됩니다.여기서 iTACS는 사용자에게 인접 영역의 크기를 다시 결정하도록 요청하며, 당사의 경우 60픽셀인 텐즈를 매핑하기 위해 결정한 것과 동일한 크기를 사용할 수 있습니다. 그리고 다시, 사용자는 셀뿐만 아니라 이웃 지역의 속성을 수집하도록 요청받습니다. 이는 분석이 완료했음을 나타냅니다.단층 응력 현미경 검사법 또는 MSM 드롭다운 메뉴에서 결과를 추적하는 데이터를 선택합니다. 먼저 iTACS는 사용자에게 P0 폴더라고도 하는 위치 디렉토리를 선택하도록 요청합니다. 완료되면 선택 선택을 클릭합니다.여기서 iTACS는 사용자가 iTACS에서 데이터 추적을 시작하기를 원하는 프레임 번호를 묻습니다. 프레임 번호 2에서 추적을 시작하는 것은 매우 안전합니다. 여기서 iTACS는 사용자에게 동시에 채울 최대 플롯 수를 표시하도록 요청합니다.그리고 본질적으로, 이것은 데이터 추적을 신속하게 하는 방법입니다. 완료되면 확인을 클릭하고 추적 중에 변수를 선택하는 옵션은 히트 맵생성 옵션과 유사한 방식으로 표시됩니다. 공통 관심 속성은 창 상단의 텍스트 상자에 제공됩니다.그러나 변수를 사용자 지정하려면 텍스트 상자의 모든 항목을 삭제하고 아래에 나열된 특정 속성을 선택하기만 하면 됩니다. 단층 응력 현미경 검사법 또는 MSM 드롭다운 메뉴에서 결과 플롯을 선택합니다. 그 후 iTACS는 사용자가 끊어지지 않은 트랙이 있는 셀로 플롯을 제한하려는지 사용자에게 묻습니다.플롯을 끊지 않은 트랙으로 제한하지 않으려면 아니요.하지만 끊어지지 않은 트랙이 있는 셀에 플롯을 제한하려면 예 여기 iTACS를 클릭하여 사용자가 프로그램을 플롯할 변수 수를 묻습니다. iTACS는 최대 3개의 변수를 플로팅할 수 있으며, 이 경우 두 변수만 플롯하여 이러한 요소 간의 관계를 확인할 수 있습니다. 단층 응력 현미경 검사법 또는 MSM 드롭다운 메뉴에서 결과 그림을 선택합니다.위치 디렉토리가 있고 완료되면 선택 선택을 클릭합니다. iTACS는 시작 프레임을 선택하도록 요청합니다. 여기서, 우리는 프레임 번호 2를 선택했습니다.히트 맵을 만드는 옵션은 개별 셀의 시간 트랙을 플로팅하는 옵션과 유사한 방식으로 제공됩니다. 그것으로, 우리는 열지도를 만드는 방법을 결론을 내립니다. 여기서 세포 수1에 대한 세포골격 긴장의 세포 속도의 시간 추적을 나타냅니다.속성은 공유 수직 축에 표시되고 가로 축은 프레임이 15분 간격으로 획득되는 시간 인스턴스 번호를 나타냅니다. 두 번째 출력은 실험에 1시간 동안 열맵배열입니다. 여기에 표시된 특성에는 스프레드 영역, 방향, 원형, 속도, 움직임 방향, 최대 장력 방향, 세포골격 긴장, 기판 견인 및 개별 세포의 장력 성 역방향이 포함됩니다.그래서 이것은 실험의 한 세트를 엿볼 수 있습니다. AnViM 및 AcTrM이 사용자가 실험을 재현적으로 수행하는 데 도움이 될 수 있으며 이러한 연락처가 원고에 나열되는 몇 가지 다른 실험 상황이 있습니다. iTACS의 주요 기능 중 일부는 실험 프로토콜의 자동화, 자동화된 데이터 분석 및 엔지니어링 배경이 필요하지 않습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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연구

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